華正罡，陳曦，于浩洋，馮靜

（遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧省空氣霧霾與人群健康監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110005）

百草枯和敵草快均為帶有雙電荷的季銨鹽類除草劑，二者常配伍使用，廣泛用于控制農(nóng)作物和水生雜草，在滅生型除草劑中其產(chǎn)量分別位居世界第二和第三。百草枯對(duì)人類的毒性極大，主要作用于肺部，會(huì)造成肺細(xì)胞的纖維化，使氣體交換嚴(yán)重受損，最終導(dǎo)致中毒者血液和組織缺氧而死亡［1-5］。百草枯因其毒性高、臨床無特效解毒劑已于2016 年7 月被禁止在國(guó)內(nèi)銷售和使用［6］，此后敵草快的銷量逐漸上升，但敵草快的生產(chǎn)成本較百草枯高，有部分生產(chǎn)者為了降低成本，牟取暴利，將百草枯改名為“敵草快”或?qū)俨菘輷饺霐巢菘熘谐鍪?。敵草快屬于中等毒性除草劑，盡管其毒性較百草枯低，但毒理作用與百草枯相似，可導(dǎo)致中毒者死亡［7-9］。目前對(duì)于百草枯和敵草快中毒病人均無特效治療藥，因此對(duì)尿液中百草枯和敵草快的準(zhǔn)確測(cè)定，可以為臨床早期診斷提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)信息。目前檢測(cè)百草枯和敵草快的方法主要有紫外分光光度法［10］、液相色譜法［11-12］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13-15］，其中，紫外分光光度法靈敏度低，不適用于生物樣品的微量檢測(cè)；百草枯和敵草快是季銨鹽類強(qiáng)極性化合物，易溶于水，不易溶于有機(jī)溶劑，很難在普通C18或其它反相液相色譜柱上保留。離子對(duì)試劑可用于提高反相保留時(shí)間，但如果用串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)與定量，離子對(duì)試劑會(huì)產(chǎn)生顯著的離子抑制作用，降低質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，同時(shí)增加質(zhì)譜系統(tǒng)的污染。

親水作用液相色譜（HILIC），也被稱為“反反相”色譜。該色譜無需離子對(duì)試劑［16］，能夠顯著提高離子化效率，對(duì)強(qiáng)極性化合物的測(cè)定具有明顯優(yōu)勢(shì)?？紤]到生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，易引起基質(zhì)干擾，筆者采用弱陽離子交換固相萃取柱對(duì)尿液進(jìn)行凈化及濃縮，以降低基質(zhì)干擾，在此基礎(chǔ)上建立了親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)、快速測(cè)定尿液中百草枯和敵草快的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Acquity Xevo TQ 型，美國(guó)沃特世公司。

高速冷凍離心機(jī)：Thermo ST16R 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

漩渦混合器：Vortex-genie2 型，美國(guó)Scientific industries 公司。

分析天平：BS 110S 型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

百草枯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：批號(hào)為9-KMT-123-3，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98%，加拿大Toronto Research Chemicals（TRC）。

敵草快標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：批號(hào)為9-KMT-123-3，純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為98%，上海麥克林生化科技有限公司。

待測(cè)尿液樣品：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所。

空白尿液樣品：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所。

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

甲酸銨、甲酸：均為優(yōu)級(jí)純，北京化工廠。

磷酸二氫鉀：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液配制

磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加入500 mL 水溶解，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水稀釋至1 000 mL。

百草枯、敵草快標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，分別稱取百草枯、敵草快標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各（10±0.1）mg 于10 mL 容量瓶中，加入超純水溶解并定容至標(biāo)線，混勻，于-20 ℃保存。

百草枯、敵草快標(biāo)準(zhǔn)中間液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，分別準(zhǔn)確吸取百草枯、敵草快標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，以水稀釋至標(biāo)線，混勻，于-20 ℃保存。

百草枯、敵草快基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別吸取百草枯標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1 mL、敵草快標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05 mL，置于同一只10 mL 容量瓶中，以空白基質(zhì)提取液定容至標(biāo)線，混勻，配制成百草枯的質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL、敵草快的質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

百草枯、敵草快基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：依次準(zhǔn)確吸取百草枯、敵草快基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.01、0.02、0.2、0.4、1.0、1.5 mL，分別置于6 只10 mL 容量瓶中，以空白基質(zhì)提取液稀釋至標(biāo)線，混勻，配制成百草枯的質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、20、40、100、150 ng/mL，敵草快的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、10、20、50、75 ng/mL 的基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確移取0.5 mL 尿液樣品，用磷酸鹽緩沖液稀釋定容至10 mL，渦旋混勻10 s，過預(yù)先經(jīng)3 mL 甲醇和3 mL 水活化與平衡的弱陽離子交換固相萃取柱（WCX），待快流干時(shí)依次用6 mL 水和6 mL 甲醇淋洗，棄去所有淋洗液，然后用5 mL 2%甲酸乙腈溶液洗脫，收集洗脫液，于40 ℃下氮吹至近干，加入1 mL 乙腈-水（體積比為1∶1）溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm 疏水性聚四氟乙烯濾膜（PTFE）過濾，待測(cè)。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜

色譜柱：Waters HILIC柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)沃特世公司）；柱溫：30 ℃；樣品室溫度：4 ℃；流動(dòng)相：A 相為乙腈，B 相為200 mmol/L 甲酸銨水溶液（pH=3.7），流量為0.5 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～1 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)為90%，1～3 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)由90%逐漸下降至30%，3～3.5 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)由30%逐漸下降至10%，3.5～4.0 min 時(shí)A 相體積分?jǐn)?shù)由10%逐漸上升至90%，保持2 min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描模式；毛細(xì)管電壓：2.34 kV；離子源溫度：150 ℃；錐孔反吹氣：氮?dú)?，純度（體積分?jǐn)?shù)）大于99.999%，流量為50 L/h；脫溶劑氣：氮?dú)?，溫度?50 ℃，流量為650 L/h；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。百草枯、敵草快質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見表1 所示。

表1 百草枯、敵草快的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL 的百草枯、敵草快標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm 濾膜，在ESI+模式下，采用全掃描模式分別進(jìn)樣測(cè)定，百草枯和敵草快母離子全掃描質(zhì)譜圖如圖1 所示。由圖1 可以看出，百草枯和敵草快的雙電荷聯(lián)吡啶離子結(jié)構(gòu)特征顯示了其復(fù)雜的質(zhì)譜行為，百草枯能同時(shí)監(jiān)測(cè)到分子離子M2+（m/z92.94）和M+（m/z186.25）及去氫分子離子［M2+-H+］+（m/z185.17）3 種類型的準(zhǔn)分子離子；敵草快能同時(shí)監(jiān)測(cè)到分子離子M2+（m/z92.87）和M+（m/z183.97）及去氫分子離子［M2+-H+］+（m/z183.07）3 種類型的準(zhǔn)分子離子，與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致。再分別以上述3 種離子作為母離子，進(jìn)行碰撞解離，并對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描分析，得到目標(biāo)化合物的碎片離子信息，如圖2 所示。由圖2 可以看出，百草枯去甲基碎片［M2+-CH3+］+（m/z171.07）和敵草快先去氫再去乙基后的碎片（m/z157.11）信號(hào)較強(qiáng)，可作為定量離子。然后對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使得待測(cè)化合物離子對(duì)信號(hào)達(dá)到最高，并以信號(hào)響應(yīng)次高的離子對(duì)作為定性離子，優(yōu)化結(jié)果見表1。

圖1 百草枯和敵草快母離子全掃描質(zhì)譜圖

圖2 百草枯和敵草快子離子全掃描質(zhì)譜圖

2.2 色譜條件優(yōu)化

百草枯和敵草快均屬于季銨鹽化合物，極性大，反相色譜柱難以保留，文獻(xiàn)［17］采用向流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑以增加其保留行為，但離子對(duì)試劑會(huì)抑制質(zhì)譜信號(hào)，降低儀器檢測(cè)靈敏度，同時(shí)還會(huì)對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染。親水色譜（HILIC）采用強(qiáng)極性固定相來改善強(qiáng)極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)，結(jié)合高比例的有機(jī)相和低比例水相組成流動(dòng)相體系，可實(shí)現(xiàn)百草枯和敵草快的保留和分離，因此選擇Waters HILIC 色譜柱為分離柱，乙腈-水為流動(dòng)相。

百草枯和敵草快極易被玻璃和不銹鋼等材料吸附，在樣品制備和檢測(cè)過程中應(yīng)完全避免使用玻璃和不銹鋼器皿，但在檢測(cè)過程中儀器的管路及色譜柱接口的不銹鋼材料對(duì)待測(cè)化合物造成的吸附無法避免，而且硅膠基色譜柱上殘留的硅羥基對(duì)帶正電荷的百草枯和敵草快會(huì)有二級(jí)吸附作用，綜合表現(xiàn)的結(jié)果為色譜峰展寬并且嚴(yán)重拖尾，如圖3（a）所示。為了減少測(cè)定過程中對(duì)待測(cè)化合物的吸附，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度，一是向流動(dòng)相中加入一定濃度的甲酸銨緩沖液以競(jìng)爭(zhēng)性拮抗硅羥基結(jié)合位點(diǎn)對(duì)待測(cè)物的吸附，改善色譜峰拖尾；二是增加流動(dòng)相流量，以進(jìn)一步加強(qiáng)洗脫能力。分別考察了在水相中加入濃度為50、100、150、200 mmol/L 的甲酸銨緩沖液和流量分別為0.3、0.4、0.5 mL/min 時(shí)的色譜行為，結(jié)果表明，以200 mmol/L 甲酸銨溶液作為水相，流量為0.5 mL/min 時(shí)，色譜峰的對(duì)稱因子為0.95～1.05，滿足系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)對(duì)色譜峰對(duì)稱性的要求，如圖3（b）所示。

圖3 不同濃度甲酸銨作為水相時(shí)百草枯和敵草快的色譜圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在1.4 儀器工作條件下，測(cè)定百草枯、敵草快基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄百草枯和敵草快的色譜峰面積（A），然后測(cè)定相同濃度水平的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中百草枯和敵草快的色譜峰面積（B），各平行測(cè)定5 次。根據(jù)公式R=A/B×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。計(jì)算得百草枯的基質(zhì)效應(yīng)為2.8%，敵草快的基質(zhì)效應(yīng)為4.9%，表明尿樣基質(zhì)對(duì)百草枯和敵草快均有顯著的基質(zhì)抑制作用（R小于85%認(rèn)為存在基質(zhì)抑制效應(yīng)［18］）。基于百草枯和敵草快的季銨鹽陽離子特性，選擇混合型聚合物反相吸附和弱陽離子交換機(jī)理的固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。平行稱取6份空白尿液樣品，分別加入適量的百草枯、敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3 樣品處理方法處理，在1.4儀器工作條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示敵草枯和百草枯的基質(zhì)效應(yīng)分別為95.3%和98.4%，表明樣品經(jīng)凈化后基質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定。

2.4 線性方程與檢出限

在1.4 儀器工作條件下，分別對(duì)百草枯、敵草快基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以待測(cè)化合物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、以定量離子對(duì)的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限。百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取6 份尿液空白樣品各0.5 mL，分別加入百草枯、敵草快混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各100 μL，按1.3 樣品處理方法處理，在1.4 儀器工作條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。由表3 可知，百草枯和敵草快的平均回收率分別為100.9%，100.8%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.6%、1.6%，表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了親水色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定尿液中百草枯和敵草快的方法。該方法具有較好的精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度，適合尿液中百草枯和敵草快的快速檢測(cè)。