籍瑞芳，劉會

（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250102）

舒膽片是由大黃、虎杖、梔子、枳殼、芒硝、木香、郁金、茵陳和厚樸9 味藥材制成的常用中成藥，具有清熱化濕、利膽排石，行氣止痛的功效［1］，用于治療急慢性膽囊炎，在臨床上常與拉氧頭孢鈉聯(lián)合使用，療效顯著［2］。

舒膽片中的君藥大黃具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃的功效，主要含有多種蒽醌類、多糖類和鞣質(zhì)類等化合物［3］，常見的蒽醌類物質(zhì)為大黃素、大黃酚、大黃酸等。虎杖具有利濕退黃，清熱解毒，散瘀止痛，止咳化痰的功效，主要含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類和香豆素類等化合物［4］，虎杖苷是其重要的特征物質(zhì)。石春林等［5］研究表明虎杖苷能增強THP-1 巨噬細胞的增殖能力，抑制炎癥因子的表達。梔子具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效，主要含有環(huán)烯醚萜類、二萜類和黃酮類等化合物［6］，梔子苷是其主要的活性成分?，F(xiàn)代藥理學研究表明［7］，梔子苷具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等生物活性。枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的功效，主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、生物堿類等化合物［8］，柚皮苷和新橙皮苷是其中含量最高的黃酮類物質(zhì)。各成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮藥效。因此對組方進行多指標分析，不僅能全面評價產(chǎn)品的質(zhì)量水平，而且能為臨床用藥提供參考。

舒膽片的質(zhì)量標準收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑：第二十冊》［1］中。該質(zhì)量標準中僅有大黃及梔子苷的薄層色譜鑒別分析，沒有對舒膽片中各成分進行含量測定，無法全面、準確地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。目前文獻對舒膽片的質(zhì)量研究主要是關(guān)于蒽醌類物質(zhì)的測定，田惠玲等［9］利用HPLC 法測定了舒膽片中的大黃素和大黃酚的含量；籍瑞芳等［10］曾利用一測多評法對舒膽片中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚進行了含量測定，但未見對舒膽片中其它成分進行測定的報道。筆者采用波長切換方式，以各成分的最大吸收波長作為其檢測波長，建立了HPLC 法同時測定舒膽片中梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷含量的方法。該方法操作簡單實用、重復性和穩(wěn)定性良好，為實現(xiàn)舒膽片的多指標質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-2030 Plus 型，LabSolutions工作站，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

電子天平：（1）MS205DU 型，感量為0.01 mg；（2）MS204TS/02 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE 型，昆山市超聲儀器有限公司。

梔子苷、虎杖苷、柚皮苷、新橙皮苷對照品：批號分別為110749-201919、111575-200502、110722-201714、111857-201102，純度（質(zhì)量分數(shù)）分別為97.1%、100%、93.4%、99.6%，中國食品藥品檢定研究院。

舒膽片樣品：共5 批，市售。

乙腈：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

甲醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，瑞典諾力昂公司）；流動相：乙腈-水；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：乙腈初始體積分數(shù)為10%，0～15 min 時乙腈體積分數(shù)由10%逐漸增加至25%，保持10 min；流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：初始波長為238 nm，保持13 min，然后切換至306 nm，保持4 min，最后切換至283 nm，保持8 min；進樣體積：10 μL。

1.3 對照品溶液制備

首先將虎杖苷和新橙皮苷置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h，然后精密稱取梔子苷、柚皮苷和新橙皮苷對照品各約12 mg、虎杖苷對照品約16 mg，置于同一只200 mL 容量瓶中，加入80%甲醇溶液溶解并稀釋至標線，搖勻，作為對照品儲備溶液。

精密量取上述對照品儲備溶液5 mL 于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶液稀釋至標線，搖勻，配制成梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為31.70、40.48、29.89、31.03 μg/mL 的對照品溶液。

1.4 供試品溶液制備

取舒膽片樣品20 片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取約0.45 g（約一片的量），置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

由于虎杖苷的光穩(wěn)定性較差，在光照下易發(fā)生異構(gòu)化［11］，所以在制備對照品溶液和供試品溶液過程中，需要避光操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長選擇

梔子苷屬于環(huán)烯醚萜類，虎杖苷屬于二苯乙烯類，柚皮苷和新橙皮苷屬于黃酮類，各成分之間最大紫外吸收波長差別較大。用PDA 檢測器對梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷在190～400 nm 范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果顯示，梔子苷紫外光譜最大吸收波長為238 nm；虎杖苷最大吸收波長為306 nm；柚皮苷和新橙皮苷最大吸收波長為283 nm。為了降低干擾，提高檢測靈敏度，采用波長切換方式，以各成分的最大吸收波長作為其檢測波長，即梔子苷的檢測波長為238 nm，虎杖苷的檢測波長為306 nm，柚皮苷和新橙皮苷的檢測波長為283 nm。

2.2 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)文獻［12-14］，分別考察了流動相為乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液時4 種待測化合物的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動相時，基線平穩(wěn)、各成分完全分離，色譜峰形好，理論塔板數(shù)高，因此選擇乙腈-水作為流動相。由于4 種待測化合物極性差別較大，等度洗脫分析時間較長，所以采用梯度洗脫的方式，洗脫程序：乙腈初始體積分數(shù)為10%，0～15 min 時乙腈體積分數(shù)由10%逐漸增加至25%，保持10 min。

2.3 樣品提取條件選擇

根據(jù)文獻［15］，分別采用稀乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、95%乙醇溶液、80%甲醇溶液和甲醇作為提取溶劑，考察4 種待測化合物的提取效果。結(jié)果表明，以80%甲醇溶液作為提取溶劑時，目標化合物提取率高，干擾雜質(zhì)峰較少，且操作簡單易行，故選擇80%甲醇溶液為提取溶劑。以80%甲醇溶液為提取溶劑，分別考察超聲提取30、45、60 min 和加熱回流30、45、60 min兩種方法的提取效果，結(jié)果表明，超聲處理45 min時4 種待測化合物即可實現(xiàn)完全提取，且能耗較低，故樣品提取方法采用超聲處理45 min。

2.4 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗

取1.3 中的對照品溶液和1.4 中的供試品溶液，按照1.2 色譜條件分別進樣測定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷完全分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000。采用二極管陣列（PDA）檢測器對供試品溶液在190～400 nm 波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，結(jié)果表明，4 種待測化合物的光譜圖與對照品的光譜圖一致，同時進行色譜峰純度檢查，均符合要求。

圖1 對照品溶液和供試品溶液色譜圖

2.5 線性方程與檢出限

精密吸取1.3 中的對照品溶液1、2、5、8、10、12、15、18、20 μL，按照1.2 色譜條件分別進樣測定，以各待測成分的質(zhì)量（X）為橫坐標，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。將1.3 中的對照品溶液用80%甲醇溶液逐級稀釋，按照1.2 色譜條件進樣測定，以3 倍信噪比對應的質(zhì)量作為檢出限，以10 倍信噪比對應的質(zhì)量作為定量限。4 種化合物質(zhì)量線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。

表1 4 種化合物質(zhì)量線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 穩(wěn)定性試驗

取舒膽片樣品，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下，分別于制備完成后第0、4、8、12、18、24 h 進樣測定，記錄色譜峰面積，計算色譜峰面積的相對標準偏差，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表2 可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.48%～1.48%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取同一批號舒膽片樣品，按1.4 方法平行制備6 份供試品溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.03%，1.45%，1.11%，1.10%，表明該方法重復性良好。

表3 重復性試驗結(jié)果

2.8 加標回收試驗

取已知含量的舒膽片樣品6 份，每份0.23 g（約半片的量），精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，每份均精密加入1.3 中的對照品儲備溶液12.5 mL，用80%甲醇溶液稀釋至標線，按照1.4 方法制成供試品溶液，在1.2 色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表4。由表4 可知，梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷加標平均回收率分別為100.2%、102.8%、98.6%、100.6%，表明該方法的準確度良好。

表4 加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

通過波長切換和梯度洗脫的方式，建立了同時測定舒膽片中梔子苷、虎杖苷、柚皮苷和新橙皮苷含量的方法。該方法操作簡單，專屬性強，準確度高，為全面考察舒膽片的質(zhì)量水平提供了參考方法和可靠依據(jù)。