楊木嬌，林 俊，張 娟，王 婉，向文杰，薛 飛，朱遠茂

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由IBR 病毒（IBRV）即牛皰疹病毒1 型（BHV-1）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。IBR 臨床表現(xiàn)以呼吸道疾病為主，伴有結膜炎、流產(chǎn)、死胎、乳房炎、產(chǎn)奶量減少及膿皰性外陰陰道炎或龜頭包皮炎，有時還可誘發(fā)幼牛腦炎。而且IBRV侵入機體后可造成潛伏感染和終身帶毒，使得本病難以根除，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[1]。

IBRV 屬于皰疹病毒科，α 皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，是有囊膜的雙鏈線性DNA 病毒。gE 是由US8 基因編碼的IBRV 結構糖蛋白之一，可刺激機體產(chǎn)生抗體。其在病毒粒子表面及病毒感染細胞表面高水平表達，并在體內(nèi)誘導細胞融合，從而影響病毒的傳播和釋放因此gE 基因缺失。缺失可造成病毒毒力降低，限制病毒在細胞間的傳播，從而降低病毒在體內(nèi)的復制能力[2-3]。IBRV 基因缺失標記疫苗免疫后能有效地保護牛群，如gE-基因缺失苗和gE-/TK-雙基因缺失苗等，而且通過使用gE 基因缺失苗并配套使用gE 抗體檢測試劑盒，可實現(xiàn)鑒別診斷疫苗免疫牛與自然感染牛，有助于控制并消滅該病[4-5]。

桿狀病毒表達系統(tǒng)已被廣泛用于外源蛋白的表達。在大多數(shù)情況下，重組蛋白經(jīng)過翻譯后加工、修飾并轉運至適當?shù)募毎恢煤?，其功能與原蛋白相似。蜂素信號肽（Honeybee melittin signal peptide，HBM）可以介導外源蛋白進入昆蟲細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行翻譯后糖基化修飾，可使外源蛋白分泌至培養(yǎng)上清，同時HBM可提高外源蛋白的表達量[6-7]。因此，本研究利用融合PCR 的方法在gE 基因5'端引入HBM，在Bacto-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中進行表達，并對重組gE蛋白（rgE）進行了反應原性和免疫原性鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料IBRV-8（野毒株）、IBRV-56（gE 缺失株）、MDBK 細胞和Sf21 昆蟲細胞、IBRV-8、IBRV-56 免疫兔血清、 gE 抗體陽性牛血清和陰性牛血、健康山羊血清均由本實驗室保存；供體質(zhì)粒pFastBac1 購自Invitrogen 公司; TOP10 感受態(tài)細胞購自北京索萊寶科技有限公司；DH10Bac 菌株購自北京華奧寶生科技有限公司；6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司。

病毒DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen 公司；膠回收試劑盒、DreamTaqGreen PCR Master Mix（2×）和Prestianed Protein Ladder 均購自Thermo Fisher公司；Prime STAR HS DNA Polymerase、DEPC水、dNTP Mixture、DL2000 和DL5000 DNA Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司；XbaI、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；桿狀病毒穿梭載體bacmid 小量抽提試劑盒和BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天公司；FITC 標記的兔抗牛IgG、HRP 標記的山羊抗鼠IgG 和HRP 標記的兔抗羊IgG 均購自Sigma-Aldrich；Dylight700 標記的山羊抗兔IgG 購自KPL 公司；TMB 購自北京泰天河生物技術有限公司；ELISA 酶標板購自Greiner 公司；Grace Insect Medium 和CellfectinⅡReagent 購自Gibco公司；High Affinity Ni-NTA Resin 購自金斯瑞生物科技公司；山羊抗IBRV血清購自VMRD公司。

1.2 目的基因的擴增將IBRV-8 以1000 TCID50接種于生長狀態(tài)良好的單層MDBK 細胞，于5% CO237 ℃條件下培養(yǎng)約48 h，待細胞出現(xiàn)約80% CPE 時收集病毒液，反復凍融3 次后提取IBRV-8 的基因組DNA。

根據(jù)參考文獻[8]設計擴增HBM 基因片段的引物：HBM-P1: 5'-TCTAGGATCCATGAANATTCTTAGT CAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCG-3'/HBM-P2: 5'-ATCCGCATAGATGTAAGAAATGTATACGACCATAAA AACAAGGGC-3'。HBM-P1 的5'端插入BamH I 酶切位點和起始密碼子ATG，HBM-P1 和HBM-P2 之間有19 bp 互補堿基，可互為模板，采用引物直接退火法擴增HBM 片段。

根據(jù)GenBank中的IBRV基因組序列（NC_001847.1），設計擴增gE 基因片段的引物：gE-p3：5'-TACATCT ATGCGGATCAACCCACCGCGCCG-3'/gE-p4：5'-TAT ATCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTTATATGCA GCCCTAC-3'。在gE-p4 的下游插入6×His 標簽、終止密碼子和XbaI 酶切位點。HBM-P2 下游和gE-p3上游之間有15 bp 的互補堿基。由于IBRV 基因組中G+C 含量高達約72%，所以采用Prime STAR HS DNA Polymerase 進行熱啟動PCR 擴增gE 基因片段，反應程序如下：（1）先將反應管置于PCR 儀中97 ℃預變性7 min，再取出反應管加入Prime STAR HS DNA Polymerase；（2）98 ℃10 s，57 ℃5 s，72 ℃1 min 40 s，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。進一步以HBM 基因片段和gE 基因片段為模板，采用Prime STAR HS DNA Polymerase 進行融合PCR，獲得融合基因片段，命名為rHBM-gE。

1.3 重組桿粒（rBacmid-gE）的構建與鑒定用限制性內(nèi)切酶XbaI 和BamH I 分別對rHBM-gE 片段和轉移載體pFastBac1 進行雙酶切和純化后，用T4 DNA 連接酶將rHBM-gE 連接至質(zhì)粒pFastBac1 中，再轉化至TOP10 感受態(tài)細胞，經(jīng)Amp+平板篩選，挑選陽性菌落過夜振蕩培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒并經(jīng)雙酶切鑒定，將鑒定陽性的重組質(zhì)粒（pFB-rgE）由上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序正確的pFB-rgE 轉化至含有桿粒的DH10Bac 感受態(tài)細胞中，構建重組桿粒。利用pUC/M13F/M13R 通用引物對重組桿粒進行PCR 鑒定，獲得陽性重組桿粒（rBacmid-gE）。

1.4 重組桿狀病毒（rBV）的構建用轉染試劑CellfectinⅡReagent 將rBacmid-gE 轉染對數(shù)生長期的Sf21昆蟲細胞后，于27 ℃培養(yǎng)72 h 至細胞出現(xiàn)病變，即獲得重組桿狀病毒（rBV）。收集上清液，此為P0 代rBV，繼續(xù)擴繁傳代，共培養(yǎng)17 代。提取P4、P7 和P17 代次的rBV 基因組DNA，采用pUCM13F/M13R引物、gE 特異性引物，鑒定gE 基因是否已經(jīng)整合于rBV 中。

1.5 重組gE 蛋白（rgE）的間接免疫熒光（IFA）鑒定將P14 代rBV 接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中處于對數(shù)生長期的Sf21 昆蟲細胞，同時設置未接種的細胞作為空白對照，27 ℃培養(yǎng)72 h，PBST 洗滌后用固定液（甲醇、丙酮1∶1 混合）室溫固定15 min，加入含有5%脫脂乳和3% BSA 的PBST，37 ℃封閉2 h；洗滌后分別加入100 μL 的1∶50 稀釋IBRV 陰、陽性牛血清作為一抗，洗滌后加入1∶200 稀釋的FITC 標記的兔抗牛IgG 作為二抗，37 ℃避光孵育1 h，洗滌后用90%甘油封板，于倒置熒光顯微鏡下觀察是否有綠色熒光。

1.6 rgE 的純化及western blot 鑒定經(jīng)1.4 和1.5鑒定rgE 在rBV 中獲得表達后，對rBV 進行大規(guī)懸浮培養(yǎng)，收集1 L上清液，用High Affinity Ni-NTA Resin 純化后4 ℃過夜透析，使用BCA 試劑盒測定純化后的蛋白濃度。

純化后的rgE 經(jīng)10% SDS-PAGE 電泳后轉印至NC 膜上，4 ℃過夜封閉，洗滌后分別以IBRV-8 和IBRV-56（gE 缺失株）免疫的兔血清（1∶200）、山羊抗IBRV 血清和健康山羊血清（1∶5 000）作為一抗，Dylight700 標記的羊抗兔IgG（1∶10 000）以及HRP 標記的兔抗羊IgG（1∶5 000）為二抗，室溫作用1 h，分別用近紅外光掃描成像系統(tǒng)和化學發(fā)光成像檢測特異性條帶。

1.7 rgE 的免疫原性鑒定將純化的rgE 免疫6 周齡BALB/c 小鼠，4 只為免疫鼠和2 只為對照鼠。每只免疫鼠注射200 μg 的rgE，對照鼠注射等體積的PBS。每兩周免疫一次，共免疫兩次，分別在首免后1 周、2 周和二免后2 周采血，用經(jīng)蔗糖密度梯度純化的IBRV-8 作為包被抗原（3 μg/孔），以待檢鼠血清（1∶50）為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶15 000）為二抗，通過間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體。

2 結 果

2.1 目的基因的PCR擴增結果分別以IBRV全基因組為模板和gE-P3/gE-P4為引物，PCR擴增gE基因片段；HBM-P1和HBM-P2可互為模板，采用引物直接退火法擴增HBM片段，結果分別得到1 756 bp和76 bp目的片段（圖1）。再以gE 和HBM 基因片段為模板進行融合PCR，結果可擴增得到1 830 bp 的融合基因片段rHBM-gE，與預期大小相符（圖1），表明獲得了目的基因片段rHBM-gE。

圖1 目的基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of target genes

2.2 rBacmid-gE 的構建與鑒定結果將測序正確的重組質(zhì)粒pFB-rgE 轉化至含有桿粒的DH10Bac 感受態(tài)細胞中，構建重組桿粒。使用pUCM13F/M13R引物對重組桿粒進行PCR 鑒定。結果顯示，陽性桿?？蓴U增到4 132 bp 的目的條帶（圖2），大小與預期相符。表明獲得了包含rHBM-gE 基因片段的陽性重組桿粒rBacmid-gE。

圖2 rBacmid-gE的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of rBacmid-gE

2.3 rBV 的PCR 鑒定結果提取不同代次rBV 的基因組DNA，分別用pUCM13F/M13R 引物和gE 特異性引物進行PCR 擴增，結果各代次的rBV 均可分別擴增出4 132 bp和1 830 bp的目的基因片段（圖3），表明獲得了已整合gE 基因的rBV，而且rBV 能穩(wěn)定傳代。

圖3 不同代次重組桿狀病毒的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of recombinant baculovirus of different generations

2.4 rBV 的IFA 鑒定結果利用P14 代rBV 感染96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)生長良好的Sf21 細胞， IFA 檢測結果顯示，感染rBV 的Sf21 細胞與gE 抗體陽性牛血清反應并出現(xiàn)綠色熒光（圖4A），綠色熒光信號主要集中在細胞質(zhì)和細胞膜上，而與gE 抗體陰性牛血清不反應（圖4B），同時，未接種rBV 的Sf21 細胞與gE 抗體陽性牛血清不反應（圖4C）。進一步表明獲得了能表達rgE 的rBV，且rgE 蛋白位于Sf21 細胞質(zhì)和細胞膜，可以在Sf21 細胞中合成、加工和運輸。

圖4 rBV的IFA鑒定Fig.4 Identification of rBV by IFA

2.5 rgE 的純化及鑒定結果對rBV 進行PCR 和IFA鑒定后，大量培養(yǎng)rBV，并收集1L 上清液，對rgE進行純化，純化后的rgE 濃度為0.78 mg/mL。

將純化后的rgE 經(jīng)western blot 鑒定，結果顯示rgE 蛋白與IBRV-8 免疫的兔血清和山羊抗IBRV 血清均在約110 ku、68 ku 和55 ku 處呈陽性反應（圖5A 和圖5C），與山羊抗IBRV 陽性血清還在約130 ku 處呈陽性反應（圖5C），與IBRV-56（gE 缺失株）免疫兔血清和健康山羊血清均不反應（圖5B 和圖5D）。表明rgE具有較強的反應原性，且僅與gE抗體反應。

圖5 Western blot檢測rgE的表達Fig.5 Western blot analysis of the rgE expression

2.6 重組蛋白的免疫原性鑒定結果采用間接ELISA 方法檢測rgE 免疫組小鼠和空白對照小鼠的血清抗體水平，結果顯示，首免后1 周免疫鼠即可產(chǎn)生針對rgE 的抗體，免疫鼠首免后1 周、2 周和二免后2 周的血清抗rgE 抗體水平（平均值）均明顯高于對照組小鼠（平均值），且免疫組小鼠抗體水平（平均值）隨著免疫次數(shù)的增加逐漸增高，且后一次血清抗體水平明顯高于前一次；而對照組小鼠的抗體水平（平均值）始終無變化（圖6）。表明rgE 可誘導小鼠產(chǎn)生特異性gE 抗體，具有良好的免疫原性。

圖6 間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體結果Fig.6 The rgE induced of serum antibodies in mice were detected by indirect ELISA

3 討 論

IBRV 常規(guī)疫苗接種的牛與野毒感染的牛通常不能通過血清學檢測區(qū)分開來，對疫苗免疫效果評價帶來了困難，且無法實施IBRV 的清除計劃。gE 對IBRV 復制是非必需的，但它能誘導快速、持久的免疫反應，IBRV gE 基因缺失株雖毒力減弱但仍具有良好的免疫原性，因而gE 常被選作構建基因缺失標記疫苗的可靠候選基因。同時，血清中的gE 特異性抗體可成為鑒別疫苗免疫和自然感染牛的可靠標記[9]。對正在實施IBRV 清除和控制計劃的國家，能區(qū)分疫苗接種和自然感染牛對貿(mào)易限制和監(jiān)督至關重要[10]。此外，使用gE 基因缺失疫苗有可能監(jiān)測到野生型病毒在動物種群中的傳播，并確定其在畜群、地區(qū)和國家中的真正感染率[11]，因為gE 血清轉陽意味著感染了野生型病毒。

有研究表明，原核表達的蛋白因缺乏糖基化修飾而使得gE 蛋白功能無法完全得到呈現(xiàn)，相比原核表達系統(tǒng)，真核表達系統(tǒng)可使表達產(chǎn)物進行翻譯后修飾，使其具有天然的構象[12]。有研究已通過使用桿狀病毒-昆蟲系統(tǒng)和哺乳動物細胞成功截短表達了一些皰疹病毒gE 蛋白[13-16]。由于gE 蛋白包含幾個抗原結構域，因此表達完整蛋白可能會提高gE 抗體的檢測效果[17]。

為了獲得具有完整功能和良好抗原性的IBRV gE 重組蛋白，本實驗利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了gE 基因全長，獲得了能在上清中表達gE 基因的rBV，而且rBV 能穩(wěn)定傳代分泌。IFA 鑒定結果顯示，rBV 感染的Sf21 細胞與gE 抗體陽性牛血清反應可產(chǎn)生特異性免疫熒光，而與gE 抗體陰性牛血清不反應，表明感染細胞表達出了具有生物活性的rgE，且其具有良好反應原性和正確的細胞定位，可以在Sf21 細胞中合成、加工、運輸。這一結果與先前報道的利用桿狀病毒系統(tǒng)表達的BoHV-1糖蛋白的細胞定位結果相吻合[14,18]。本研究大量培養(yǎng)rBV 后收集上清對rgE 進行純化，經(jīng)western blot 試驗表明，rgE 在培養(yǎng)上清中獲得了分泌表達。通過western blot檢測結果可見rgE與gE抗體陽性血清的反應出現(xiàn)了若干不同大小的條帶，其中，與gE抗體陽性兔血清和牛血清的反應均有約110 ku、68 ku 和55 ku 大小的條帶，與羊源IBRV 抗血清的反應后還在約130 ku處有特異性條帶，分析可能是由于rgE 蛋白發(fā)生翻譯后修飾，尤其是糖基化修飾以及糖基化修飾位點和程度不同的結果，從而使rgE 存在若干個異構體，而與gE 抗體陽性兔血清的反應還在170 ku 處有條帶，這可能是因為rgE 發(fā)生了聚集。姜良利用重組桿狀病毒表達系統(tǒng)對大小為1 176 bp 的gE 胞外區(qū)片段進行誘導表達，經(jīng)western blot 和IFA 分析顯示，得到了43 ku 的gE 融合蛋白，該重組蛋白具有良好的免疫原性[19]。AlaaA.El-Kholy 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了BHV-1.1 Abu-Hammad 株的gE 蛋白，獲得了80 ku 的重組gE 蛋白（rBac/gE-AbuH）[10]。據(jù)報道，經(jīng)計算gE 的MWt 約為61 ku，表觀MWt 約為92 ku[20]或94 ku[13]等，區(qū)別在于翻譯后修飾尤其是糖基化的結果。這表明昆蟲細胞中rgE/AbuH 的翻譯后修飾不足，很可能是N-糖基化不足。其他學者在昆蟲細胞中表達IBRV 的gD 蛋白[17]和gE 蛋白[8]時也觀察到類似的不完全加工現(xiàn)象。而本實驗經(jīng)western blot檢測可發(fā)現(xiàn)rgE 異構體的分子量大小分別有68 ku、110 ku、130 ku 等，說明其糖基化修飾應該較為充分，而哪一種異構體的獲得量更多以及糖基化修飾的具體位點，需要進一步研究分析。此外，小鼠在免疫rgE 后可產(chǎn)生結合IRBV-8 的特異性抗體，且隨著免疫次數(shù)的增加和時間的推移，抗體水平也隨之增加，進一步證明rgE 獲得了表達，且具有良好的免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生特異抗體。

綜上所述，本研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)對IBRV 完整gE 蛋白實現(xiàn)了分泌性表達，rgE 具有良好的抗原性，為建立IBRV gE 特異性抗體檢測方法，實現(xiàn)gE 基因缺失疫苗免疫牛和自然感染牛的鑒別診斷別奠定了物質(zhì)基礎，同時為gE 結構和功能的研究奠定了一定的基礎。