鄭雪芳，王梓然，朱育菁，陳燕萍，王階平，劉 波

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2. 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361102）

0 引言

【研究意義】由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的番茄青枯病是一種毀滅性土傳病害[1]，在全國各番茄種植區(qū)域普遍發(fā)生，尚無有效的藥劑防治，主要依靠抗病品種、嫁接苗、栽培措施等。青枯菌在自然界中存在致病力分化現(xiàn)象[2-4]，其無致病力突變株可以侵染植株，不引起寄主植物產(chǎn)生病害，具有重要的生防應(yīng)用潛力[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】青枯菌無致病力菌株及其作用機制有許多報道[6-9]。Frey等[6]用hrp-突變體防治番茄青枯病，病情指數(shù)比對照降低80%，并推遲25 d發(fā)病。楊宇紅等[7]研究表明，無致病力青枯菌hrp-突變體對致病性青枯菌雖無直接抑制作用，但其可在寄主體內(nèi)定殖，阻止致病性青枯菌的增殖。劉波等指出，病原菌弱毒株侵入植株體內(nèi)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生類似“弱菌株免疫保護(hù)”的防病作用[8]。Feng等[9]報道預(yù)接種無致病力青枯菌ΔhrpB突變株，可誘導(dǎo)擬南芥抗病相關(guān)基因表達(dá)，其中26%上調(diào)表達(dá)的基因參與脫落酸（ABA）生物合成和信號傳導(dǎo)。植物受到外界因子誘導(dǎo)，體內(nèi)基因會有不同的響應(yīng)，從而出現(xiàn)基因表達(dá)水平不同[10]。植物激素，如水楊酸（salicylic acid, SA）、茉 莉 酸（jasmonic acid, JA）和 乙 烯（ethylene, ET）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其交互作用在植物免疫應(yīng)答中發(fā)揮極其重要的作用[11-12]?！颈狙芯壳腥朦c】目前青枯菌致病性菌株誘導(dǎo)番茄、馬鈴薯和花生等寄主信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)的報道較多[13-15]，但是，無致病力青枯菌與番茄互作研究有待深入探討。我們前期研究已篩選獲得一株高防效（番茄盆栽苗和田間防效分別為100%和77.45%）的青枯菌無致病力菌株FJAT1458[16-17]，但其誘導(dǎo)抗病機制未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】比較分析青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91對番茄SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防御相關(guān)基因gluA和PR-1a，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防御相關(guān)基因pin2和loxA及ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防御相關(guān)基因PR-1b和Osmotin-like表達(dá)量的變化，為探明菌株FJAT-1458誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)防御反應(yīng)的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91分別分離自健康番茄和青枯病發(fā)病植株，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫收集保存。青枯菌培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基TTC的配制參照Kelman的方法[18]，液體培養(yǎng)基為SP（蔗糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.025 g，定容至1 L，pH 7.0）。番茄品種為金石王1號，購自廈門如意集團(tuán)開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化和接種處理 青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91在TTC平板上活化，30 ℃、48 h后，轉(zhuǎn)接至SP培養(yǎng)基，于170 r·min-1、30 ℃培養(yǎng)24 h，兩種菌液均稀釋至108CFU·mL-1，分別灌根接種于5～6葉齡的番茄盆栽苗上，100 mL·盆-1，每處理20盆（1株·盆-1），設(shè)3個重復(fù)。接種無菌水為對照（CK）。接種處理后的0、3、6、12、24、36、48、72 h進(jìn)行取樣，隨機采取500 mg左右的番茄葉片，放入液氮中速凍，之后迅速放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 總 RNA的提取 采用Transzol Up Plus RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取番茄葉片總RNA。參照說明書進(jìn)行提取。提取的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并用紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。

1.2.3 cDNA的合成 按照RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法，將各處理番茄葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 防御基因熒光定量PCR RT-PCR采用10 μL反應(yīng)體系：5.0 μL TransStart?Top/Tip Green qPCR Super-Mix (2×)，正反向引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加水至10 μL；RT-PCR的反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 退火/延伸30 s，45個循環(huán)。熒光定量引物見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表 1 RT-PCR檢測基因的特異引物序列Table 1 Specific primer sequences used for RT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析以管家基因actin作為內(nèi)參，采用公式方法計算防御基因的表達(dá)量[19]。計算公式如下：目的基因相對表達(dá)量數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010、DPS 16.05和Graphpad Prism 7.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同致病力青枯菌誘導(dǎo)SA途徑防御基因gluA和PR-1a的表達(dá)結(jié)果分析

青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91均誘導(dǎo)番茄gluA和PR-1a基因的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，接種12 h，兩種基因在強或無致病力菌株誘導(dǎo)下表達(dá)量均達(dá)最大值。在觀察期內(nèi)（3 h除外），無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄gluA基因的表達(dá)量均顯著大于對照組，而接種強致病力菌株FJAT91初期（3～24 h）誘導(dǎo)番茄gluA基因表達(dá)量顯著高于對照組，接種72 h后則顯著低于對照（P＜0.05）。接種初期（12 h前），強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)gluA基因的表達(dá)量顯著高于無致病力菌株FJAT1458（P＜0.05），后期（24 h后）則相反（圖1-A）。此外，接種后3～36 h，強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)PR-1a基因表達(dá)量均顯著高于無致病力菌株FJAT1458和對照組（圖1-B）。

圖 1 接種青枯菌不同時間番茄葉片gluA基因（A）和PR-1a基因（B）相對表達(dá)量Fig. 1 Relative expressions of gluA (A) and PR-1a (B) in tomato leaves after R. solanacearum inoculation for different time lengths

2.2 不同致病力青枯菌誘導(dǎo)JA途徑防御基因loxA和pin2的表達(dá)結(jié)果分析

觀察期內(nèi)（3 h除外）無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株loxA和pin2基因表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05）。接種初期（3～24 h）無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株loxA基因表達(dá)量顯著低于強致病力菌株FJAT91，接種后期（48 h后），F(xiàn)JAT1458誘導(dǎo)番茄植株loxA基因表達(dá)量顯著高于FJAT91處理（P＜0.05）（圖2-A）。菌株FJAT1458和FJAT-91誘導(dǎo)番茄植株pin2基因表達(dá)量最大值分別出現(xiàn)在接種后12 h和6 h，分別為CK的131.36倍和186.69倍；FJAT-91誘導(dǎo)番茄植株pin2基因相對表達(dá)量在12～24 h驟降，接種12 h 后，其誘導(dǎo)pin2基因相對表達(dá)量均顯著低于FJAT1458處理（P＜0.05）。

2.3 不同致病力青枯菌誘導(dǎo)ET途徑抗性基因PR-1b和Osm的表達(dá)結(jié)果分析

觀察期內(nèi)（48 h除外），無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株Osm基因表達(dá)量均顯著高于CK，接種12 h，F(xiàn)JAT1458 誘導(dǎo)Osm基因表達(dá)量達(dá)到最大值，為CK的7.68倍。強致病力菌株FJAT-91 誘導(dǎo)番茄植株Osm基因表達(dá)量呈現(xiàn)“先上升后下降”趨勢，接種12 h達(dá)最大值，為對照組13.86倍，接種72 h，其誘導(dǎo)Osm基因表達(dá)量與對照組相當(dāng)，顯著低于FJAT1458處理組（圖3-A）。接種3～24 h，F(xiàn)JAT1458誘導(dǎo)PR-1b基因表達(dá)量顯著低于FJAT-91處理組，接種36 h后則相反，PR-1b基因在FJAT1458處理組的表達(dá)量顯著高于FJAT-91處理組（P＜0.05）（圖3-B）。

圖 2 接種青枯菌不同時間番茄葉片loxA基因（A）和pin2基因（B）相對表達(dá)量Fig. 2 Relative expressions of loxA (A) and pin2 (B) in tomato leaves after R. solanacearum inoculation for different time lengths

圖 3 接種青枯菌不同時間番茄葉片Osm基因（A）和PR-1b基因（B）相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expressions of Osm (A) and PR-1b (B) in tomato leaves after R. solanacearum inoculation for different time lengths

3 討論與結(jié)論

許多研究表明，青枯菌的無致病力突變株能夠誘導(dǎo)植物各個信號途徑的系統(tǒng)防御基因的表達(dá)[20-21]。陳達(dá)[20]研究表明，青枯菌phcA-突變株接種3 d，其對番茄SA、JA和ET信號途徑防御基因都有不同程度的誘導(dǎo)，而青枯菌phcA-突變株和hrp-突變株能有效誘導(dǎo)煙草SA和JA信號途徑防御基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，青枯菌強弱菌株均能誘導(dǎo)番茄植株SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑gluA和PR-1a基因、JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑pin2和loxA基因及ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PR-1b和Osmotinlike（osm）基因的相對表達(dá)，表明接種青枯菌能夠激活番茄植株系統(tǒng)防御反應(yīng)。

劉俊平等[21]比較了青枯菌GMI1000的hrp-突變株與出發(fā)菌株GMI1000對PR-1a基因的誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)在接種GMI1000菌株12 h時PR-1a的表達(dá)量最高，之后，表達(dá)量降低，本研究同樣發(fā)現(xiàn)青枯菌強致病力菌株FJAT91接種番茄植株12 h時誘導(dǎo)PR-1a表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后降低。Milling等[22]研究發(fā)現(xiàn)，番茄感病品種接種GMI1000和GMI1000 ΔepsB突變株后，GMI1000誘導(dǎo)番茄植株SA、JA和ET途徑的防御基因的相對表達(dá)量均高于GMI1000 ΔepsB突變菌株。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)SA途徑的防御基因PR-1a表達(dá)量顯著高于無致病力菌株FJAT1458。然而，Chen等[23]報道，青枯菌phcA基因突變的弱毒株誘導(dǎo)番茄gluA和PR-1a基因表達(dá)量顯著高于野生型強致力菌株，究其原因可能與菌株來源及番茄品種有關(guān)，不同抗性的番茄品種對同一病原菌的誘導(dǎo)抗性存在差異[22]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，接種初期，強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)番茄gluA、loxA和PR-1b顯著高于無致病力菌株FJAT1458，而接種后期則相反，如PR-1b基因在接種前12 h，其表達(dá)量在FJAT91處理組顯著高于FJAT1458處理組，而接種36 h后，PR-1b基因在FJAT91處理組的表達(dá)量顯著低于FJAT1458處理組，可能正是由于強致病力菌株接種后期番茄植株這些防御基因表達(dá)量降低，最終導(dǎo)致植株發(fā)病死亡。接種后期（36 h之后），無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株防御基因（PR-1a和Osm除外）表達(dá)量均顯著大于強致病力菌株和對照處理，表明，接種無致病力菌株能夠激發(fā)番茄植株防御基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)植株免疫抗病反應(yīng)。

Ciardi等[24]和Block等[11]報道無致病力野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv vesicatoria）比致病的野油菜黃單胞菌對番茄系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)更快、更強。本研究結(jié)果與之相反，青枯菌強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)番茄抗性反應(yīng)更為強烈，在不同的信號途徑中，F(xiàn)JAT91菌株誘導(dǎo)番茄植株抗性基因的最大表達(dá)量均大于無致病力菌株FJAT1458，特別是ET途徑中的PR-1b基因，感染初期（3-12 h）的表達(dá)量是FJAT1458處理組的30.53-165.35倍，說明番茄寄主抗性反應(yīng)的強弱與病原菌致病力強弱呈正相關(guān)。本研究中GluA、PR-1a、pin2、loxA、PR-1b和Osm這些防御基因只是SA、JA和ET信號途徑防御調(diào)節(jié)基因中的一部分，今后應(yīng)在這3條信號途徑中其他重要防御基因在時間和空間表達(dá)量變化開展進(jìn)一步的研究。

綜上，青枯菌的強、弱菌株均能誘導(dǎo)番茄植株中SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的gluA和PR-1a基因、JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的loxA和pin2基因及ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的Osm和PR-1a基因表達(dá)，從而激活番茄植株系統(tǒng)防御反應(yīng)?？傮w來看，強致病力菌株誘導(dǎo)番茄防御基因表達(dá)量變化幅度大于無致病力菌株誘導(dǎo)的番茄植株防御基因表達(dá)量變化，但在侵染后期（36 h之后），多數(shù)基因在無致病力菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)量比強致病力菌株高。