何 龍，趙 琪，莊婷婷，朱詩蘭，陳曉雨，李國清

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

鉤蟲是一類寄生于人和犬、貓等動物腸道中的土源性線蟲，其感染性幼蟲可通過皮膚與口腔感染宿主，引發(fā)人畜共患的鉤蟲病[1]。該病是一種極易被忽視，但呈世界性流行的腸道寄生蟲病，在熱帶及亞熱帶經(jīng)濟落后地區(qū)的感染尤為嚴重，盡管該病的死亡率相對較低，但在一些貧窮落后的國家仍可造成健康隱患與嚴重的經(jīng)濟損失[2-3]。錫蘭鉤蟲（Ancylostoma ceylanicum）是一種能夠在人體內發(fā)育為成蟲的動物源性鉤蟲，既可感染犬、貓也可感染人，研究表明，錫蘭鉤蟲已成為亞洲地區(qū)感染人的第二大鉤蟲，感染后可引起腹痛、腹瀉、營養(yǎng)不良和缺鐵性貧血等癥狀[4]。多項研究證實錫蘭鉤蟲已在中國、尼日利亞、柬埔寨等地的人和伴侶動物之間傳播，尤其是在犬貓中高度流行，使得人感染錫蘭鉤蟲的風險顯著上升[5-6]。因此，研究控制該病的新方法已成為當務之急。本研究室一直致力于錫蘭鉤蟲的分泌蛋白候選抗原的研究，前期已對谷胱甘肽-S-轉移酶、血小板抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑進行了克隆表達，并對其生物學功能進行了探究[7-9]。

鞘脂激活蛋白樣蛋白（Saposin-like proteins，SLPs）又稱皂素樣蛋白，是由鞘脂激活蛋白原（Prosaposin）衍生的一類蛋白家族，具有改變細胞膜通透性及裂解紅細胞等的作用。該蛋白廣泛分布于各種原生動物及哺乳動物體內，目前已發(fā)現(xiàn)235 個家族成員，它們具有溶血、抗菌等多種生物學功能[10]。Don 等在犬鉤蟲（Ancylostoma caninum）中克隆表達了一種可以致紅細胞破裂的蛋白，通過與肝片吸蟲（Fasciola hepatica）FhSAP 基因序列的比對，證實其屬于SLPs[11]。隨后Willis 等完成了對美洲鉤蟲（Necator americanus）和犬鉤蟲SLPs 晶體結構的測定與功能分析[12]。但迄今未見對錫蘭鉤蟲SLPs 的報道。基于此，本研究克隆錫蘭鉤蟲Ace-SLP-1 基因，并對其編碼蛋白的氨基酸序列進行生物信息學分析；將該基因經(jīng)原核表達，對其表達產物進行免疫學特性分析，為進一步研究該蛋白的生物學功能及其作為鉤蟲疫苗候選分子的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 犬源錫蘭鉤蟲的獲得錫蘭鉤蟲三期幼蟲（L3幼蟲）采用離心管“T”型濾紙法從犬糞便中分離所得，成蟲通過L3 幼蟲人工感染金黃倉鼠而獲得；所有蟲體樣品均參照文獻[13]方法鑒定為錫蘭鉤蟲，置于RNA 樣品保存液中-20 ℃保存?zhèn)溆?；錫蘭鉤蟲感染犬和健康犬均由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院臨床外科教研室提供。

1.2 主要試劑pMD-19T 與pET-28a 克隆載體、BamH I、Hind III 均購自TaKaRa 公司；改良BCA 蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8 試劑盒、兔抗犬IgGHRP、兔抗鼠IgG-HPR 和鼠His 標簽單克隆抗體（MAb）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；E. coliDH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自廣州擎科生物科技有限公司；蛋白Marker 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；MicroElute Total RNA Kit、MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit 和Gel Extraction Kit D2500 均購自廣州歐米伽生物工程有限公司；His 標簽純化試劑盒購自碧云天生物技術（上海）公司；外周血淋巴細胞分離試劑盒購自天津灝洋華科生物科技有限公司。

1.3 Ace-SLP-1 基因的PCR 擴增與測序根據(jù)GenBank 中犬鉤蟲Ac-SLP-1 基因序列（DQ855414.1），設計特異性引物SLP-1-F：5'-ATGACTCGCTTGAT CTTCGTCGT-3'/SLP-1-R：5'-TCAACAAGCATGCA GAGTTGTGC-3'。采用Total RNA Kit 提取成蟲總RNA，反轉錄合成cDNA 第一鏈作為模板，利用上述引物經(jīng)PCR 擴增Ace-SLP-1 基因，反應條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s、56.5 ℃30 s、72 ℃80 s，共35個循環(huán)； 72 ℃8 min。采用BamHI、Hind III 分別雙酶切pMD19-T 和目的基因PCR 產物，經(jīng)T4 連接酶連接，構建重組質粒pMD19-T-Ace-SLP-1，并經(jīng)雙酶切鑒定，陽性克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 Ace-SLP-1 編碼蛋白的生物信息學及同源性分析根據(jù)Ace-SLP-1 基因測序結果推導其氨基酸序列，利用DNAMAN 軟件將其與11 種不同蟲種SLPs 的氨基酸序列進行同源性比對。利用在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）分析該蛋白的分子量大小、氨基酸組成、等電點（PI）等性質；分別利用在線軟件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHMMServer2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtScale（http://web. expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）對該蛋白的信號肽序列、跨膜結構域與疏/親水性進行分析；利用SWISS-MODEL預測軟件（http://swissmodel.expasy.org/）預測并構建該蛋白的三維結構模型。

1.5 Ace-SLP-1 成熟肽基因（Ace-XL-SLP-1）重組質粒的構建及其重組蛋白（rAce-XL-SLP-1）的表達、純化及鑒定根據(jù)1.4 的分析結果，選擇錫蘭鉤蟲Ace-XL-SLP-1 的成熟肽基因序列進行蛋白表達：設計擴增其成熟肽基因序列Ace-XL-SLP-1 的上下游引物XL-SLP-1-F：5'-AAGCTTTCAACAAGCAT GCAGAG-3'/XL-SLP-1-R：5'-GGATCCACTCCAGT AGTGATCAAC-3'。參照1.3 方法經(jīng)PCR 擴增Ace-XL-SLP-1 基因，采用BamH I、Hind III 雙酶切質粒pET-28a 和目的基因PCR 產物，并利用T4 連接酶連接，構建錫蘭鉤蟲Ace-XL-SLP-1 成熟肽重組質粒pET28a-Ace-XL-SLP-1 并經(jīng)雙酶切鑒定，陽性克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將pET28a-Ace-XL-SLP-1 轉化大腸桿菌E. coliBL21（DE3），37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6 時，加入1 mmol/L IPTG 誘導表達6 h～8 h，4 ℃離心收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達。將離心收集的包涵體置于8 mol/L尿素緩沖液中溶解過夜，離心收集上清，用0.22 μm濾膜過濾后，上樣于Ni-NTA親和層析柱，分別用10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 的咪唑緩沖液洗脫，收集洗脫液及純化后的蛋白，以鼠His 標簽MAb（1∶3 000）為一抗，兔抗鼠HRP-IgG（1∶20 000）為二抗，同時以誘導的pET-28a/BL21（DE3）菌液與鼠His 標簽MAb 孵育后作為陰性對照。經(jīng)western blot 進一步分析rAce-XL-SLP-1 的純化效果。

1.6 rAce-XL-SLP-1 的反應原性分析分別從錫蘭鉤蟲感染犬和健康犬經(jīng)前肢靜脈無菌采血，分離血清。對純化的rAce-XL-SLP-1 分別以感染犬血清（1∶4 000）和健康犬血清（1∶4 000）為一抗，兔抗犬IgG-HRP（1∶20 000）為二抗，通過western blot 分析rAce-XL-SLP-1 的反應原性。

1.7 rAce-XL-SLP-1 對犬外周血淋巴細胞（PBMC）增殖影響的檢測從前肢靜脈無菌采集健康犬EDTA抗凝血5 mL，采用外周血淋巴細胞分離液試劑盒分離健康犬PBMC，用臺盼藍染色計算活細胞數(shù)量，活細胞比率大于95%即可用于后續(xù)試驗。取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL PBMC懸液，再加入Ace-XL-SLP-1重組蛋白至終濃度分別為0、10 μg/mL、20 μg/mL、和40 μg/mL，同時設置ConA（刀豆球蛋白A）陽性對照和空白對照（細胞培養(yǎng)液），用細胞培養(yǎng)液將酶標儀調零，每個濃度3 個重復，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后利用酶標儀測定其OD450nm值，并按公式計算PBMC 的增殖指數(shù)（SI），SI=實驗組OD450nm值/對照組OD450nm值，SI＞1.5 時，判為有效刺激。所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，兩組間比較采用Studentt檢驗。

2 結 果

2.1 Ace-SLP-1 基因的PCR 擴增及其編碼蛋白的生物信息學分析以錫蘭鉤蟲cDNA 為模板經(jīng)PCR擴增Ace-SLP-1 基因。結果顯示，獲得了全長為315 bp 的Ace-SLP-1 基因序列（圖1）。測序結果顯示錫蘭鉤蟲Ace-SLP-1 基因全長315 bp，共編碼104 個氨基酸。將犬源Ace-SLP-1 基因編碼的氨基酸序列與其他蟲種的SLPs 進行比對，結果顯示，Ace-SLP-1 含有SLP 家族特有的6 個Cys-X-Cys 特征性序列，其與犬鉤蟲Ac-SLP-1 和Ac-SLP-2 編碼氨基酸序列的同源性分別為95.28%和19.81%。利用在線軟件對其氨基酸序列進行生物信息學分析，結果顯示該蛋白分子質量和PI 分別為11.4 ku 和7.0；疏水性平均系數(shù)（GRAVY）大于0，推測其為疏水性蛋白（圖1B）；有跨膜結構域（圖1C），且該蛋白前17 個氨基酸為信號肽序列（圖1D）；其三維結構模型（圖1E）結果顯示，Ace-SLP-1 編碼蛋白的全球性模型質量估值（GMQE 值）為0.64（可信度范圍為0～1，值越大表明質量越好），表明該蛋白三維結構模型建模質量良好。

圖1 Ace-SLP-1基因的PCR擴增及其編碼蛋白的生物信息學分析Fig.1 PCR amplification of Ace-SLP-1 gene and bioinformatics analysis of Ace-SLP-1 protein

2.2 Ace-XL-SLP-1 重組質粒的構建與鑒定以錫蘭鉤蟲cDNA 為模板經(jīng)PCR 擴增Ace-XL-SLP-1，并克隆至pET-28a 中，構建重組質粒pET28a-Ace-XLSLP-1，經(jīng)Hind III/BamH I酶切鑒定，結果顯示獲得了約260 bp 的目的條帶，與預期目的片段相符（圖2）。測序結果表明，正確構建重組質粒pET-28a-Ace-XL-SLP-1。

圖2 pET-28a-Ace-XL-SLP-1重組粒雙酶切鑒定結果Fig.2 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion pET-28a-Ace-XL-SLP-1

2.3 錫蘭鉤蟲Ace-XL-SLP-1 的表達、純化及鑒定結果將重組質粒pET-28a-Ace-XL-SLP-1 轉化大腸桿菌后，經(jīng)IPTG 誘導表達并經(jīng)Ni-NTA 親和層析法純化，將誘導前后菌液、破碎后沉淀、上清以及純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結果顯示，在14.4 ku處出現(xiàn)目的條帶，且該目的蛋白主要在包涵體中表達（圖3A）；western blot 結果顯示，該重組蛋白能被鼠His 標簽MAb 識別，在14.4 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖3B）；通過western blot 分析錫蘭鉤蟲rAce-XL-SLP-1 的反應原性，結果顯示該重組蛋白能夠被感染錫蘭鉤蟲的犬陽性血清特異性識別，在14.4 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而健康犬血清與該重組蛋白反應后未出現(xiàn)該條帶（圖3C）。上述結果表明，錫蘭鉤蟲重組成熟肽蛋白rAce-XL-SLP-1 具有良好的反應原性。

圖3 rAce-XL-SLP-1表達、純化的SDS-PAGE（A）及western blot（B、C）鑒定結果Fig.3 SDS-PAGE(A)and western blot(B,C)identification results of rAce-XL-SLP-1 expression and purification

2.4 Ace-XL-SLP-1 對PBMC 增殖影響的檢測結果將不同濃度的rAce-XL-SLP-1與PBMC共孵育4 h后利用酶標儀測定其OD450nm值。結果顯示，與陰性對照相比，20 μg/mL 和40 μg/mL 的rAce-XL-SLP-1 對PBMC 均具有明顯的刺激增殖作用（P＜0.05），且與其濃度有關，當?shù)鞍诐舛葹?0 μg/mL 時，SI 最大（2.15），與陽性對照組的SI 相當。當?shù)鞍诐舛鹊椭?0 μg/mL 時，刺激效果不明顯（表1）。表明，獲得的rAce-XL-SLP-1 具有一定的免疫原性。

表1 rAce-XL-SLP-1對犬PBMC增殖效應的檢測結果Table 1 Detection results of the effect of recombinant protein Ace-XL-SLP-1 on canine PBMC proliferation

3 討 論

鉤蟲被世界衛(wèi)生組織列為易被忽視的主要土源性線蟲之一[14]。我國多次對家養(yǎng)犬進行的蠕蟲流行病學調查時發(fā)現(xiàn)，錫蘭鉤蟲是寄生在犬體內的優(yōu)勢蟲種，嚴重危害犬的健康[15]。目前主要采取藥物治療和環(huán)境衛(wèi)生措施防治鉤蟲病，但由于鉤蟲抗藥性的產生和重復感染使其療效不佳。近年來，研究人員試圖從鉤蟲致病機理角度來探究該病新的防治方法，其中能夠改變細胞膜通透性并使紅細胞破裂的SLPs 成為研究熱點。

本研究首次從錫蘭鉤蟲成蟲克隆了Ace-SLP-1的cDNA 序列。通過對其氨基酸序列的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白前17 個氨基酸為信號肽序列，不利于該重組蛋白的表達。為了提高其表達量，本研究設計了一對引物擴增Ace-SLP-1 基因的成熟肽序列，并在E. coliBL21（DE3）菌株中表達出了該蛋白。同源性分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列含有6 個保守的半胱氨酸殘基，可參與二硫鍵的形成，對高熱下多肽的穩(wěn)定性具有重要作用[16]?？扇苄苑治霭l(fā)現(xiàn)該蛋白主要在大腸桿菌中以包涵體的形式表達，可能由于其與二硫鍵配對的半胱氨酸含量較多，所以易形成包涵體。

SLPs 是一類作用于細胞膜的蛋白，具有作為疫苗候選分子或診斷分子的潛力。據(jù)報道采用肝片吸蟲的重組SLP 蛋白（rFh-SAP-2）免疫小鼠，可獲得81.2%的減蟲率，顯示其是一種潛在的疫苗候選分子[17]；而曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的SLPs 具有良好的反應原性，可以被感染動物（小鼠和兔）的血清和人血清所識別[10]，具有潛在的血清學診斷意義[18]。本研究結果顯示經(jīng)原核表達的rAce-XL-SLP-1 能夠被錫蘭鉤蟲感染的犬陽性血清所識別，顯示其具有作為錫蘭鉤蟲血清學診斷的潛在候選抗原。

近年來，CCK-8 試劑盒因檢測靈敏度高，操作簡單，無需有機溶劑，對細胞無毒性，已廣泛用于細胞增殖的快速檢測。通過該試劑檢測經(jīng)不同濃度rAce-XL-SLP-1 刺激后的犬PBMC 的增殖效應能夠反映該重組蛋白的細胞免疫功能，在有效刺激（SI＞1.5）的情況下，SI 越大，淋巴細胞群體的反應能力和免疫功能越強[19]。Huang 等通過該試劑盒的檢測結果證實錫蘭鉤蟲血小板抑制劑（Ace-HPI）能夠刺激犬PBMC 的增殖和細胞因子的分泌，有助于鉤蟲在宿主體內建立慢性感染[20]。本研究分別將不同濃度的rAce-XL-SLP-1 與PBMC 共孵育時，當該重組蛋白濃度為20 μg/mL 和40 μg/mL 時，PBMC 的SI 明顯高于對照組（P＜0.05）。表明rAce-XL-SLP-1 能夠誘導犬PBMC 的增殖，具有良好的免疫原性，提示rAce-XL-SLP-1 具有作為鉤蟲疫苗候選抗原分子的潛力。

綜上所述，本研究克隆了錫蘭鉤蟲Ace-SLP-1基因，對其編碼的氨基酸序列進行了生物信息學分析后，構建了該基因成熟肽的重組質粒pET-28a-Ace-XL-SLP-1 并誘導表達與純化了rAce-XL-SLP-1，對其免疫學特性進行了初步分析，為鉤蟲病的血清學診斷及鉤蟲疫苗候選分子的篩選與功能學等研究奠定了基礎。