馬 靜，王紅磊，王梓萱，李昕宇，李美秀，吳 勇，劉禹佳，盧國(guó)棟，周 靜

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530200；3.廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理教研室，廣西 南寧 530021)

原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在全球腫瘤致死率統(tǒng)計(jì)中肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)居世界第四位[1]。早期診斷是提高肝癌病人存活率，延長(zhǎng)生存期的關(guān)鍵。然而，由于原發(fā)性肝癌起病隱匿，出現(xiàn)癥狀時(shí)大部分已為中晚期。目前外科手術(shù)是治療肝癌的有效策略之一，但是由于術(shù)后仍有較高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，所以藥物治療仍是治療肝癌不可或缺的手段。臨床一線靶向化療藥物如阿霉素、卡培他濱、索拉菲尼、樂(lè)伐替尼等對(duì)肝癌患者的生存和治療都有明顯的效果[2]，但化療藥物的毒副作用和耐藥性也已成為腫瘤治療效果和良好預(yù)后的一大難題[3]。我國(guó)傳統(tǒng)中草藥具有毒副作用小、多靶點(diǎn)和整體性的特點(diǎn)，可通過(guò)抑制腫瘤的生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和降低腫瘤細(xì)胞耐藥性等方式，達(dá)到中草藥的抗腫瘤作用[4]。雷公藤紅素(celastrol)，是衛(wèi)矛科雷公藤根莖的提取物，是一種五環(huán)三萜類化合物，有研究表明雷公藤紅素在抗炎、減肥、治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、心血管、抗腫瘤等方面都有很好的治療作用[5-6]，其中雷公藤紅素的抗腫瘤作用主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等達(dá)到抗腫瘤效果[7]。本研究主要探討雷公藤紅素作用后引起肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的不斷升高，造成細(xì)胞DNA損傷，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗癌作用的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑細(xì)胞株：人肝癌 HepG2細(xì)胞 和 Huh7細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))。主要試劑：雷公藤紅素，純度：>99%(貨號(hào)：219465，美國(guó)Sigma公司)；噻唑藍(lán)(MTT，碧云天生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11995500BT)，胎牛血清(貨號(hào)：10099141)，(美國(guó) Life Sciences 公司)；二甲亞砜(DMSO，貨號(hào)：0219605580，美國(guó)MP Biomedicals 公司)；GAPDH(貨號(hào)：SC-32233)，(美國(guó)Santa Cruz 公司)；α-tubulin抗體(貨號(hào)：T-5168)，碘化丙啶(propidium iodide，PI，貨號(hào)：P4170)，NAC (N-Acetyl-L-cysteine，NAC，貨號(hào):A7250)，Hoechst 33258(貨號(hào)：94403)，(美國(guó)Sigma 公司)；caspase-3抗體(貨號(hào)：9668S),PARP抗體(貨號(hào)：9532),γ-H2AX(貨號(hào)：9718)(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)選取兩種肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7細(xì)胞，使用時(shí)加10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，CO2通氣量5%，濕度飽和。隔天傳代，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.3 光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以2×105·L-1細(xì)胞數(shù)接種肝癌細(xì)胞，分別設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組(DMSO)和雷公藤紅素組(2 μmol·L-1)，作用時(shí)間24 h，然后用倒置光學(xué)顯微鏡觀察肝癌細(xì)胞形態(tài)改變情況。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)約為6×103(每孔液體體積100 μL)，接種于96孔板中，設(shè)空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(DMSO)和雷公藤紅素組(雷公藤紅素濃度分別為：0.5、1、2 μmol·L-1)，培養(yǎng)24 h以后，按照MTT檢測(cè)步驟進(jìn)行培養(yǎng)：每孔再加入 10 μL MTT，孵育 2 h 后吸去96孔內(nèi)液體，再加入DMSO(100 μL)，放置到37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值(490 nm)。根據(jù)公式計(jì)算存活率：細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD490 nm-空白組OD490 nm)/(細(xì)胞對(duì)照組OD490 nm-空白組OD490 nm)×100%(以上實(shí)驗(yàn)各重復(fù)3次)。

1.5 CM-H2DCFDA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROSCM-H2DCFDA為活性氧(reactive oxygen species，ROS )的細(xì)胞滲透性指示劑，加入反應(yīng)后可將其醋酸基團(tuán)去除掉，指示劑發(fā)出紅色熒光，紅色熒光的強(qiáng)弱可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平的高低。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為：溶劑對(duì)照組(DMSO)，雷公藤紅素組(雷公藤紅素濃度分別為：0.5、1、2 μmol·L-1)，抗氧化劑組(NAC 5 mmol·L-1)，雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑NAC組(Celastrol 2 μmol·L-1+NAC 5 mmol·L-1)，雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑組先給予5 mmol·L-1的NAC預(yù)處理1 h，后再與雷公藤紅素共培養(yǎng)24 h，然后收取各組細(xì)胞，加入500 μL CM-H2DCFDA探針稀釋液重懸細(xì)胞，避光孵育時(shí)間20～30 min，然后流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.6 免疫熒光檢測(cè)DNA損傷的標(biāo)志產(chǎn)物γ-H2AX制備細(xì)胞懸液，6孔板內(nèi)種板細(xì)胞數(shù)為 2×108·L-1，每孔體積為2 mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為：細(xì)胞對(duì)照組(DMSO)，雷公藤紅素組(celastrol 2 μmol·L-1)，抗氧化劑組(NAC 5 mmol·L-1)，雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑組(celastrol 2 μmol·L-1+NAC 5 mmol·L-1)，藥物聯(lián)合組先給予NAC (5 mmol·L-1)預(yù)處理1 h，再與雷公藤紅素組共培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)。去上清，冰乙醇(70%)固定30 min，TBS漂洗，0.3%的Triton X-100破膜15 min，羊血清封閉約1 h，然后加入一抗，放4 ℃冰箱孵育12～18 h；熒光標(biāo)記二抗避光孵育1 h，接著用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，然后采用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照并用ImageJ 對(duì)γ-H2AX熒光進(jìn)行定量分析。

1.7 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡制備細(xì)胞懸濁液，種植6孔板內(nèi)，每孔體積為2 mL。分別設(shè)置為：細(xì)胞對(duì)照組(DMSO)、雷公藤紅素組(celastrol 2 μmol·L-1)、抗氧化劑組(NAC 5 mmol·L-1)、雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑NAC組(celastrol 2 μmol·L-1+NAC 5 mmol·L-1)，24 h后終止培養(yǎng)，PBS清洗，加入培養(yǎng)液和Hoechst 33258工作液(終濃度100 μmol·L-1)，室溫染色30 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡制備細(xì)胞懸液，種植細(xì)胞于6孔板。分別設(shè)置為：溶劑對(duì)照組(DMSO)、雷公藤紅素組(celastrol 2 μmol·L-1)、抗氧化劑組(NAC 5 mmol·L-1)、雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑組(celastrol 2 μmol·L-1+NAC 5 mmol·L-1)，各組均處理24 h，收取各組細(xì)胞，加入2 mL(濃度為5 mg·L-1)的PI染液混勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平制備細(xì)胞懸液，種板細(xì)胞到60 mm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。按預(yù)設(shè)的藥物濃度和時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞處理，加入SDS裂解緩沖液，放置到冰上裂解，裂解時(shí)間大約20 min。然后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣電泳后轉(zhuǎn)膜。牛奶封閉液封閉時(shí)間大約1 h，孵一抗，然后放4 ℃冰箱(時(shí)間：12～18 h)，一抗抗體分別為胱天蛋白酶3(caspase-3)、PARP、γ-H2AX、GAPDH、α-tubulin。孵育二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，然后使用i-Bright FL1000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影定影。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素對(duì)肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞形態(tài)的作用顯微鏡下觀察，肝癌細(xì)胞對(duì)照組貼壁生長(zhǎng)情況良好，表現(xiàn)為細(xì)胞大小均一，形態(tài)比較規(guī)則，生長(zhǎng)速度旺盛。而雷公藤紅素組(2 μmol·L-1)處理24 h后，發(fā)現(xiàn)HepG2和Huh7細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的皺縮，細(xì)胞間連接逐漸消失，細(xì)胞變圓、空泡化、脫落等現(xiàn)象出現(xiàn)(Fig 1)。

Fig 1 Effect of celastrol on liver cancer cell morphology

2.2 雷公藤紅素對(duì)HepG2和Huh7細(xì)胞存活的影響經(jīng)不同濃度雷公藤紅素作用24 h后，檢測(cè)兩種肝癌細(xì)胞存活率(Fig 2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到，低濃度雷公藤紅素對(duì)兩種肝癌細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯的抑制作用，但隨著雷公藤紅素濃度的增加，雷公藤紅素對(duì)兩種肝癌細(xì)胞的抑制作用明顯加強(qiáng)，并且呈濃度依賴性關(guān)系(P<0.05，P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of celastrol on cell viability of liver cancer cells

2.3 雷公藤紅素作用HepG2細(xì)胞后肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響HepG2細(xì)胞經(jīng)不同濃度雷公藤紅素處理24 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著雷公藤紅素濃度增加，肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(Fig 3 A,B)(P<0.05)；而聯(lián)合抗氧化劑NAC作用后，與單獨(dú)藥物組相比，雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑NAC組細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯降低(Fig 3C,D)(P<0.05,P<0.01)。

2.4 雷公藤紅素依賴ROS水平升高誘導(dǎo)DNA損傷免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到(Fig 4A)，HepG2細(xì)胞在雷公藤紅素作用12 h后，與對(duì)照組比較，雷公藤紅素組細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX的積累增加(P<0.05)，表明雷公藤紅素作用可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷；而雷公藤紅素聯(lián)合抗氧化劑NAC作用后，與單獨(dú)藥物組相比γ-H2AX的熒光強(qiáng)度則明顯降低(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，隨著雷公藤紅素藥物作用時(shí)間的增加，雷公藤紅素組細(xì)胞內(nèi)DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX的表達(dá)相比對(duì)照組明顯增多(P<0.05)(Fig 4B)；而抗氧化劑NAC可明顯抑制雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的高表達(dá)(P<0.01)(Fig 4C)。

2.5 雷公藤紅素引起ROS升高從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Hoechst 33258染色觀察到(Fig 5A)，肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)染色均質(zhì)、淡藍(lán)色的熒光，細(xì)胞核染色質(zhì)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯改變；肝癌細(xì)胞經(jīng)雷公藤紅素處理24 h后，肝癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)的固縮、細(xì)胞核的碎裂和溶解等典型的凋亡現(xiàn)象，在聯(lián)合抗氧化劑NAC后，逆轉(zhuǎn)了核染色質(zhì)的改變。PI活染測(cè)定細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗氧化劑NAC明顯保護(hù)了雷公藤紅素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞HepG2的死亡(P<0.01)(Fig 5B)；Western blot檢測(cè)的結(jié)果表明(Fig 5C)，與對(duì)照組比較，隨著雷公藤紅素濃度升高，HepG2細(xì)胞內(nèi)初始狀態(tài)的caspase-3明顯減少(P<0.01)；cleaved-PARP明顯增多(P<0.01)，提示PARP被激活的caspase-3切割；與同濃度雷公藤紅素單獨(dú)作用比較，聯(lián)合抗氧化劑NAC可明顯抑制雷公藤紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)了caspase-3、和cleaved-PARP蛋白的改變(P<0.01，P<0.01)(Fig 5D)。

Fig 3 Effect of celastrol on intracellular ROS level in HCC

3 討論

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)編制并發(fā)布了2018年的GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)HCC發(fā)病率占原發(fā)性肝癌的 75%～85%，也是全球最常見的發(fā)病腫瘤之一[8]。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與清除處于一個(gè)相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[9]。低水平的ROS有利于細(xì)胞的生存，但高水平的ROS可通過(guò)氧化損傷反應(yīng)殺傷細(xì)胞，從而觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡[10]，其他相關(guān)研究也表明,ROS的水平與各種形式的細(xì)胞死亡方式均存在一定關(guān)系[11]。

雷公藤紅素是中藥雷公藤提取物中的單體，屬于醌甲基三萜類化合物。研究文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素在減肥、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、治療神經(jīng)退行性疾病、抗腫瘤等方面都有很好的藥理活性[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞經(jīng)雷公藤紅素作用24 h后，肝癌細(xì)胞有形態(tài)變圓，細(xì)胞膜皺縮等顯著變化，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞存活率明顯下降；提示雷公藤紅素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯殺傷作用。

在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷公藤紅素作用后，肝癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平呈劑量依賴性增加。ROS是公認(rèn)的DNA損傷的介質(zhì)，它可以誘導(dǎo)DNA損傷并影響DNA損傷反應(yīng)[13]，可通過(guò)氧自由基誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂；或者誘導(dǎo)線粒體DNA的損傷，引起線粒體DNA的斷裂和降解[14]。DNA雙鏈斷裂后會(huì)在DNA雙鏈斷裂點(diǎn)處形成DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX的聚集[15]，γ-H2AX蛋白主要識(shí)別損傷后的DNA，它在保持基因組的完整性和穩(wěn)定性中具有重要作用，因此γ-H2AX成為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志[16]。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到雷公藤紅素組γ-H2AX的熒光強(qiáng)度相比對(duì)照組明顯增強(qiáng)，表明雷公藤紅素作用后引起細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈的斷裂，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX聚集到DNA斷裂處；更為重要的是，本課題的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論，雷公藤紅素組與對(duì)照組相比，γ-H2AX的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化的H2AX蛋白表達(dá)水平越高，表明DNA損傷程度加重；而在加入抗氧化劑NAC后，反轉(zhuǎn)了以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由此說(shuō)明，肝癌細(xì)胞的DNA損傷是由于雷公藤紅素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的不斷增加引起的。

Fig 4 Celastrol induced ROS-dependent DNA damage

Hoechst染色實(shí)驗(yàn)觀察到雷公藤紅素組細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核碎裂和溶解等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵酶caspase-3可激活下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]，細(xì)胞凋亡核心成員半胱天冬酶(caspase)的切割底物PARP[18]，底物PARP的被剪切認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的另一個(gè)重要指標(biāo)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨雷公藤紅素濃度的增加，初始狀態(tài)的caspase-3表達(dá)水平顯著降低，提示caspase-3被激活，PARP被切割部分明顯增加；聯(lián)合抗氧化劑NAC作用后，反轉(zhuǎn)了caspase-3和PARP蛋白表達(dá)水平的改變。故肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS積聚所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡為雷公藤紅素殺傷肝癌細(xì)胞的主要作用機(jī)制。

Fig 5 Celastrol induced apoptosis by ROS accumulation

為了檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)肝癌細(xì)胞是否具有一定的特異性，本研究也檢測(cè)了雷公藤紅素對(duì)正常的肝細(xì)胞株HL-7702細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在使用高濃度雷公藤紅素時(shí)，HL-7702的存活率有所降低；更重要的是，雷公藤紅素作用HL-7702細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)明顯增加?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果提示ROS升高是雷公藤紅素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的主要原因，由此推測(cè)雷公藤紅素可作為靶向殺傷癌細(xì)胞的有效候選單體。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論共同證明了雷公藤紅素可通過(guò)肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS的水平不斷升高導(dǎo)致DNA損傷，從而引起癌細(xì)胞凋亡，本研究發(fā)現(xiàn)為今后進(jìn)一步研究雷公藤紅素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞死亡的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。