白靜茹 白 力 龐春艷 尹芳蕊 張文蘭 王永福（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所，內(nèi)蒙古自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，包頭 014010）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨的進(jìn)行性破壞，最終發(fā)展為關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［1］。細(xì)胞因子在RA 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可介導(dǎo)RA的炎癥產(chǎn)生［2］。此外，滑膜成纖維細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)軟骨表面，產(chǎn)生血管翳，使受損關(guān)節(jié)遭到進(jìn)一步破壞［3-4］。除了免疫紊亂，RA 的發(fā)病還與遺傳、環(huán)境等多種因素相關(guān)［5］。目前RA 的治療以藥物為主，包括非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、改善病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDS）、糖皮質(zhì)激素以及一些生物制劑，如TNF-α 抑制劑、IL-6 抑制劑及Janus 激酶（Janus kinase，JAK）抑制劑等［6］，但均不能完全緩解RA。

活化蛋白C（activated protein C，APC）是由其前體研究蛋白C（protein C，PC）轉(zhuǎn)化而來(lái)的一種天然抗凝血?jiǎng)?，在凝血調(diào)控中起關(guān)鍵作用［7］。APC 不僅具有抗凝血作用，還具有抗炎、抗凋亡、刺激細(xì)胞增殖和屏障穩(wěn)定等特性［8］。既往研究發(fā)現(xiàn)，APC 通過(guò)多種途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，絕大多數(shù)涉及APC 與內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C 受體（endothelial protein C receptor，EPCR）的結(jié)合以及蛋白酶激活受體（protease activated receptor，PAR）的裂解，從而啟動(dòng)下游信號(hào)通路［9-10］。在多種炎癥性模型研究中，APC能夠提供有效的急性或慢性治療，并促進(jìn)機(jī)體各器官的愈合和組織穩(wěn)態(tài)，包括慢性創(chuàng)傷、嚴(yán)重膿毒癥、腦卒中和狼瘡等［11-15］。綜上，本研究采用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型作為RA 疾病模型，初步探討PC對(duì)RA的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 周齡雄性DBA1 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自中國(guó)南京生物醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2 主要試劑與儀器 牛Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）、弗氏完全佐劑（CFA）購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；GV119載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；羊抗EPCR 抗體、熒光標(biāo)記抗羊IgG 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 采用CIA 動(dòng)物模型，8 周齡雄性DBA1小鼠適應(yīng)2周后，在第0天和第21天尾部皮下注射100 μl 1∶1的CⅡ和CFA 乳劑。第2次免疫后，每周對(duì)小鼠進(jìn)行2次關(guān)節(jié)炎臨床癥狀檢查。四肢臨床評(píng)分為0～16 分，對(duì)應(yīng)四肢不同部位紅腫嚴(yán)重程度：0 分=正常關(guān)節(jié)；1 分=趾關(guān)節(jié)輕度紅腫；2 分=趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3 分=趾關(guān)節(jié)至踝關(guān)節(jié)腫脹；4 分=踝關(guān)節(jié)至全部足爪腫脹［16］。對(duì)每只小鼠的四肢進(jìn)行評(píng)估，單只小鼠最高分為16分。

1.2.2 PC預(yù)防性干預(yù) 為了觀察PC能否預(yù)防CIA的發(fā)生，小鼠第1 次免疫后腹腔注射PC 100 μl（0.05 mg/ml），2次/周，持續(xù)3周。

1.2.3 siEPCR 腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定 合成針對(duì)Procr的siRNA靶DNA序列Procr-RNAi（77962-1）、Procr-RNAi（77963-11）、Procr-RNAi（77964-1），以及相應(yīng)陰性對(duì)照序列，引物退火形成雙鏈DNA。利用AgeⅠ、EcoRⅠ酶切GV119 載體，酶切后的載體與退火產(chǎn)物通過(guò)T4 DNA ligase 進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物添加至TOP10 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR 鑒定，將鑒定出的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子測(cè)序，測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提。針對(duì)Procr 基因構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并鑒定，將Procr 過(guò)表達(dá)載體與siProcr 干擾載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)基因敲減情況。

1.2.4 PC 發(fā)病后干預(yù)及siEPCR 腺病毒載體干預(yù) 為了觀察PC 能否緩解CIA 的發(fā)展，小鼠第2 次免疫后第2周開(kāi)始腹腔注射PC 100 μl（0.05 mg/ml），2 次/周，持續(xù)3 周。為明確PC 是否通過(guò)EPCR 發(fā)揮作用，PC 干預(yù)前24 h 腹腔注射siEPCR 腺病毒載體100 μl，1次/周，以EPCR空載體作為同型對(duì)照。

1.2.5 關(guān)節(jié)炎的組織病理學(xué)和關(guān)節(jié)腫脹度評(píng)估針對(duì)PC 預(yù)防性干預(yù)的CIA 小鼠，在第2 次免疫后的第28天處死小鼠，從小鼠后肢取關(guān)節(jié)，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋（5 μm），Micro-CT、HE 染色、甲苯胺藍(lán)染色。針對(duì)PC發(fā)病后干預(yù)的CIA小鼠，在第2次免疫后的第70天處死小鼠，方法同前，Micro-CT、HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅O 染色。關(guān)節(jié)評(píng)分如1.2.1所述。

1.2.6 免疫熒光染色檢測(cè)EPCR 表達(dá) 分離CIA小鼠和DBA1 小鼠滑膜組織進(jìn)行石蠟包埋切片，用羊抗EPCR抗體和熒光標(biāo)記抗羊IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)，在熒光顯微鏡下觀察組織切片。

2 結(jié)果

2.1 PC 預(yù)防性干預(yù)可降低CIA 小鼠的關(guān)節(jié)炎發(fā)生率及疾病嚴(yán)重程度 第2 次免疫后的第7 天到第28天對(duì)小鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎臨床癥狀檢查及評(píng)分，經(jīng)PC 干預(yù)的CIA 小鼠的臨床評(píng)分顯著降低，足爪腫脹程度明顯減輕（圖1A、B）。Micro-CT 結(jié)果顯示，CIA模型組小鼠骨破壞、關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重，而PC干預(yù)組小鼠相對(duì)輕微（圖1C）。HE 染色和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，PC干預(yù)組關(guān)節(jié)間隙變窄、滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨蛋白多糖損失、軟骨侵蝕等情況明顯緩解（圖2）。

圖1 PC干預(yù)后各組小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、關(guān)節(jié)外形及Micro-CTFig.1 Arthritis score，joint shape and Micro-CT of mice in each group after PC intervention

圖2 PC干預(yù)后各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)改變（×20）Fig.2 Pathological morphological changes of joint tissues of mice in each group after PC intervention（×20）

2.2 EPCR 在小鼠滑膜組織中的表達(dá)情況 免疫熒光切片檢測(cè)小鼠滑膜組織中EPCR 的表達(dá)。結(jié)果顯示，在CIA 小鼠和DBA1 小鼠的關(guān)節(jié)滑膜組織中存在顯著的EPCR 表達(dá)，且CIA 小鼠EPCR 表達(dá)明顯低于DBA1對(duì)照組（圖3）。

圖3 EPCR在CIA小鼠和DBA1小鼠滑膜組織中的表達(dá)Fig.3 Expressions of EPCR in synovial tissue of CIA and DBA1 mice

2.3 siEPCR腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 Procr-RNAi（77964-1）靶點(diǎn)對(duì)目的基因的表達(dá)有敲減作用，因而是有效靶點(diǎn)（圖4）。

2.4 siEPCR 逆轉(zhuǎn)PC 的保護(hù)作用 與CIA 模型組相比，PC+空載體干預(yù)組小鼠臨床評(píng)分降低，關(guān)節(jié)炎癥狀得到緩解，而PC+siEPCR 腺病毒載體干預(yù)組小鼠無(wú)明顯治療效果，足腫脹仍較為嚴(yán)重（圖5A、B）。Micro-CT 結(jié)果顯示，與CIA 模型組相比，PC+空載體干預(yù)組小鼠的骨侵蝕、關(guān)節(jié)腫脹減輕，而PC+siEPCR腺病毒載體干預(yù)組小鼠仍表現(xiàn)為明顯的關(guān)節(jié)膨大、關(guān)節(jié)間隙縮窄（圖5C）。HE 染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅O 染色結(jié)果顯示，PC+siEPCR 腺病毒載體干預(yù)組小鼠有明顯的關(guān)節(jié)面破壞、滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、基質(zhì)蛋白多糖損失（圖6）。提示siEPCR 可逆轉(zhuǎn)PC 的保護(hù)作用。

圖5 PC+siEPCR 干預(yù)后各組小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、關(guān)節(jié)外形及Micro-CTFig.5 Arthritis score，joint shape and Micro-CT of mice in each group after PC+siEPCR intervention

圖6 PC+siEPCR 干預(yù)后各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)改變（×20）Fig.6 Pathological morphological changes of joint tissues of mice in each group after PC+siEPCR interven?tion（×20）

3 討論

既往研究表明，PC在炎癥性模型中能提供有效的急性或慢性治療［11］。2001 年的研究發(fā)現(xiàn)，重組人APC（rhAPC）治療可顯著降低嚴(yán)重膿毒癥患者的病死率，因此FDA 批準(zhǔn)rhAPC 進(jìn)入臨床［17］，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，rhAPC 無(wú)法降低嚴(yán)重膿毒血癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，相反，證實(shí)rhAPC 治療會(huì)增加出血性副作用，rhAPC 在膿毒血癥患者中的療效因此受到質(zhì)疑，最終rhAPC 退出市場(chǎng)［18］。隨著APC 作為一種抗菌劑的重新上市，人們開(kāi)始關(guān)注其抗凝以外的其他作用，包括抗炎、抗凋亡、細(xì)胞保護(hù)作用等。本研究應(yīng)用CIA 小鼠預(yù)防性給予PC，結(jié)果顯示PC 治療可有效降低關(guān)節(jié)炎發(fā)生率及疾病嚴(yán)重程度。發(fā)病后干預(yù)同樣可延緩關(guān)節(jié)炎發(fā)展，但治療效果較發(fā)病前干預(yù)差。

EPCR 是一種跨膜糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型中均有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)EPCR 促進(jìn)PC 向APC 轉(zhuǎn)化，在抗凝途徑中發(fā)揮作用，并作為APC 裂解PAR 的共受體，參與其誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)信號(hào)傳遞［19-20］。APC-EPCR已被證實(shí)在炎癥性腸病、缺血性腦卒中、糖尿病腎病等各種炎癥性疾病及自身免疫性疾病中發(fā)揮作用［21-23］。有研究發(fā)現(xiàn)，EPCR 在RA和骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中存在異常表達(dá)，且在CIA 小鼠滑膜組織中檢測(cè)到了EPCR 表達(dá)［24-26］。與預(yù)期一致，本研究發(fā)現(xiàn)EPCR 在CIA 小鼠和DBA1小鼠的關(guān)節(jié)滑膜組織中顯著表達(dá)，且CIA 小鼠EPCR表達(dá)明顯低于DBA1 對(duì)照組。為了驗(yàn)證EPCR 在PC治療中的意義，本研究采用siEPCR 腺病毒載體干預(yù)CIA 小鼠，下調(diào)EPCR 表達(dá)，siEPCR 逆轉(zhuǎn)了PC 的保護(hù)作用，CIA 小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀未能得到有效緩解。因此推測(cè)PC 可能通過(guò)EPCR 在CIA 中發(fā)揮作用，發(fā)病后干預(yù)治療效果較發(fā)病前干預(yù)差，可能與EPCR表達(dá)差異有關(guān)。

綜上所述，PC干預(yù)可緩解CIA疾病進(jìn)展，而EPCR是PC發(fā)揮作用的通路依賴(lài)蛋白。在未來(lái)的研究中，可通過(guò)PC 靶向滑膜成纖維細(xì)胞、T 細(xì)胞等進(jìn)行進(jìn)一步分析，對(duì)PC-EPCR 下游信號(hào)機(jī)制更深入的了解可能會(huì)為治療RA提供新的見(jiàn)解。