周樹(shù)蘭,王 成(遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院手外科,珠海 519100;通訊作者,E-mail:906090860@qq.com)

目前動(dòng)脈冷凍的難點(diǎn)是在凍融過(guò)程中即便消除溶質(zhì)損傷和冰晶損傷,內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和缺血再灌注損傷等事件將成為復(fù)蘇后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)依然發(fā)生血管活性喪失的刺激因素,造成血管生存極限;與此同時(shí),以滲透性保護(hù)劑為主的二甲基亞砜作為器官凍存劑的毒性作用越來(lái)越引起人們的注意[1]。因此,不斷尋找毒性小、敏感性高的冷凍保護(hù)劑,是動(dòng)脈低溫保存研究的焦點(diǎn)。

附子是一種著名的中藥,具有補(bǔ)火助陽(yáng)、溫補(bǔ)腎陽(yáng)、振奮心陽(yáng)、散寒止痛等陽(yáng)熱功效,而深低溫凍存環(huán)境陰寒,根據(jù)中醫(yī)辯證思維,性大熱的附子具有深低溫凍存保護(hù)劑的潛在特性;另一方面,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明附子多糖(Fuzi polysaccharide,FPS)是來(lái)源于中藥附子的主要活性成分之一,由葡萄糖和阿拉伯糖聚合而成[2],無(wú)毒[3],具有免疫調(diào)節(jié)、抗高血糖、抗炎、抗腫瘤等多種作用[4]。本課題組前期研究表明,FPS在深低溫凍存中對(duì)腹主動(dòng)脈組織層面有較好的保護(hù)作用[5]。為進(jìn)一步探索其細(xì)胞分子保護(hù)機(jī)制,本研究觀察了不同濃度附子多糖在深低溫凍存中對(duì)腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響,尋找其最佳保護(hù)濃度及保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡雄性SD大鼠48只,SPF級(jí),體質(zhì)量(190 ±30)g,購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0014。

1.2 主要試劑與儀器

附子多糖(中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所),線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性檢測(cè)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司),線(xiàn)粒體提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)測(cè)定試盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶)活力測(cè)定試劑盒(南京建成生物技術(shù)股份有限公司)。HT 7700透射電子顯微鏡(日本日立公司);UV-1200紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司);全波段酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 樣品預(yù)處理

無(wú)菌環(huán)境下顯微鏡取大鼠腹主動(dòng)脈,置于培養(yǎng)皿中,4 ℃操作臺(tái)上迅速去除殘血、多余脂肪和結(jié)締組織,濾紙吸干血管表面水分,于室溫、無(wú)風(fēng)環(huán)境內(nèi)稱(chēng)取重量,并記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。隨機(jī)將血管分為新鮮組、保存對(duì)照組(滅菌注射用水)和多糖保存組(附子多糖0.1,1,10,20 mg/ml),每個(gè)濃度各8只。新鮮組取材后立即進(jìn)行線(xiàn)粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)采集分析,線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性,ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量等各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè),保存對(duì)照組和多糖保存組取腹主動(dòng)脈后于-196 ℃液氮中保存1周后進(jìn)行上述各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 線(xiàn)粒體提取及蛋白含量測(cè)定

新鮮組取腹主動(dòng)脈后立即進(jìn)行線(xiàn)粒體提取及蛋白含量測(cè)定,保存對(duì)照組和多糖保存組腹主動(dòng)脈液氮保存1周后將凍存管置于37 ℃水浴鍋內(nèi)快速?gòu)?fù)溫[6],待冰塊融化后用生理鹽水洗凈血管表面附子多糖殘留液,迅速放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中并加入相應(yīng)的提取液,4 ℃操作臺(tái)上顯微剪快速將血管組織修剪成約為2 mm×2 mm大小的組織塊,修剪完成后將組織液倒入手持玻璃勻漿器中,根據(jù)線(xiàn)粒體提取試劑盒及線(xiàn)粒體蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體提取和蛋白濃度測(cè)定,為保證線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,操作全程均在4 ℃條件下完成。

1.5 線(xiàn)粒體功能指標(biāo)檢測(cè)

按照線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作檢測(cè)。按照SOD檢測(cè)試劑盒、GSH-Px檢測(cè)試劑盒、CAT檢測(cè)試劑盒和MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,分別檢測(cè)SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量。分別按照ATP酶活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-ATP酶活力。

1.6 透射電鏡觀察線(xiàn)粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)并采集分析各組線(xiàn)粒體內(nèi)外膜及基質(zhì)變化

將血管組織修剪成截面為2 mm×2 mm的小組織塊,將修剪好的小組織塊快速轉(zhuǎn)移至體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛和2%戊二醛溶液固定過(guò)夜。之后用磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4)漂洗3次,每次15 min;之后用1%鋨酸避光室溫固定2 h;PBS(pH 7.4)漂洗3次,每次15 min;組織塊依次放入體積分?jǐn)?shù)為30%,50%,70%,80%,95%,100%,100%乙醇溶液中脫水每次20 min和100%丙酮2次,每次15 min。丙酮和812包埋劑1 ∶1比例37 ℃ 2～4 h,丙酮和812包埋劑1 ∶2比例37 ℃過(guò)夜,純812包埋劑37 ℃ 5～8 h。將組織塊放入盛有812包埋劑的包埋箱中37 ℃烘箱靜置24 h,后調(diào)整溫度至于60 ℃烤箱聚合48 h,取出樹(shù)脂塊,超薄切片后150目方華膜銅網(wǎng)撈片。后用2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min;70%乙醇清洗3次;超純水清洗3次;2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min;超純水清洗3次,濾紙吸干多余水分,放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過(guò)夜。透射電鏡下觀察腹主動(dòng)脈內(nèi)皮、平滑肌纖維大體形態(tài)和線(xiàn)粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FPS在深低溫保存中對(duì)腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體蛋白濃度的影響

與新鮮組比較,保存對(duì)照組中線(xiàn)粒體蛋白大量降解(P<0.01);與保存對(duì)照組比較,多糖保存組線(xiàn)粒體蛋白的降解程度明顯減輕,而且FPS濃度越高,蛋白濃度越高,當(dāng)濃度達(dá)到FPS 10 mg/ml時(shí),溶液達(dá)到飽和狀態(tài),此時(shí)蛋白濃度最高(P<0.01);與FPS 10 mg/ml組比較,FPS 20 mg/ml線(xiàn)粒體蛋白濃度呈下降趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.1,見(jiàn)圖1)。

2.2 FPS在深低溫保存中對(duì)復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的影響

與新鮮組比較,保存對(duì)照組復(fù)合體活力明顯降低(P<0.01)。與保存對(duì)照組比較,多糖保護(hù)組復(fù)合體活性逐漸增加,其中從1 mg/ml開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中濃度為10 mg/ml時(shí),復(fù)合體活性達(dá)到最高,當(dāng)繼續(xù)增加FPS濃度時(shí),復(fù)合體活性呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)表1)。

線(xiàn)粒體蛋白濃度比較,F=35.20,P<0.0001;與新鮮組比較,* *P<0.01;與保存對(duì)照組比較,##P<0.01圖1 分光光度法測(cè)定深低溫保存中線(xiàn)粒體蛋白的相對(duì)濃度Figure 1 The relative concentrations of mitochondrial proteins in cryopreservation by spectrophotometry

表1 深低溫凍存中不同濃度FPS對(duì)腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的影響

2.3 FPS在深低溫保存中對(duì)腹主動(dòng)脈SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量的影響

與新鮮組相比,保存對(duì)照組中抗氧化物酶SOD、GSH-Px、CAT活力明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01);與保存對(duì)照組比較,加入不同濃度FPS處理后,多糖保存組SOD、GSH-Px、CAT活力逐漸上升,MDA含量逐漸下降,呈濃度依賴(lài)性;從1 mg/ml開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,FPS濃度達(dá)10 mg/ml時(shí)保護(hù)效應(yīng)出現(xiàn)峰值(見(jiàn)表2)。

2.4 FPS在深低溫保存中對(duì)腹主動(dòng)脈Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力的影響

與新鮮組相比,保存對(duì)照組中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力明顯降低(P<0.01);與保存對(duì)照組比較,加入不同濃度的FPS干預(yù)后,多糖保存組血管組織中ATP酶活力隨濃度增加而逐漸升高,這可能與FPS減輕呼吸鏈復(fù)合體損傷有關(guān),并從1 mg/ml開(kāi)始與保存對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中10 mg/ml時(shí)ATP酶活力達(dá)高峰(見(jiàn)表3)。

表2 FPS在深低溫保存中對(duì)腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量的影響

表3 深低溫保存中不同濃度FPS對(duì)腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力的影響

2.5 深低溫保存中不同濃度FPS對(duì)腹主動(dòng)脈平滑肌線(xiàn)粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)影響

新鮮組線(xiàn)粒體呈規(guī)則的橢圓型,輪廓分明,外膜光滑完整,內(nèi)脊密集且清晰可見(jiàn),基質(zhì)分布均勻;深低溫保存使線(xiàn)粒體均出現(xiàn)不同程度的腫脹,保存對(duì)照組線(xiàn)粒體內(nèi)外膜完全破裂溶解呈碎片狀,內(nèi)脊幾乎降解消失,內(nèi)部基質(zhì)呈透明狀。FPS 0.1 mg/ml組線(xiàn)粒體內(nèi)外膜開(kāi)始出現(xiàn)破裂溶解,膜結(jié)構(gòu)模糊,線(xiàn)粒體內(nèi)脊開(kāi)始大量降解減少,基質(zhì)外流;FPS 1 mg/ml組線(xiàn)粒體外膜基本完整,但內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,內(nèi)脊大部分?jǐn)嗔?基質(zhì)減少;FPS 10 mg/ml組線(xiàn)粒體呈較為規(guī)則的圓形或卵圓形,這可能與線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)有關(guān),輪廓較為分明,外膜完整光滑,基質(zhì)分布較保存對(duì)照組明顯增多,可見(jiàn)清晰線(xiàn)粒體內(nèi)脊;FPS 20 mg/ml組線(xiàn)粒體形態(tài)大多數(shù)呈圓形,外膜光滑完整,內(nèi)脊輪廓出現(xiàn)部分?jǐn)嗔巡贿B續(xù)現(xiàn)象,基質(zhì)分布均勻(見(jiàn)圖2)。

圖2 深低溫保存中不同濃度FPS對(duì)腹主動(dòng)脈平滑肌線(xiàn)粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)影響 (×25 000)Figure 2 The effect of different concentrations of FPS on the internal ultrastructure of abdominal aorta smooth muscle mitochondria under cryopreservation (×25 000)

3 討論

目前普遍認(rèn)同深低溫保存具有長(zhǎng)期保留生物器官組織活性[7]、降低組織器官免疫原性和抑制排斥反應(yīng)[8]等作用,可以使組織器官得到有效復(fù)用。在這些器官組織移植中血管起到向移植部位供送血液的作用,只有血管保存成功了,才能保證移植器官或組織得到充分的血供,其成活才有希望。因此,凍存中血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)后期組織器官存活非常重要。

FPS是由單糖組成的大分子化合物,研究發(fā)現(xiàn),FPS通過(guò)降低低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)來(lái)抑制中性鞘磷脂酶(NSMase)/神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer)信號(hào)通路激活并增強(qiáng)機(jī)體自噬活性,顯著改善血管鈣化[9,10];以及通過(guò)阻斷高遷移率族盒1(high-mobility group box 1,HMGB1)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced-glycation end products,RAGE)通路抑制IL-6、IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放,顯著抑制血管炎癥反應(yīng),減少缺血引起的血管損傷,以及通過(guò)提高細(xì)胞的吞噬活性及增加一氧化氮的生物利用度,改善血管內(nèi)皮損傷[11];此外,值得注意的是,FPS能增強(qiáng)雪旺細(xì)胞的抗氧化能力、下調(diào)NADPH氧化酶-1(Nox1)水平,顯著抑制高糖誘導(dǎo)的糖尿病周?chē)窠?jīng)氧化應(yīng)激損傷[12]和通過(guò)較強(qiáng)的抗氧化能力減少肝臟缺血-再灌注損傷[13]。因此,FPS具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、增強(qiáng)自噬、免疫調(diào)節(jié)、抗缺血再灌注損傷、抗高血糖血癥、抗氧化等多種生物學(xué)作用特性,這為冷凍保護(hù)劑研發(fā)提供了新思路。

線(xiàn)粒體是機(jī)體的能源工廠,也是調(diào)控凋亡、自噬、鈣離子、生物膜電位穩(wěn)態(tài)等多種細(xì)胞生理功能的細(xì)胞器,其結(jié)構(gòu)和功能的變化直接調(diào)節(jié)細(xì)胞存活或死亡的信號(hào)。有氧環(huán)境下,線(xiàn)粒體通過(guò)三羧酸循環(huán)進(jìn)行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,供應(yīng)各組織細(xì)胞能量,其中線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體扮演著重要角色,當(dāng)外在因素使線(xiàn)粒體呼吸鏈損傷時(shí)將阻礙氧化磷酸化的進(jìn)行,使能量合成減少,打破細(xì)胞生理平衡,從而導(dǎo)致組織器官功能衰竭,本實(shí)驗(yàn)中線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體對(duì)低溫很敏感,強(qiáng)烈的低溫刺激后,線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體活性顯著下降;此外,線(xiàn)粒體呼吸鏈功能障礙將促進(jìn)電子泄漏,有利于ROS大量產(chǎn)生[14],其中復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ和復(fù)合物Ⅱ相關(guān)的琥珀酸介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS是細(xì)胞內(nèi)的主要來(lái)源[15],占細(xì)胞內(nèi)ROS的45%[16]。除上訴外,復(fù)合體Ⅳ,即細(xì)胞色素c氧化酶(COX),被認(rèn)為是氧化磷酸化的調(diào)節(jié)中心,它會(huì)被氧化磷酸化的最終產(chǎn)物ATP反饋抑制,而這種“變構(gòu)ATP抑制”能保持低而健康的線(xiàn)粒體膜電位(放松狀態(tài)),并阻止ROS的形成[17]。ROS是一種具有化學(xué)活性的分子,包括羥基自由基(OH-)、超氧陰離子(O2-)、和過(guò)氧化氫(H2O2)等[18],生理?xiàng)l件下,ROS參與細(xì)胞的代謝調(diào)控,在生物體內(nèi)具有重要的功能;但當(dāng)ROS積累上升到毒性水平時(shí),將促使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激,引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸,特別是DNA等大分子物結(jié)構(gòu)破壞從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷壞死[19]。生物體內(nèi)存在完整的抗氧化系統(tǒng),它由各種抗氧化物酶組成,包括SOD、GSH-Px和CAT,它能將氧自由基還原成H2O和O2[20],避免氧化損傷的發(fā)生;其中MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化最豐富的羰基產(chǎn)物,其含量高低間接反應(yīng)了組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的程度[21]。因此,線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體功能損傷不僅影響氧化磷酸化,而且加重機(jī)體氧化應(yīng)激損傷;而抗氧化物酶活性和MDA的含量則進(jìn)一步反應(yīng)了氧化損傷的程度。

此外,線(xiàn)粒體外膜和內(nèi)膜上有大量的ATP酶離子通道,參與機(jī)體能量轉(zhuǎn)換、電化學(xué)梯度維持、膜興奮性控制、滲透平衡和物質(zhì)運(yùn)送等多個(gè)方面[22];因此,離子通道的開(kāi)啟或關(guān)閉可以調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜電位、ROS的產(chǎn)生和影響呼吸鏈復(fù)合體的功能[23]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶是生物膜上最常見(jiàn)的離子通道,它的活力依賴(lài)于細(xì)胞能量的變化,線(xiàn)粒體呼吸鏈損傷和過(guò)度的氧化應(yīng)激將導(dǎo)致ATP酶活力下降,出現(xiàn)離子紊亂、鈣超載、細(xì)胞高滲水腫等造成線(xiàn)粒體膜電位下降,從而加重線(xiàn)粒體膜損傷,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)到線(xiàn)粒體的流量過(guò)載[24,25]。

本研究中,深低溫保存導(dǎo)致線(xiàn)粒體呈現(xiàn)膨脹直至破損,線(xiàn)粒體膜出現(xiàn)破裂崩塌,內(nèi)容物流出減少消失,內(nèi)嵴分裂和線(xiàn)粒體功能?chē)?yán)重下降,從而影響遠(yuǎn)期血管能量代謝并加重氧化應(yīng)激損傷,造成后期血管生存極限。隨著FPS濃度升高,線(xiàn)粒體損傷程度減輕,線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)趨于完整;同時(shí),線(xiàn)粒體復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ活性、ATP酶活力和抗氧化能力較保存對(duì)照組明顯上升,并呈濃度依賴(lài)性,其高濃度的FPS較低濃度FPS保護(hù)效果好,其中FPS 10 mg/ml組保護(hù)效應(yīng)可能較好。

綜上所述,深低溫保存造成了線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能損害,而FPS通過(guò)改善線(xiàn)粒體功能障礙并減輕組織氧化損傷,保護(hù)了深低溫保存中腹主動(dòng)脈線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,從而明顯提高細(xì)胞能量代謝儲(chǔ)備,為后期血管生存保存體力。我們猜想這可能與某種線(xiàn)粒體分子通路有關(guān),但其具體機(jī)制還有待實(shí)驗(yàn)闡明。