姚 健， 吁 安， 龍 云， 桂 倫， 陳莎莎， 沈愛喜， 康美花*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)應用微生物研究所，江西 南昌 330200;2.江西省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，江西 南昌 330200)

作為半纖維素的主要組成成分之一，木聚糖在自然界中分布十分廣泛。例如在農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯、麥麩、米糠、秸稈及甘蔗渣中木聚糖的含量非常高，僅次于纖維素[1-2]。木聚糖的結構極其復雜，含有不同的取代基，但其主鏈是由 β-1,4-糖苷鍵連接β-D-吡喃型木糖構成[3]。木聚糖的降解需要多種不同的酶共同參與，包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.3.1.37)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)等[4]。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶是半纖維素降解過程中關鍵酶之一[5-6]，其應用非常廣泛，在制漿造紙[7-12]、食品[13-14]、飼料添加劑[15-16]及生物轉化[17-19]等方面都起重要作用。木聚糖酶在自然界中分布廣泛，在微生物、藻類、植物組織、甲殼動物以及無脊椎動物中均有發(fā)現(xiàn)[20]。迄今為止，微生物源的木聚糖酶如鏈霉菌屬(Streptomyces)[18]、芽胞桿菌屬(Bacillus)[12]、毛殼菌屬(Chaetomium)[6]、木霉屬(Trichoderma)及曲霉屬(Aspergillus)等[20]研究得較為深入。目前，木聚糖酶的研究主要側重于木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選及選育[21-22]、發(fā)酵條件的優(yōu)化[23-24]，木聚糖酶基因的克隆及工程菌的構建[25-26]等方面。盡管已經(jīng)從不同的環(huán)境中篩選到了大量的木聚糖酶生產(chǎn)菌株，但不同的環(huán)境對酶的使用要求不同，因此開發(fā)適用于不同用途的木聚糖酶仍有必要。由于剛果紅染色法存在著操作繁雜、菌株間易混雜以及假陽性的問題，為此本研究利用雙層平板法，以Azo-xylan為底物從堆肥中篩選到了可降解木聚糖的菌株，并對該菌株進行分子鑒定及產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化，同時對木聚糖酶的酶學性質進行了初步研究，為今后構建木聚糖酶工程菌及利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)低聚木糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 樣品來源于豬糞與甘蔗葉混合發(fā)酵的堆肥，其發(fā)酵時間為3 d，溫度為40 ℃，初始C/N 比和pH值分別為25∶1和8.0，含水率為60%[21]。

1.1.2 培養(yǎng)基 生長培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖10，NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂粉15，H2O定容至1 L，115 ℃滅菌25 min；篩選培養(yǎng)基(g/L)：瓊脂粉10，Azo-xylan 200 mL，NaH2PO4-Na2HPO4buffer(0.02 mol/L，pH值8.0)定容至1 L；產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，甘蔗葉12(過60目篩)，pH值 7.0，H2O定容至1 L， 121 ℃滅菌25 min[21]。

1.1.3 主要試劑及儀器設備 基因組提取試劑盒(TianGen)；Azo-xylan(Birchwood，Megazyme)。離心機(Eppendorf 5804R，德國)；酶標儀(Spectra MAX190，美國)；電泳儀(DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司)；高壓滅菌鍋(Hirayama HVA-85，日本)；梯度PCR儀(S1000TM，Bio-rad，德國)。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 取樣品溶于無菌水，梯度稀釋，涂布于生長培養(yǎng)基，35 ℃倒置培養(yǎng)4 d，加篩選培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 d，加2 mL乙醇(95%)，放置5～10 min，挑取有水解圈的菌落，劃線培養(yǎng)獲得單一菌株[21]。

1.2.2 菌株鑒定 利用基因組試劑盒提取細菌基因組DNA。以細菌基因組DNA為模板，PCR擴增其16S rDNA：25 μL體系，12.5 μL PrimerSTAR Max(2×)，0.5 μL模板基因組DNA，引物(5′-AAATTTTTTTTCCCCCCCGG-3′)和(3′-GGGCCCCCTTTAAAAAAAAAC-5′)各0.5 μL(10 μmol/L)，11 μL 無菌水；PCR擴增：98 ℃，4 min；98 ℃，15 s；55 ℃，15 s；72 ℃，30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 木聚糖酶活性測定 取100 μL發(fā)酵液，加入100 μL 1% Azo-xylan，40 ℃放置10 min，8 000 r/min離心5 min，加入500 μL 95%乙醇，室溫放置5 min后測吸光值(590 nm)。

1.2.4 發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化 挑取已純化好的菌株，接種至生長培養(yǎng)基中160 r/min、35 ℃過夜培養(yǎng)。①氮源優(yōu)化: 選取0.2%(質量分數(shù))的酵母提取物、NaNO3、(NH4)2SO4、牛肉膏和蛋白胨作為唯一氮源，160 r/min、40 ℃培養(yǎng)5 d，按1.2.3方法測酶活性。②碳源優(yōu)化: 玉米芯、甘蔗葉、稻草和麥麩作為唯一碳源，40 ℃、160 r/min 震蕩培養(yǎng)5 d，按1.2.3方法測酶活性。③不同甘蔗葉濃度對木聚糖酶活性的影響：稱取甘蔗葉使其終濃度分別為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%(質量分數(shù))，然后將培養(yǎng)基pH值調整為7.0，40 ℃、160 r/min培養(yǎng)5 d，按1.2.3方法測酶活性。④溫度選擇：在25～45 ℃之間每隔5 ℃選取一個點作為培養(yǎng)溫度，5 d后按1.2.3方法測酶活性。⑤pH選擇：選取6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0分別作為菌株培養(yǎng)的初始pH，40 ℃培養(yǎng)5 d，按1.2.3方法測酶活性。⑥培養(yǎng)時間優(yōu)化：在氮源、碳源及濃度、溫度和初始pH最優(yōu)基礎上，每隔24 h取樣，按1.2.3方法測酶活性。

1.2.5 木聚糖酶酶學性質分析 ①最適反應溫度：100 μL發(fā)酵液中加入100 μL 1% Azo-xylan，分別在30～65 ℃的條件下水浴10 min，然后按1.2.3方法檢測其最適反應溫度(最高酶活性記為100%)。②最適反應pH：調整發(fā)酵液pH值分別至6.0～8.0(0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4buffer)、7.5～9.0(0.1 mol/L Tris-HCl buffer)、8.5～10.0(0.1 mol/L glycine-NaOH buffer)，加入相同體積的1% Azo-xylan，55 ℃水浴10 min，然后按1.2.3方法檢測其最適反應pH(最高酶活性記為100%)。③溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性：在55 ℃及pH值 8.0條件下，通過測定發(fā)酵液分別在30～75 ℃下水浴3 h后的剩余酶活性來明確溫度穩(wěn)定性；通過測定發(fā)酵液在pH值 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0條件下放置30 min(在55 ℃及pH值 8.0條件下)的剩余酶活性，確定pH穩(wěn)定性。4 ℃條件下保存的發(fā)酵液酶活性定義為100%。④金屬離子對酶活性的影響：取47.5 μL發(fā)酵液，分別加入2.5 μL 0.1 mol/L的金屬離子(Ca2+、Fe2+、Mg2+、 Mn2+、Zn2+、Cu2+和Na+)，室溫放置30 min，55 ℃及pH值 8.0條件下測剩余酶活性；取45 μL粗酶液，分別加入5 μL 0.1 mol/L上述金屬離子，室溫放置30 min，55 ℃及pH值 8.0條件下測其剩余酶活性，以未加金屬離子的酶活性定義為100%；⑤發(fā)酵液對玉米芯的降解：a.發(fā)酵液對玉米芯木聚糖的降解：稱取1.5 g玉米芯，加入30 mL 15%的NaOH，80 ℃水浴90 min，調節(jié)pH至5.0，過濾，所得沉淀(即為玉米芯木聚糖)放入培養(yǎng)皿中烘干過夜，稱重并記錄；稱取0.05 g玉米芯木聚糖，加入1.0 mL發(fā)酵液，55 ℃條件下放置6 h后，取200 μL 反應液，加入200 μL DNS，沸水浴10 min，分光光度計520 nm檢測吸光值；b.發(fā)酵液對玉米芯的降解：稱取玉米芯(150目過篩)0.05 g，加入1.0 mL的發(fā)酵液，55 ℃條件下放置6 h，取200 μL 反應液，加入200 μL DNS，沸水浴10 min，分光光度計520 nm檢測吸光值。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

以Azo-xylan為底物進行木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選，結果如圖1A所示，木聚糖酶生產(chǎn)菌會生成明顯的透明圈。挑取酶活性較大的菌株再次培養(yǎng)進行驗證，結果如圖1B所示，菌落周邊發(fā)現(xiàn)有明顯的水解現(xiàn)象。

圖1 木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選Fig.1 Screening of xylanase producing strainsA：菌株分離；B：菌株純化A：Isolation of bacteria;B:Purification of bacteria

2.2 菌株鑒定

以篩選到的菌株基因組DNA作為模板，PCR擴增得到該菌株的16S rRNA，經(jīng)測序顯示該片段長度為1 338 bp。將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)糖絲菌屬(Saccharothrix)與該菌株具有最高的同源性(99%)。系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果顯示該菌株與Saccharothrixvariisporea進化距離最近，同源性為99.33%(圖2)，故將該菌株初步定義為Saccharothrixvariisporea，命名為SaccharothrixvariisporeaYJ(保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號：60442)。

圖2 基于16S rRNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA

2.3 木聚糖酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 氮源和碳源優(yōu)化 選用酵母提取物、NaNO3、(NH4)2SO4、牛肉膏和蛋白胨五種物質作為氮源，從中優(yōu)選氮源。結果表明酵母提取物和(NH4)2SO4作為氮源的培養(yǎng)基中所產(chǎn)木聚糖酶活性最高，其次為NaNO3和牛肉膏，蛋白胨相對最低，僅為最高酶活性的54.3%(圖3A)；在微生物生長代謝過程中，碳源作為主要能量來維持細胞生命活動。大多數(shù)微生物生產(chǎn)的木聚糖酶是復合酶，也是誘導酶，其誘導底物多為半纖維素及其類似物，而不同底物對木聚糖酶的誘導水平存在差異性。為此，選用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯、甘蔗葉、稻草和麥麩作為原料研究其最適合碳源。結果顯示不同的碳源對SaccharothrixvariisporeaYJ生產(chǎn)木聚糖酶的酶活性存在著明顯差異，甘蔗葉作為碳源的培養(yǎng)基中木聚糖酶活性最高，玉米芯最低，僅為最高值的43.1%(圖3B)。這可能是由于該菌株來源于甘蔗葉堆肥發(fā)酵物，對甘蔗葉作為碳源的適應性較高，因此甘蔗葉作為碳源時該菌株產(chǎn)生的木聚糖酶活性最高。其次，培養(yǎng)基中碳源濃度對菌株產(chǎn)讓木聚糖酶也有一定的影響，進一步對甘蔗葉的添加量進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)甘蔗葉為1.2%(質量分數(shù))時，發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性最高；2.0%時酶活性較低，為最高酶活性的78.5%，培養(yǎng)基中甘蔗葉為0.2%～0.8%，其發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性略低于最高值(圖3C)。因此選用1.2%(質量分數(shù))的甘蔗葉作為木聚糖酶最適發(fā)酵碳源。

2.3.2 發(fā)酵pH、溫度及時間對酶活性的影響 如圖3D所示，初始pH值為7.0時，發(fā)酵液木聚糖酶酶活性最高，pH值為 6.6～7.0時，發(fā)酵液酶活性均高于最高酶活性的90%；而pH值高于7.0，酶活性隨pH的升高而迅速降低，pH值為 9.0時，僅為最高值的51.2%。此外，培養(yǎng)溫度及時間對酶活性也有影響，40 ℃時，木聚糖酶酶活性最高，隨著培養(yǎng)溫度的升高酶活性迅速降低(圖3E)。選擇1、2、3、4、5、6 d確定最適宜發(fā)酵時間。研究結果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，木聚糖酶酶活性先迅速升高再趨于平穩(wěn)，培養(yǎng)2 d時，其酶活性迅速升高并在5 d后達到最高值，其后發(fā)酵液酶活性緩慢降低(圖3E)。綜上所述，該菌株發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵條件為酵母提取物或(NH4)2SO4為氮源(0.2%)(質量分數(shù))、甘蔗葉為碳源(1.2%)(質量分數(shù))、初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度為40 ℃，培養(yǎng)時間為5 d。

圖3 發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of fermentation conditionsAA：氮源優(yōu)化；B：碳源優(yōu)化；C：碳源濃度優(yōu)化(質量分數(shù))；D：初始pH優(yōu)化；E：發(fā)酵溫度優(yōu)化(℃)；F：發(fā)酵時間優(yōu)化A：Optimization of nitrogen sources;B:Optimization of carbon sources;C:Optimization of carbon source concentration(w/v);D:Optimization of initial pH;E:Optimization of fermentation temperature(℃);F:Optimization of fermentation time

2.4 木聚糖酶的酶學性質分析

2.4.1 最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性 通過測定在30～65 ℃條件下發(fā)酵液中木聚糖酶的活性，來確定其最適反應溫度。圖4A顯示，在檢測范圍內(nèi)，發(fā)酵液中木聚糖酶的酶活性呈現(xiàn)先升高后降低，55 ℃時達到最高值。對發(fā)酵液中木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，該酶在溫度低于或等于55 ℃時，其酶活性沒有明顯的變化，具有很高的穩(wěn)定性，但當溫度升高至65 ℃時，其穩(wěn)定性急劇下降，3 h后酶活性基本喪失(圖4B)。

圖4 溫度對酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on xylanase activity A：最適反應溫度；B：溫度穩(wěn)定性A：Optimal reaction temperature;B:Temperature stability

2.4.2 最適反應pH及pH穩(wěn)定性 在pH值 6.5～10.0之間測發(fā)酵液中的酶活性，結果顯示當pH值為 6.5～9.5時發(fā)酵液中的木聚糖酶保持較高的酶活性。pH值 8.0時達到最大值，隨著pH值的升高酶活性迅速降低(圖5A)。對發(fā)酵液中木聚糖酶的pH穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶活性在pH值 4.0～10.0的范圍內(nèi)均保有較高的穩(wěn)定性，處理30 min后，酶活性仍在90%以上(圖5B)。

圖5 pH對酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on xylanase activity A：最適應反應pH;B:pH穩(wěn)定性A:Optimal reaction pH;B:pH stability

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響 金屬離子對酶的生物活性有著重要的影響。分別在發(fā)酵液中添加終濃度為0.005 mol/L和0.01 mmol/L的Ca2+、Fe2+、Mg2+、 Mn2+、Zn2+、Cu2+和Na+等金屬離子，發(fā)現(xiàn)Na+能有效提高木聚糖酶活性，0.01 mol/L Na+使木聚糖酶活性提高了0.2倍，Mg2+和Mn2+對木聚糖酶活性沒有明顯的影響，Ca2+、Fe2+和Cu2+明顯抑制木聚糖酶活性，Cu2+對木聚糖酶活性抑制最強(其酶活性僅為原來的6%左右)，其次為Fe2+和Ca2+(圖6)。

圖6 金屬離子對酶活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on enzyme activity

2.4.4 木聚糖酶對玉米芯的降解 經(jīng)堿性溶液處理后，1.5 g玉米芯可得到0.1 g玉米芯木聚糖；0.05 g玉米芯木聚糖經(jīng)發(fā)酵液中木聚糖酶處理6 h，得到1.33 mg還原糖，即1.5 g玉米芯中還原糖的得率為0.177%。另外，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中木聚糖酶可以直接對玉米芯(150目)進行降解，0.05 g玉米芯經(jīng)6 h處理，能夠獲得0.88 mg的還原糖(得率為1.76%)，其得率是經(jīng)過堿提取處理玉米芯獲取還原糖的10倍。

3 討 論

在農(nóng)業(yè)種植及生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢棄物，農(nóng)作物秸稈作為主要副產(chǎn)物，其產(chǎn)量巨大。據(jù)統(tǒng)計2019年全國主要農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達861萬t[27]，其中大部分秸稈被焚燒或者隨意丟棄，不僅造成資源浪費，還會造成環(huán)境污染[28]。農(nóng)作物秸稈中含有大量的纖維素、半纖維素及木質素等纖維素類物質，此類物質是影響農(nóng)作物秸稈有效利用的主要因素。木聚糖是半纖維素的主要組成部分，介于纖維素和木質素之間，維持纖維抱合力和細胞壁結構的完整性，所以木聚糖酶對木質纖維素的降解有至關重要的作用[29]。半纖維素預處理的方法主要有化學法、物理法和生物法。其中物理法和化學法不僅能耗高，還會對環(huán)境造成不同程度的污染[27]；而生物法具有能耗低、環(huán)境友好等特點受到廣大科研工作者的關注，從不同環(huán)境中獲得了一些降解半纖維素能力較強的菌株。剛果紅染色法是篩選木聚糖酶生產(chǎn)菌株的主要方法，但剛果紅染色法存在操作繁瑣及假陽性問題，增加了菌株篩選的工作量。本研究以Azo-xylan作為篩選底物，利用雙層平板篩選木聚糖酶生產(chǎn)菌株，操作簡單省時，也可以避免假陽性的出現(xiàn)。本研究利用該方法成功地從豬糞與甘蔗葉混合堆肥中篩選到一株木聚糖酶生產(chǎn)菌株，經(jīng)16S rDNA測序鑒定初步將該菌株鑒定為Saccharothrixvariisporea，并命名為SaccharothrixvariisporeaYJ。其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究發(fā)現(xiàn)，酵母提取物或(NH4)2SO4作為氮源，初始pH為7.0，40 ℃培養(yǎng)5 d，其木聚糖酶活性最高。該結果與何敏超等和曹慧等的研究結果略有不同。何敏超等[30]研究發(fā)現(xiàn)(NH4)2SO4作為氮源，黑曲霉SM24/a木聚糖酶酶活性最高，而酵母粉作為氮源時木聚糖酶酶活性最低，發(fā)酵初始pH值為5.0時，木聚糖酶活性最高；曹慧等[29]研究發(fā)現(xiàn)Neurosporacrassa產(chǎn)木聚糖酶的最適發(fā)酵溫度為33 ℃，初始pH值為8.0。酶學性質研究發(fā)現(xiàn)SaccharothrixvariisporeaYJ木聚糖酶的最適反應溫度為55 ℃，高于黑曲霉SM24/a木聚糖酶(37 ℃)[30]和Neurosporacrassa木聚糖酶(50 ℃)的最適反應溫度[29]。在不高于55 ℃和pH值 4.0～10.0的范圍時，SaccharothrixvariisporeaYJ木聚糖酶保持很高的穩(wěn)定性，該結果與馬煥等[31]的研究結果類似。Na+能有效提高SaccharothrixvariisporeaYJ木聚糖酶的活性，而Mg2+和Mn2+對其酶活性沒有明顯的影響，Ca2+可以輕微地抑制其酶活性；該結果與芽胞桿菌MS12木聚糖酶的性質不同，Na+、Mg2+和Ca2+對芽胞桿菌MS12木聚糖酶的活性有促進作用[31]。此外，該菌株發(fā)酵液可以直接(不需要經(jīng)過堿提取木聚糖)對天然底物玉米芯進行降解，經(jīng)過6 h的處理后，可以從0.05 g玉米芯獲得0.88 mg的還原糖，是經(jīng)過堿提取處理玉米芯獲取還原糖的10倍。該酶的最適溫度、pH、穩(wěn)定性以及對天然底物的降解特點使得該酶在酶解處理木質纖維素方面具有良好的應用潛力。