董星宇，朱 婷，李白坤，王 萌，朱繼民，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學1.藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.中醫(yī)學院、4.生命科學學院，安徽 合肥 230012)

炎癥微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要促進作用[1-3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的重要成分。研究顯示，低劑量LPS可增加炎癥基因表達并促進小鼠肝細胞癌(hepatocellular cancer，HCC)的發(fā)展，而高水平LPS循環(huán)可促使慢性肝病患者發(fā)生HCC[4]。腫瘤血管新生可能是慢性炎癥與腫瘤發(fā)展之間的重要橋梁[5-6]。白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)是重要的炎性細胞因子，其中IL-1β是血管生成開始的主要效應(yīng)分子，能促使腫瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。VEGF與內(nèi)皮細胞膜表面血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial cell growth factor receptor 2，VEGFR2)結(jié)合，協(xié)同促進血管生成[7]。炎癥微環(huán)境和血管新生為腫瘤細胞增殖提供了有利條件，抗腫瘤血管生成是治療惡性腫瘤的重要手段之一[8]。但抗血管生成藥物不良反應(yīng)較多、治療效果不明顯[9]。中藥配合抗血管生成藥物不但可以減輕藥物帶來的副作用，而且能降低腫瘤微血管密度[10]。華蟾素注射液(cinobufocini，CB)具有抗炎、抗腫瘤的功效[11]，推測其在發(fā)揮抗肝癌作用的同時，可通過改善肝癌炎癥微環(huán)境，抑制血管新生，進而增強其抗癌作用。本研究采用細胞實驗，初步探討華蟾素注射液對肝癌炎癥微環(huán)境中炎性因子表達水平，及對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)增殖、遷移與血管生成的影響，從而為腫瘤的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批號181006-2)，LPS(北京蘭杰柯科技有限公司，批號BS904)、CCK-8溶液(北京蘭杰柯科技有限公司，批號69112500)、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號MM-0179H2)、Matrigel(美國Corning公司，批號356234)、VEGF-C(美國CST公司，批號2)、VEGFR2(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號67407-1-1g)、SPARKscript Ⅱ RT Plus Kit(山東思科捷生物技術(shù)有限公司，批號AUKLE)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、細胞培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)、酶標儀(美國MD公司)、電泳儀、電泳槽(美國Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(廣州博鷺騰生物技術(shù)有限公司)、實時PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人源肝癌細胞HepG2和HUVEC由中國科學院上海細胞庫惠贈。用含有10%胎牛血清(美國Gibco，批號2254375CP)和1%青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天，批號040221210504)的DMEM培養(yǎng)基(普諾賽公司，批號PM150210)培養(yǎng)細胞。所有細胞株在37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法篩選CB最適給藥濃度 將HepG2細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5 000個。待細胞貼壁后，隨機設(shè)置對照組、給藥組、空白組，每組設(shè)6個復孔。給藥組設(shè)7個CB濃度：0.019、0.038、0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 mg·L-1。藥物處理后放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，最后使用酶標儀于490 nm處檢測每孔吸光度值。實驗重復3次。

1.2.3MTT法篩選LPS最適作用濃度 將HepG2細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5 000個。待細胞貼壁后，隨機設(shè)置對照組和LPS組，共設(shè)9個LPS濃度：2.5、5、10、20、40、80、160、320、640 mg·L-1。每組設(shè)6個復孔。藥物作用24 h后使用酶標儀于490 nm處檢測每孔吸光度值。具體方法同“1.2.2”。

1.2.4HepG2條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)的制備 待培養(yǎng)瓶中HepG2細胞匯合度達到80%以上時，將完全培養(yǎng)基分別更換成無血清培養(yǎng)基、加LPS的無血清培養(yǎng)基、加LPS和CB的無血清培養(yǎng)基(LPS作用細胞24 h后加CB)。24 h后用無菌離心管收集培養(yǎng)基，800g離心10 min以去除細胞碎片和雜質(zhì)，最后用無菌注射器吸取離心后的上清，并使用一次性針孔過濾器(0.22 μm)去除上清中可能含有的細菌。置于-80 ℃冰箱中保存。后文對應(yīng)CM依次簡寫為H-CM、HL-CM、HLC-CM。使用前1 d轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱。

1.2.5ELISA法檢測IL-1β水平 按照試劑盒的操作說明書操作，使用酶標儀于450 nm波長處檢測3種CM中IL-1β的吸光度，每組3個復孔，根據(jù)標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算不同的CM中IL-1β濃度值。

1.2.6CCK8法檢測HUVEC增殖情況 將HUVEC細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔6 000個。待細胞貼壁后，隨機設(shè)置control(DMEM)、H-CM 、HL-CM、HLC-CM。每組4個復孔，每孔反應(yīng)體積為100 μL。24 h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。使用酶標儀于450 nm波長處檢測每孔的吸光度值。

1.2.7HUVEC的體外遷移實驗 將HUVEC細胞接種于6孔培養(yǎng)板，5×105個/孔。細胞匯合度達到80%以上后，棄去孔中培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗后使用黃槍頭在孔的正中央倚靠直尺畫一條筆直的線，再用PBS清洗劃痕處去除殘留的細胞碎片。隨機分組。依次加入DMEM培養(yǎng)基、H-CM、HL-CM、HLC-CM。此時記為0 h，在顯微鏡下隨機選取不同的視野拍照，24 h后再次拍照記錄。

1.2.8HUVEC的體外成管實驗 將HUVEC接種于6孔培養(yǎng)板，5×105個/孔。待細胞貼壁后，棄去原來培養(yǎng)基，更換為H-CM、HL-CM、HLC-CM，培養(yǎng)24 h后制成細胞懸液待用。在另一塊96孔培養(yǎng)板中加入50 μL Matrigel，注意膠鋪滿孔底部并且無氣泡，放入細胞培養(yǎng)箱等Matrigel凝固后取出培養(yǎng)板，將不同組的細胞懸液加入孔中，隨后將培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3 h后在倒置顯微鏡下觀察HUVEC成管情況并拍照。

1.2.9RT-qPCR法檢測血管生成基因的mRNA表達水平 將HUVEC接種在75 cm2培養(yǎng)皿中，待細胞匯合程度達到70%～80%以上時，將完全培養(yǎng)基依次更換為無血清培養(yǎng)基、H-CM、HL-CM、HLC-CM。24 h后用TRIzol提取RNA，核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，1次；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。目的基因及內(nèi)參基因(β-Actin)引物序列詳見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primer

1.2.10WB法檢測血管生成蛋白表達水平 將HUVEC接種在75 cm2培養(yǎng)皿中，待細胞匯合程度達到70%～80%以上時，將完全培養(yǎng)基依次更換為無血清培養(yǎng)基、H-CM、HL-CM、HLC-CM。24 h后棄去皿中培養(yǎng)基加細胞裂解液靜置15 min，收集皿中液體超聲離心后取上清，BCA法測蛋白濃度。蛋白經(jīng)凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉后，依次進行一抗、二抗孵育。最后使用超敏ECL底物化學發(fā)光檢測試劑盒顯色，自動凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。采用ImageJ軟件測定其灰度值，計算其相對表達量，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 CB對HepG2增殖的影響CB處理24 h后，HepG2細胞活力降低且具有一定的劑量依賴特征。其中0.075、0.15、0.3 mg·L-1CB作用后細胞活力分別降至67.9%、57.8%、50.6%，0.3 mg·L-1的抑制率接近50%(Fig 1)。故本文將0.3 mg·L-1CB作用細胞24 h作為藥物使用濃度和作用時間。

Fig 1 Effect of CB on proliferation of

2.2 LPS對HepG2活力的影響Fig 2結(jié)果顯示，從2.5 到160 mg·L-17個濃度的LPS均使HepG2細胞活力明顯增加(P<0.05)，而320、640 mg·L-1的LPS對HepG2活力的影響較小，但2.5 mg·L-1的LPS可使HepG2細胞存活率在24 h內(nèi)達到最大(326%，F(xiàn)ig 2)。

Fig 2 Effect of LPS on viability of

2.3 CB對HepG2炎性因子表達水平的影響HL-CM組IL-1β表達水平最高，與H-CM組相比差異有統(tǒng)計學意義，而HLC-CM組IL-1β的濃度明顯低于HL-CM組(Fig 3)。提示CB可抑制LPS誘導的肝細胞癌炎性因子分泌。

2.4 間接共培養(yǎng)對HUVEC增殖力的影響結(jié)果顯示，H-CM和HL-CM可促進HUVEC增殖，而HLC-CM則抑制了HUVEC增殖。表現(xiàn)為HL-CM組細胞相對增殖率24 h內(nèi)達到最大(約178%)，與H-CM組相比差異具有統(tǒng)計學意義；而HLC-CM組的相對增殖率(約95%)較HL-CM組明顯降低(Fig 4)。

Fig 3 Concentration of IL-1β in conditioned

Fig 4 Effect of conditioned medium on HUVEC**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs H-CM group;△△P<0.01 vs HL-CM group.

2.5 間接共培養(yǎng)對HUVEC遷移力的影響結(jié)果顯示，24 h內(nèi)不同組HUVEC劃痕面積變化不同。其中，HL-CM組24 h時HUVEC劃痕面積最小，H-CM組的劃痕面積多于HL-CM組；而HLC-CM組24 h內(nèi)劃痕面積變化不明顯，其劃痕面積明顯多于HL-CM組，HLC-CM可能抑制了HUVEC遷移(Fig 5)。

2.6 間接共培養(yǎng)對HUVEC血管網(wǎng)絡(luò)形成的影響結(jié)果顯示，3 h后，H-CM、HL-CM組有明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，其中HL-CM的網(wǎng)眼數(shù)目明顯多于H-CM組(P<0.05)；Control組的網(wǎng)眼數(shù)目明顯少于H-CM組；而HLC-CM組形成的網(wǎng)眼數(shù)目則較少，HLC-CM明顯少于HL-CM組，差異具有統(tǒng)計學意義(Fig 6)。

2.7 間接共培養(yǎng)對HUVEC VEGF、VEGFR2 mRNA表達水平的影響四組間兩種mRNA的表達水平趨勢相似，均為HL-CM組最高，其次為H-CM組，而HLC-CM和Control組則相對低，組間差異有統(tǒng)計學意義(Fig 7A)。

2.8 間接共培養(yǎng)對HUVEC VEGF、VEGFR2蛋白水平的影響與mRNA的表達水平相似，VEGF-C、VEGFR2在四組間的表達水平差異有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為HL-CM組最多，H-CM組次之；而HLC-CM與Control組的表達水平則較低(Fig 7B)。

Fig 5 Effect of indirect co-cultivation on HUVEC

Fig 6 Effect of indirect co-culture on HUVEC

Fig 7 Effect of indirect co-culture on expression levels of HUVEC angiogenesis-related genes and

3 討論

肝細胞癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，慢性炎癥是其重要的病理特征[12]。抗腫瘤血管生成是肝癌治療的重要手段之一，但是藥物帶來的副反應(yīng)、患者易產(chǎn)生耐藥性促使著治療方案的改進[13]。CB是從中華大蟾蜍全皮中提取的一種天然活物質(zhì)，具有良好的抗感染、抗炎、抗癌效果[14]。研究發(fā)現(xiàn)CB能夠選擇性作用于腫瘤細胞及惡性腫瘤血管，抑制其生長和增殖[15]，并能夠抑制肺腺癌NF-κB通路，進而下調(diào)IL-6、IL-8等炎性因子水平發(fā)揮抗炎抗腫瘤的作用[16]。但CB對肝癌炎癥微環(huán)境中血管生成的抑制作用和具體機制尚不明確。

腫瘤血管生成是肝癌的標志之一，此過程涉及到肝癌細胞與內(nèi)皮細胞及肝癌微環(huán)境之間的相互作用[17]。在炎癥微環(huán)境中，肝癌細胞自身會分泌大量的炎性因子，炎癥因子誘導腫瘤細胞產(chǎn)生VEGF等血管生成因子，VEGF能夠與內(nèi)皮細胞表面的相關(guān)受體如VEGFR2結(jié)合，激活VEGF/VEGFR2信號通路，促進了內(nèi)皮細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成[18]。本研究使用ELISA試劑盒檢測了三種肝癌細胞HepG2條件培養(yǎng)基中IL-1β的水平，發(fā)現(xiàn)LPS誘導后HepG2分泌更高水平的炎性因子，而CB能抑制炎性因子的水平。

接下來本研究基于HUVEC這一體外血管生成模型檢測了其在正常培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下的增殖力、遷移力和成管力，并檢測了HUVEC在不同干預下 VEGF-C、VEGFR2 mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)組比較H-CM促進HUVEC增殖、遷移、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成；HL-CM進一步提高了HUVEC的增殖力、遷移力和成管能力；而HLC-CM作用與前兩組相反。提示LPS可能通過升高炎性因子水平，進而增強了HUVEC的增殖力、遷移力和成管能力，而CB能抑制LPS作用后HUVEC增殖力、遷移力、成管能力的增強。RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明，與H-CM組相比HL-CM組HUVEC VEGF-C、VEGFR2 mRNA與蛋白水平均明顯上升，而HLC-CM組的VEGF-C、VEGFR2 mRNA和蛋白水平則相應(yīng)降低，本研究結(jié)果與胡葉等[15-16]相似。

可見，肝癌炎癥微環(huán)境可能存在著細胞因子與HUVEC相互作用，從而促進了HUVEC增殖和血管生成，滿足了肝癌細胞對營養(yǎng)、氧氣等物質(zhì)的需求，進而促進肝癌細胞發(fā)展，而炎癥微環(huán)境在此過程中可能起著催化劑的作用；CB則降低炎性因子表達，改善腫瘤炎癥微環(huán)境，從而抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗癌作用。