張淼 鄧悅 于克英 常麗萍 田騰輝 石銳 邵笑

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由于膽固醇物質(zhì)的過度沉積從而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化及管腔狹窄，進(jìn)而在動(dòng)脈壁上累積聚集形成AS[1]。炎癥反應(yīng)是AS的主要病因之一[2]。其中脂質(zhì)沉積及炎性因子的釋放能夠造成內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞遷移及巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張，形成纖維帽，促進(jìn)動(dòng)AS斑塊的形成[3]。

丹酚酸A(salvianolic acid A，Sal A)是唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的根莖中的主要活性成分，具有抑制氧化應(yīng)激、抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等作用[4]，但尚未明確其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性小體的影響和機(jī)制。因此本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)造成炎性損傷，觀察Sal A對(duì)HUVECs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量及炎性小體相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)的影響，旨在明確Sal A對(duì)HUVECs損傷保護(hù)作用，為中醫(yī)藥預(yù)防和治療AS提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HUVECs(武漢普諾賽生命科技有限公司)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清及1%雙抗)，培養(yǎng)箱條件：37℃，5%CO2。

1.2 主要試劑和儀器

Sal A(索萊寶公司，批號(hào)：200D301)；LPS(索萊寶公司，批號(hào)：820F038)；胎牛血清(美國(guó)Clark公司，批號(hào)：FB25025)；青鏈霉素雙抗(美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)：SV30010)；磷酸鹽緩沖溶液(美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)：AC10257442)；CCK-8試劑盒(索萊寶公司，批號(hào)：CA1210，)；ELISA試劑盒(上海優(yōu)選生物公司，批號(hào)：T1320)；ROS檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：S0033)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，批號(hào)：DP419)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：R0010)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)，批號(hào)：P0012)；NLRP3一抗(美國(guó)CST 公司，批號(hào)：13158)；ASC一抗(美國(guó)CST公司，批號(hào)：13833)；GAPDH一抗(美國(guó)CST公司，批號(hào)：5174)；辣根過氧化物酶二抗(Proteintech 公司，批號(hào)：SA00001)。

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；RT-PCR儀(美國(guó)伯樂公司)；智能成像系統(tǒng)(iBright，F(xiàn)L1000)。

1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs細(xì)胞以每孔約1×104個(gè)接種于96孔板中，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、不同濃度Sal A組(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)及空白組(不含細(xì)胞)。待細(xì)胞完全貼壁后，棄培養(yǎng)基，對(duì)照組、空白組每孔加100 μL正常培養(yǎng)基，其余每孔加入含LPS(濃度1 μg/mL)的培養(yǎng)基100 μL以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，培養(yǎng)4小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基，對(duì)照組、模型組及空白組加入100 μL的正常培養(yǎng)基，各Sal A組分別加入濃度為6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L 的Sal A培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(optical density,OD)，并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(給藥組-空白組)OD值/(對(duì)照組-空白組)OD值×100%，共測(cè)3次。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HUVECs中炎性因子腫瘤壞死因子-α(transforming necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs細(xì)胞以每孔約1×105個(gè)接種于6孔板中，將細(xì)胞分為：對(duì)照組、模型組、Sal A低劑量組、Sal A中劑量組及Sal A高劑量組。待細(xì)胞完全貼壁后，棄培養(yǎng)基，對(duì)照組加1 mL正常培養(yǎng)基，其余每孔加入含脂多糖(濃度1 μg/mL)的培養(yǎng)基1 mL以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，培養(yǎng)4小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基，對(duì)照組、模型組加入1 mL正常培養(yǎng)基，Sal A低劑量組、中劑量組及高劑量組分別加入濃度為6.25、12.5、25 μm/L 的SalA培養(yǎng)基1 mL，24小時(shí)后，將各組孵育后的細(xì)胞上清液以3000 r/分鐘，離心10分鐘除去顆粒和聚合物，嚴(yán)格并按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)3次。

1.5 活性氧ROS檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs細(xì)胞以每孔約1×105個(gè)接種于6孔板中，分組及給藥同1.4；收集細(xì)胞后，嚴(yán)格按照ROS試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作以測(cè)定各組細(xì)胞中活性氧ROS含量，檢測(cè)3次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)含NLP家族Pyrin域蛋白3重組蛋白(recombinant NLR Family Pyrin domain containing protein3,protein3,NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(adaptor protein apotosis speck-like protein containing CARD，ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-18、IL-1β mRNA表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs細(xì)胞以每孔約1×105個(gè)接種于6孔板中，分組及給藥同1.4，培養(yǎng)24小時(shí)后棄培養(yǎng)基，每孔加入1 mL RNA裂解液，按試劑盒步驟提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，合格后轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件：95℃，30 s，95℃，5 s，60℃，30 s，40個(gè)循環(huán))，最后用2-ΔΔCT計(jì)算各目的基因的表達(dá)變化，檢測(cè)3次。PCR引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白免疫印跡檢測(cè)NLRP3、ASC蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs細(xì)胞以每孔約1×105個(gè)接種于6孔板中，分組及給藥同1.4，培養(yǎng)24小時(shí)后棄培養(yǎng)基，給予RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度后將濃度調(diào)平；配置6%及12%分離膠，5%濃縮膠，各組蛋白等量上樣進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)，4度一抗(1∶1000)封閉過夜，后經(jīng)二抗(1∶2000)室溫孵育1小時(shí)；超敏ECL試劑盒顯色，成像儀拍照。使用Image J軟件帶進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白均以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組比較，模型組在LPS刺激后細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，Sal A各組在一定范圍內(nèi)以濃度依賴方式提高細(xì)胞活性，當(dāng)濃度為25 μm/L時(shí)效果最明顯(P<0.05)。見表2。

表2 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞活性的影響

2.2 Sal A對(duì)HUVEC細(xì)胞TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果提示，Sal A濃度為25 μm/L時(shí)，細(xì)胞活性升高最為顯著，故以LPS 1 μg/mL +Sal A 25μmol/L為高劑量組，LPS 1 μg/mL +Sal A 12.5μmol/L為中劑量組，LPS 1 μg/mL +Sal A 6.25 μmol/L為低劑量組。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)果表示：與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-1β含量顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，Sal A低劑量組、中劑量組及高劑量組中TNF-α、IL-1β表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

2.3 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞ROS表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組ROS表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，Sal A低、中、高劑量組ROS表達(dá)均有所降低(P<0.05)。見表4。

表4 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞ROS表達(dá)的影響

2.4 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組相比，Sal A低、中、高劑量組中NLRP3、ASC、 Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)。見表5。

表5 Sal A對(duì)HUVEC細(xì)胞NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 Sal A對(duì)HUVECs細(xì)胞NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組NLRP3、ASC 蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組相比，各濃度Sal A組中NLRP3、ASC 蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)。表6、見圖1。

表6 丹酚酸A對(duì)HUVECs細(xì)胞NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平的影響

注：A 對(duì)照組；B 模型組；C Sal A低劑量組；D Sal A 中劑量組；E Sal A高劑量組。

3 討論

NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)包括受體蛋白NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白ASC及效應(yīng)蛋白Caspase-1以三部分[5]。當(dāng)NLRP3炎性小體激活后，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的無(wú)活性前體pro-Caspase-1，在ASC的作用下聚集并被水解為具有生物活性的Caspase-1，繼而Caspase-1將無(wú)活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，剪切為炎性因子IL-1β、IL-18，從而發(fā)細(xì)胞焦亡[6]。研究表明，與正常組織比，人頸動(dòng)脈斑塊中NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18 mRNA表達(dá)顯著增高[7]。目前研究認(rèn)為NLRP3炎癥小體激活的機(jī)制復(fù)雜，大致可分為以下三種方式：(1)離子再分布，當(dāng)細(xì)胞外ATP含量升高，P2X嘌呤受體7(P2X7)信號(hào)通路介導(dǎo)離子通道開放，從而促進(jìn)K+外流，NLRP3炎性小體在鉀離子通量發(fā)生改變時(shí)被激活[8]；(2)溶酶體損傷，當(dāng)胞外晶體或特殊顆粒如蛋白聚集體等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，引起溶酶體破裂，在多種組織蛋白酶作用于細(xì)胞膜，促進(jìn)鉀離子外流，進(jìn)而促進(jìn)NLRP3炎癥體的聚集和激活；(3)ROS的產(chǎn)生，ROS作為NLRP3炎性小體形成和激活的關(guān)鍵因素，可依賴PAMPs和DAMPS通過ROS依賴的信號(hào)通路產(chǎn)生，當(dāng)ROS的產(chǎn)生和清除失衡時(shí)，引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)的氧化修飾[9]。研究表明，線粒體功能障礙，則能夠?qū)е耺tROS的產(chǎn)生，激活NLRP3炎性小體，同時(shí)氧化的mtDNA也是激活NLRP3炎性小體的原因之一[10]。

內(nèi)皮功能障礙是AS發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，可通過炎癥、氧化應(yīng)激及自噬等不同機(jī)制參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。內(nèi)皮細(xì)胞作為NLRP3炎性小體激活后的產(chǎn)物IL-1β的靶細(xì)胞之一，當(dāng)炎癥反應(yīng)被激活后，內(nèi)皮細(xì)胞功能不僅受到影響，還能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌粘附分子和趨化因子以進(jìn)一步促進(jìn)炎癥[11]。當(dāng)NLRP3炎性小體被激活后，其分泌的IL-18和IL-1β能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，這種由NLRP3炎性小體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，又會(huì)進(jìn)一步增加DAMPs的釋放，進(jìn)而形成不良循環(huán)。

中藥材丹參常用于預(yù)防和治療心血管疾病，其味苦，微寒，具有活血祛瘀，涼血消癰功效，如《本經(jīng)》言其有主治“心腹邪氣……破癥除瘕”作用。其水溶性酚類化合物Sal A被證實(shí)有抗AS、抗炎作用[12-15]，但尚無(wú)其通過氧化應(yīng)激調(diào)控NLRP3炎性小體的表達(dá)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究，因此本實(shí)驗(yàn)探究了推測(cè)Sal A的抗氧化應(yīng)激及抗炎作用，證明了其對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎性小體的抑制作用，為中醫(yī)藥治療AS提供了科學(xué)依據(jù)。但炎性小體對(duì)AS的作用機(jī)制復(fù)雜，Sal A是否通過其他信號(hào)通路作用于炎性小體及其抗AS的作用具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。