江丹霞，武少蘭，楊國(guó)輝，詹藝舒，羅小芳，周天峰，劉培培，楊成龍 ，江玉姬,3

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州350001；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】真菌污染是導(dǎo)致食品質(zhì)量安全問(wèn)題和農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，每年由真菌污染導(dǎo)致的食品腐敗占30%以上[1-2]。食品中常見(jiàn)污染真菌有木霉屬、青霉屬、鐮刀屬、曲霉屬等[3-4]，它們具有數(shù)量多、分布廣、生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)環(huán)境不苛刻等特點(diǎn)，產(chǎn)毒能力極強(qiáng)且難以降解[5-6]，因此食品霉變不僅會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)損失、經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著人們的身體健康?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】食品防腐劑主要有化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑，由于合成的食品防腐劑安全性較低[7]，所以天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)成為研究的熱點(diǎn)。天然食品防腐劑近年來(lái)逐漸從植物源、動(dòng)物源轉(zhuǎn)向微生物源，其中芽孢桿菌屬細(xì)菌具有安全性高、易于規(guī)?；l(fā)酵、生產(chǎn)成本低等突出優(yōu)勢(shì)，且產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有高效、無(wú)毒和安全等特點(diǎn)[8-10]，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、植物保護(hù)、食品防腐等各個(gè)行業(yè)，有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場(chǎng)[11-13]。許多研究表明芽孢桿菌在食品中的防霉防腐作用效果顯著，可以明顯延長(zhǎng)食品的保藏期[14-16]。芽孢桿菌抗菌的作用機(jī)制主要是產(chǎn)生3類拮抗物質(zhì)：蛋白類物質(zhì)、脂肽類物質(zhì)和其他類代謝物質(zhì)[17-19]。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）是2010年Munusamy等[20]首次從韓國(guó)傳統(tǒng)種植的水稻根際土壤中分離得到一株新的芽孢桿菌，對(duì)人、畜及環(huán)境安全無(wú)害，可產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)[21-22]。張可可等[23]研究表明甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌SX09產(chǎn)生的胞外抑菌物質(zhì)對(duì)5株食源性致病菌和3株食品腐敗霉菌都有抑菌作用。吳燕燕等[24]發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌抗菌肽對(duì)羅非魚(yú)片有良好的防腐保鮮效果，可將冷藏保質(zhì)期延長(zhǎng)4 d以上。尹向田等[25]發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌GSBM 05的次級(jí)代謝物可拮抗葡萄白腐病病菌。魏新燕等[26]研究表明甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BH21脂肽粗提物對(duì)葡萄灰霉病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期研究發(fā)現(xiàn)Z21菌發(fā)酵液對(duì)黑曲霉、康氏木霉等真菌有抑制作用[27]，且甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌具有安全性高、易發(fā)酵、生產(chǎn)成本低等突出優(yōu)勢(shì)，其代謝產(chǎn)物可開(kāi)發(fā)為食品的天然防腐劑或天然保鮮劑，然而其發(fā)酵條件及抑菌活性有待深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于從空氣中分離出的一株拮抗真菌的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21，在前期完成其培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其產(chǎn)活性物質(zhì)的發(fā)酵條件，抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)食品的天然防腐劑或天然保鮮劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

指示菌為康氏木霉（Trichoderma koningii），由福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室保藏。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21（Bacillus methylotrophicusZ21）由本課題組分離得到。

1.2 主要試劑及儀器

瓊脂（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、NH4NO3、MgSO4、BaCl2、KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2、(NH4)2SO4（均 為 分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋：分子截留量為8～14 kD，Sigma公司。

SHP-250恒溫?fù)u床、SPX-250恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；ME204E電子天平、FE28 pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司產(chǎn)品；H-1850R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；UV-1700紫外分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司產(chǎn)品；LX-B35L滅菌鍋：合肥華泰醫(yī)療有限公司產(chǎn)品；VS-1300L-U潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）、改良馬鈴薯液體培養(yǎng)基（KPDL），配方及具體配制參考詹藝舒等[27]的方法。

1.4 種子液的制備

300 mL錐形瓶裝入100 mL KPDL液體培養(yǎng)基，滅菌后，用無(wú)菌接種環(huán)挑取一環(huán)Z21菌接入液體培養(yǎng)基，30 ℃，140 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)18 h，制備含量在105～106CFU· mL-1的種子液。

1.5 無(wú)菌發(fā)酵液的制備

將種子液接種于液體KPDL培養(yǎng)基，恒溫震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)液4 ℃，4 500 r·min-1離心20 min，收集上清液過(guò)0.22 μm的無(wú)菌濾膜，收集濾液即無(wú)菌發(fā)酵液。

1.6 Z21無(wú)菌發(fā)酵液抑菌效果

參考李恩琛等[28]的牛津杯法并略做修改：制備PDA培養(yǎng)基平板，在距離平板中央25 mm處放置牛津杯，并加入150 μL的無(wú)菌發(fā)酵液，以加入等體積的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，然后在平板中央接種直徑為8 mm的康氏木霉菌塊，于28 ℃培養(yǎng)4 d后，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量指示木霉菌的菌絲生長(zhǎng)直徑，檢測(cè)抑菌效果。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值。

抑制率/%=[（對(duì)照組霉菌菌落直徑-處理組霉菌菌落直徑）/（對(duì)照組霉菌菌落直徑-菌塊直徑）]×100。

1.7 單因素發(fā)酵試驗(yàn)

于500 mL錐形瓶中分別添加50、100、150、200、250 mL KPDL培養(yǎng)基；接種量試驗(yàn)設(shè)2%、3%、4%、6%、8%、10%種子液；溫度試驗(yàn)設(shè)28、30、32、35、37 ℃；搖床震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100、120、140、160、180、200 r·min-1；恒溫震蕩培養(yǎng)時(shí)間為36、48、60、72、84 h；培養(yǎng)液按1.5步驟制備無(wú)菌發(fā)酵液，以牛津杯法檢測(cè)抑菌活性，抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算平均值，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件。

1.8 正交試驗(yàn)

選擇裝液量（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）和轉(zhuǎn)速（E）為考察因素，采用5因素3水平L18（35）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以抑制率評(píng)價(jià)不同因素對(duì)發(fā)酵液抑菌效果的影響，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表 1 正交試驗(yàn)的因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.9 Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性檢測(cè)

1.9.1 溫度對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響取相同量的無(wú)菌發(fā)酵液分別置于40、60、80、100、120 ℃溫度下作用 30 min，測(cè)定抑制率。

1.9.2 紫外線對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響取相同量的無(wú)菌發(fā)酵液分別置于紫外光燈（254 nm）下放置30、60、90、120、150、180、210 min，測(cè)定抑制率。

1.9.3 pH對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 取相同量的無(wú)菌發(fā)酵液將其pH分別用10% HCl和10%NaOH調(diào) 節(jié) 為1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、12.0、14.0，在25 ℃下作用2 h后將pH調(diào)回原pH（8.02），測(cè)定抑制率。

1.9.4 時(shí)間對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響取相同量的無(wú)菌發(fā)酵液置于40 ℃下分別作用30、60、90、120、150、180、210 min，測(cè)定抑制率。

1.9.5 酶對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響 在相同量的無(wú)菌發(fā)酵液中分別加入質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶和復(fù)合蛋白酶，并調(diào)節(jié)至其最適pH，在各自適宜溫度下孵育2 h后，于100 ℃下處理5 min滅活酶，將pH調(diào)回原pH，測(cè)定抑制率。

1.9.6 金屬離子對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響在無(wú)菌發(fā)酵液中分別加入終濃度為20 mmol·L-1的KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2，與發(fā)酵液按2∶8的體積比混合，作用2 h，測(cè)定抑制率。

以上試驗(yàn)均采用牛津杯法檢測(cè)抑菌活性，抑制率表示活性大小，未經(jīng)處理的無(wú)菌發(fā)酵液為對(duì)照，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.10 活性物質(zhì)的MIC測(cè)定

參考徐潤(rùn)[29]硫酸銨沉淀法并略作修改，添加100%硫酸銨飽和溶液于無(wú)菌發(fā)酵液中使溶液的最終濃度為70%，4 ℃靜置過(guò)夜，12 000 r·min-1離心20 min，收集沉淀，用0.02 r·min-1PBS（pH=7.2）將沉淀完全溶解，將溶解后的溶液移入透析袋內(nèi)（分子截留量為8～14 kD），每隔3 h更換一次透析液，直到用1% BaCl2溶液滴定透析外液無(wú)沉淀生成，將透析液濃縮到30 mL，冷凍干燥得到粗提物。

MIC測(cè)定參考王青華等[30]的方法并略作修改，配制含有粗提物1 000、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、1.56 mg·mL-1的PDB培養(yǎng)基，在無(wú)菌的48孔培養(yǎng)板上分別加入含有不同濃度粗提物的PDB培養(yǎng)基0.2 mL，以純PDB為對(duì)照，然后每孔加入0.05 mL 104CFU·mL-1的康氏木霉孢子懸液，放置28 ℃培養(yǎng)24～48 h，待對(duì)照組中長(zhǎng)出可見(jiàn)菌絲即可觀察。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，確定MIC的濃度。

1.11 Z21菌對(duì)康氏木霉菌絲生長(zhǎng)影響的顯微鏡觀察

參考文娜[31]的方法并略作修改，距平板中央左右各3 cm處劃線接種一環(huán)具有抑菌活性的細(xì)菌，28 ℃培養(yǎng)24 h后，將8 mm康氏木霉菌塊轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng)4 d后，取靠近Z21菌一面、邊緣有明顯被抑制的康氏木霉菌絲，以無(wú)Z21菌的培養(yǎng)皿培養(yǎng)康氏木霉菌絲作為對(duì)照，送福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.12 木霉菌絲核酸和蛋白質(zhì)的泄露試驗(yàn)

參考陶陽(yáng)[32]的方法并略作修改，配制質(zhì)量濃度為12.5、25、50 mg·mL-1Z21菌粗提物的PDB培養(yǎng)基9 mL，將康氏木霉接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h，形成含有較多菌絲的菌球。對(duì)照組不加入粗提物。分別于培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、24 h時(shí)取出一定量的培養(yǎng)液，4 ℃，4 500 r·min-1離心15 min取上清液，用分光光度計(jì)在260 nm（核酸）和280 nm（蛋白質(zhì)）處測(cè)定吸光值的變化，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.13 數(shù)據(jù)處理

將獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Excel整理并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

不同發(fā)酵時(shí)間、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1-A可知：發(fā)酵時(shí)間對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響（P＜0.05）。抑制率隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明并不是發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)其抑制率越高，發(fā)酵前期抑制率過(guò)低，可能是細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物較少；后期抑制率降低，可能是后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被耗盡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠時(shí)，抑菌活性物質(zhì)被分解[33]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，抑制率最高，達(dá)到55.57%。所以選擇發(fā)酵時(shí)間為48 h。

由圖1-B可知：裝液量對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響（P＜0.05）。500 mL錐形瓶裝液量為50～250 mL時(shí)，隨著裝液量的增加，抑制率先上升后下降。其中在裝液量為150 mL時(shí)，無(wú)菌發(fā)酵液的抑制率最高為68.90%，所以選擇裝液量為150 mL。

由圖1-C可知：接種量對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響（P＜0.05）。抑制率隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)接種量過(guò)大時(shí)，培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能消耗過(guò)快，影響細(xì)菌后續(xù)生長(zhǎng)；當(dāng)接種量過(guò)少時(shí)，菌數(shù)較少，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)過(guò)少，抑制率不高[34]。當(dāng)接種量為3%時(shí)，抑制率最高，為67.76%，所以選擇接種量為3%。

由圖1-D可知：發(fā)酵溫度對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性也有顯著影響（P＜0.05），隨著溫度的升高，其抑制率先上升后下降，在37 ℃時(shí)，抑制率最低，只有28.9%；而28 ℃、30 ℃和35 ℃的抑制率較接近，差異不明顯，抑制率均為45%左右。當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，抑制率最高，達(dá)到67.36%，所以選擇發(fā)酵溫度為32 ℃。

由圖1-E可知：搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Z21菌無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性有顯著影響（P＜0.05）。一般來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)速越高，氧氣越充分，細(xì)菌生長(zhǎng)越好，但試驗(yàn)中抑制率隨著轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)“先增大后減少”的趨勢(shì)，其原因可能為當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r·min-1時(shí)，轉(zhuǎn)速太低，氧氣不充分，細(xì)菌生長(zhǎng)不好，代謝物質(zhì)較少。在轉(zhuǎn)速為120 r·min-1時(shí)，氧氣充分，細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)好，分泌的抑菌物質(zhì)較多，其抑制率最高，為68.37%，而當(dāng)轉(zhuǎn)速為140～200 r·min-1抑制率下降，其原因可能為培養(yǎng)液的溶氧量已飽和，無(wú)法再增加，另一方面，細(xì)菌可能主要進(jìn)行生長(zhǎng)，較少分泌代謝產(chǎn)物，抑制率降低[35-36]，所以選擇轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。

2.2 Z21菌發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，影響甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性的主次順序?yàn)镋＞D＞A＞B＞C，最佳搖床發(fā)酵條件為A2B2C3D1E2，該工藝與試驗(yàn)14一樣，按照此工藝進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到抑制率均為72%左右，較穩(wěn)定。結(jié)果表明，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21優(yōu)化后的發(fā)酵條件為500 mL錐形瓶中裝液體培養(yǎng)基150 mL、接種量3%、發(fā)酵時(shí)間60 h、發(fā)酵溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速140 r·min-1。由表3可知，轉(zhuǎn)速對(duì)抑制率的影響顯著（P＜0.05）。

2.3 Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性

不同溫度、紫外線、pH、作用時(shí)間、酶和金屬離子對(duì)Z21菌抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2-A可知，經(jīng)40～60 ℃溫度處理，Z21菌發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，抑制率維持在72%，較穩(wěn)定；經(jīng)80～100 ℃處理后，抑菌率略微下降，在65%左右，但抑制率仍在50%以上。而經(jīng)120 ℃處理后的發(fā)酵液的抑制率急劇下降（P＜0.05），低至8.17%，幾乎喪失。說(shuō)明Z21菌發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)對(duì)于100 ℃以內(nèi)的溫度其結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，能耐受100 ℃高溫，而在120 ℃后抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，幾乎沒(méi)有抑制率。

由圖2-B可知，Z21菌發(fā)酵液在紫外環(huán)境下處理30～90 min，抑制率變化不大（P＞0.05），維持在75%左右，與未經(jīng)紫外照射的CK組的抑制率沒(méi)有顯著性影響；經(jīng)紫外環(huán)境下處理120～210 min，抑制率仍保持在72%左右，抑菌率保持較穩(wěn)定，說(shuō)明Z21菌抑菌活性物質(zhì)具有紫外穩(wěn)定性。

由圖2-C可知，Z21菌發(fā)酵液在酸性條件下的抑制率較高，說(shuō)明活性物質(zhì)在酸性條件較堿性條件穩(wěn)定。與pH=8（CK）時(shí)的發(fā)酵抑制率比較，Z21菌發(fā)酵液在pH＞8或pH＜8條件下抑菌率稍有下降，但抑菌率仍然較高，說(shuō)明Z21菌抑菌活性物質(zhì)在pH為1～14的環(huán)境較穩(wěn)定，可以作為食品防腐劑在食品中廣泛使用。

由圖2-D可知，Z21菌發(fā)酵液在40 ℃水浴30 min時(shí)，其抑菌率與CK組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），水浴60～120 min，抑制率稍有變化，但均維持在72%左右，處理150～210 min后，抑制率下降至61%左右，總體維持在60%左右，說(shuō)明Z21菌的抑菌活性物質(zhì)在40 ℃環(huán)境下相對(duì)較穩(wěn)定。

由圖2-E可知，無(wú)菌發(fā)酵液經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理后，抑制率為67.68%，與CK組比較，下降了5%，而經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶處理后的抑制率比CK組低了10%，維持在60%左右，但均高于50%，仍具有較強(qiáng)的活性，說(shuō)明Z21菌抑菌活性物質(zhì)對(duì)這5種酶不敏感。

由圖2-F可知，發(fā)酵液經(jīng)KCl、NaCl、ZnCl2、MgCl2、CdCl2、CaCl2金屬離子處理后，抑制率發(fā)生了變化，說(shuō)明金屬離子對(duì)其有影響。Zn2+、Cd2+、Ca2+處理組與CK組比較，抑制率下降了7%左右，而經(jīng)K+、Na+、Mg2+處理后，抑制率降低了15%左右，變化明顯（P＜0.05），說(shuō)明其抗菌活性物質(zhì)在一定程度受到了這些金屬離子的脅迫，但總體抑制率均保持在56%以上，保持較高的抑菌活性。

2.4 活性物質(zhì)的MIC

MIC（Minimum inhibitory concentration），是 指最低抑菌濃度，是測(cè)量抗菌物質(zhì)抗菌活性大小的一個(gè)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)最優(yōu)方法提取得到的粗提物，其抑制康氏木霉孢子萌發(fā)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

將完全不生長(zhǎng)菌絲的一孔判定為終點(diǎn)，該孔濃度即為MIC。從表4可以看出，當(dāng)空白孔中康氏木霉菌絲生長(zhǎng)時(shí)，粗提物濃度為25 mg·mL-1的孔，菌絲未生長(zhǎng)，故粗提物的MIC為25 mg·mL-1。

表 2 Z21菌發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results on Z21 fermentation conditions

表 3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 ANOVA analysis on orthogonal test results

2.5 Z21菌對(duì)康氏木霉菌絲生長(zhǎng)影響的顯微鏡觀察

Z21菌對(duì)康氏木霉菌絲表面顯微特征的影響的掃描電鏡圖如圖3所示。

從掃描電鏡可以看出（圖3）：對(duì)照組的康氏木霉的菌絲表面平整，菌絲體飽滿，有許多孢子梗，說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)良好。處理組中的康氏木霉菌絲表面明顯皺縮，菌絲明顯變細(xì)，有的菌絲斷裂，視野中未發(fā)現(xiàn)孢子梗，說(shuō)明菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育以及孢子梗的分化受到明顯抑制。

圖 2 Z21菌發(fā)酵液抑菌活性穩(wěn)定性Fig. 2 Stability of antibacterial activity of Z21 fermentation broth

表 4 Z21菌發(fā)酵液粗提物抑制康氏木霉孢子萌發(fā)的MICTable 4 MIC of crude Z21 fermentation extract on T. koningii spore germination

2.6 Z21菌粗取物對(duì)木霉菌絲核酸和蛋白質(zhì)的泄露情況

用25 mg·mL-1粗提物的PDB培養(yǎng)康氏木霉的菌絲，根據(jù)蛋白質(zhì)和核酸具有紫外吸收的性質(zhì)，利用比色法測(cè)定康氏木霉菌絲細(xì)胞外液體的蛋白質(zhì)和核酸含量，以此探究是否有內(nèi)容物質(zhì)（主要是蛋白質(zhì)和核酸）的泄露[33]。測(cè)定結(jié)果如圖4和圖5所示。

從圖4和圖5可以看出，與對(duì)照組相比，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，含有粗提物的培養(yǎng)液中的康氏木霉菌絲培養(yǎng)液在260 nm和280 nm處的紫外吸光值不斷增加，分別從最開(kāi)始的0.03和0.03增加到0.15和0.16，說(shuō)明康氏木霉菌絲細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸和核酸等物質(zhì)泄露到了細(xì)胞外，導(dǎo)致培養(yǎng)液的260 nm和280 nm處吸光值增加。綜上所述，推測(cè)該活性物質(zhì)可能是蛋白類物質(zhì)或者為脂肽類物質(zhì)[37]，且作用于真菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性有所改變，細(xì)胞內(nèi)容物外流。

圖 3 受Z21菌影響的康氏木霉菌絲表面掃描電鏡圖Fig. 3 SEM images of T. koningii hyphae surface as affected by Z21

圖 4 Z21菌發(fā)酵液粗提物對(duì)康氏木霉菌絲細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄露的影響Fig. 4 Effect of crude Z21 fermentation broth extract on protein leakage of T. koningii hyphae

圖 5 Z21菌發(fā)酵液粗提物對(duì)康氏木霉菌絲細(xì)胞內(nèi)核酸泄露的影響Fig. 5 Effect of crude Z21 fermentation broth extract on nucleic acid leakage of T. koningii hyphae

3 討論與結(jié)論

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Z21發(fā)酵液對(duì)黑曲霉、康氏木霉等真菌有很強(qiáng)的抑菌活性[27]，150 μL無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)康氏木霉的抑制率最高達(dá)72%左右。隨著人們對(duì)食品安全的認(rèn)識(shí)和要求不斷提高，化學(xué)防腐劑的使用已成為一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，安全、高效和低成本的生物防腐劑將成為防腐劑的發(fā)展趨勢(shì)[24]。芽孢桿菌屬的細(xì)菌可生成抑菌活性物質(zhì)，對(duì)霉菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用[38]，且芽孢桿菌屬對(duì)人、畜和環(huán)境安全，成為開(kāi)發(fā)天然生物防腐劑的熱點(diǎn)研究之一。武利勤等[39]發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌RA對(duì)棉花黃萎病菌和禾谷鐮孢菌等9種植物病原菌抑制率均在50%以上。采俊香等[40]研究表明甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌G-5產(chǎn)生的抗菌蛋白對(duì)多種植物病原真菌有較好抑菌效果。He等[21]通過(guò)試驗(yàn)得到甲基營(yíng)養(yǎng)芽孢桿菌BCN2對(duì)從采后枇杷果實(shí)中分離出的5種病原真菌有抑制作用，使枇杷果實(shí)保鮮期達(dá)10 d。

Z21菌發(fā)酵液耐熱，耐酸、堿，對(duì)紫外線、許多酶和金屬離子不敏感，這與前人的研究結(jié)果相似，解淀粉芽孢桿菌W10產(chǎn)生的新型小抗菌肽5240在100 ℃處理20 min和pH 4～10范圍內(nèi)可以保持其抑菌活性[41]，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌G-5[40]、Hg18[42]產(chǎn)生的抗菌蛋白具有較好的光、熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。Lee等[43]從韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品分離出一株芽孢桿菌，產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)Anti-LM7在pH4～9和80 ℃作用30 min均保持較強(qiáng)的抗菌活性。吳艷清等[44]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌YQ5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)高溫、pH（2～12）、紫外線照射均不敏感。由此可見(jiàn)，Z21菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)不僅抑菌率較高，且穩(wěn)定性較好，具有開(kāi)發(fā)為天然生物防腐劑的潛力和應(yīng)用前景。