楊洪賓,余真妍,閆 潔,紀(jì)帥帥,楊夢婷,胡 嫚,王子吟,霍 強(qiáng),程 秀(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室,蚌埠 233000;通訊作者,E-mail:620793985@qq.com;共同通訊作者,E-mail:93703312@qq.com)

肺癌是嚴(yán)重威脅人們健康的惡性腫瘤之一[1]?；熑匀皇侵饕闹委煼绞?但是化療藥物具有水溶性低、穩(wěn)定性差等缺點,嚴(yán)重影響各種化療藥物的應(yīng)用[2]。例如,槲皮素是一種來源廣泛的黃酮醇類化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等多重作用,但同樣存在上述弊端[3,4]。目前研究多采用納米靶向制劑搭載化療藥物,增強(qiáng)藥物到達(dá)病灶的有效濃度[5]。例如,Gui等[6]制備了超順磁性氧化鐵納米粒子,優(yōu)化了紫杉醇的不良性質(zhì),避免了藥物過早的破壞,提高了藥物的靶向富集。但常規(guī)的靶向制劑仍然存在易被體內(nèi)吞噬系統(tǒng)識別破壞和靶向性不足等缺點[7]。目前,通過細(xì)胞膜包裹構(gòu)建仿生納米載體可以進(jìn)一步解決上述存在的不利之處。從最初利用紅細(xì)胞膜[8]包裹納米粒子進(jìn)行給藥,避免巨噬細(xì)胞的攝取,延長藥物體循環(huán)時間,到后來利用巨噬細(xì)胞[9]、中性粒細(xì)胞[10]、T細(xì)胞[11]、癌細(xì)胞[12]與細(xì)菌[13]等提取細(xì)胞膜用于包裹粒子構(gòu)建仿生納米載體。其中,癌細(xì)胞膜有別于其他膜材料,具有很好的同源靶向性和逃避免疫系統(tǒng)識別能力,作為仿生膜材料具有獨特的優(yōu)勢[14]。其次,沸石咪唑骨架(zeolitic imidazolate framework-8,ZIF-8)是金屬有機(jī)骨架(MOFs)的一個重要亞類,以其優(yōu)異的載藥量和pH響應(yīng)性,被確認(rèn)為一種性能優(yōu)越的載體,并被廣泛用于藥物的靶向遞送[15]。因此,本研究通過肺癌細(xì)胞膜(lung cancer cell membrane,CM)包裹咪唑骨架材料構(gòu)建仿生藥物,旨在探討仿生類的材料能否發(fā)揮隱形作用和腫瘤靶向作用,從而為肺癌的治療構(gòu)建一種能夠良好靶向腫瘤部位發(fā)揮療效的仿生納米載體。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞(中國上?？茖W(xué)院);BALB/c裸鼠(常州卡文斯實驗動物有限公司);槲皮素、六水合硝酸鋅(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);2-甲基咪唑(東京化成工業(yè)株式會社,日本);0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco,美國);F12培養(yǎng)基(大連美侖生物科技有限公司);胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司);青霉素-鏈霉素溶液、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司);Matrigel基質(zhì)膠(Corn-ing,美國);Cy5熒光染料(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)。

1.2 動物與細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞在含10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),37 ℃,5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5周齡的BALB/c雄性裸鼠飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,并獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心倫理批準(zhǔn)。

1.3 仿生納米載體的構(gòu)建

1.3.1 提取A549細(xì)胞膜 細(xì)胞刮收集A549細(xì)胞,離心棄上清(900 r/min,5 min,4 ℃),用預(yù)冷的PBS清洗3次。取細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒中的試劑A 1 ml重懸細(xì)胞,冰浴15 min后,細(xì)胞懸液反復(fù)凍融3次。離心取上清(700 r/min,10 min,4 ℃),將上清離心(14 000 r/min,30 min,4 ℃),所得沉淀即為癌細(xì)胞膜,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備CMD-ZIF-8@QT 根據(jù)先前報道的方法[16]采用一鍋包封法制備載藥納米粒子,取970 mg的二甲基咪唑,50 mg的槲皮素溶于10 ml甲醇中,攪拌5 min,使其充分混合,另取50 mg的六水合硝酸鋅溶于5 ml甲醇中,并將六水合硝酸鋅逐滴加入到上述溶液中攪拌2 h,之后10 000 r/min,10 min,4 ℃離心,棄上清,甲醇浸洗2次,去離子水浸洗2次。凍干得ZIF-8@QT。將CM、二硬脂?；掖及?distearoyl phosphoethanolamine,DSPE)與ZIF-8@QT按照質(zhì)量比1 ∶2 ∶5混合,水浴超聲30 min(200 W,40 kHz)。9 000 r/min,10 min,4 ℃離心,甲醇浸洗2次,去離子水浸洗2次,凍干得CMD-ZIF-8@QT。

1.4 仿生納米載體的表征

1.4.1 用動態(tài)光散射系統(tǒng)(DLS)檢測ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的粒徑與Zeta電勢 取空白ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的納米顆粒溶液,適度稀釋后,置于馬爾文四通石英樣品池中,采用DLS Zetasizer Nano-90測量樣品的粒徑和Zeta電勢,每次測量重復(fù)3次。

1.4.2 用透射電鏡(TEM)檢測ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的結(jié)構(gòu) 制備適宜濃度的ZIF-8、ZIF-8@QT和CMD-ZIF-8@QT的納米粒溶液,分別取10 μl滴加在200目有碳支持膜的銅網(wǎng)上,常溫放置2 h,干燥后用透射電子顯微鏡觀察樣品的結(jié)構(gòu)。

1.4.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 將ZIF-8@QT、A549肺癌細(xì)胞膜與CMD-ZIF-8@QT按一定比例與上樣緩沖液混合均勻,95 ℃加熱5 min使蛋白變性。將樣品和蛋白Marker按順序依次緩慢加入到含有預(yù)先配置的凝膠加樣孔中,進(jìn)行電泳(先75 V 30 min,后100 V 60 min),電泳結(jié)束后,取出凝膠,用快速考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min,脫色2 h后,拍照并分析。

1.5 CMD-ZIF-8@QT的制劑學(xué)評價

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取一定質(zhì)量的槲皮素,用甲醇溶解配制成1 mg/ml的溶液,稀釋成2.8,4.4,5.8,7.5,9,10.8 μg/ml的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)工作液。用紫外分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)工作液在370 nm波長處的吸光度,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 包封率與載藥量的測定 按1.5.1所述方法制備出CMD-ZIF-8@QT,取二甲基咪唑1 940 mg,六水合硝酸鋅25 mg,槲皮素的投藥量分別為2.4,5.2,9.8,25.4,30.2,40.4,50.6 mg,將所得納米粒離心(9 000 r/min,5 min),去除上清中未被包封的槲皮素。用紫外分光光度計測定上清溶液在371 nm波長處的吸光度,根據(jù)槲皮素溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算出游離藥物質(zhì)量。按以下公式計算包封率(encapsulation efficiency,EE)和載藥量(drug loading content,DLC):

EE(%)=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%

DLC(%)=(Wtotal-Wfree)/Ntotal

其中,Wtotal是系統(tǒng)中的藥物總質(zhì)量;Wfree是溶液中游離的藥物質(zhì)量,Ntotal是總納米粒的質(zhì)量。

1.5.3 酸響應(yīng)釋藥分析 在pH 5.0與pH 7.4的PBS中研究CMD-ZIF-8@QT的釋藥性,將2 ml的ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT溶液裝入3 500 D的透析袋中,每個透析袋放入裝有30 ml釋放介質(zhì)的50 ml燒杯中,37 ℃搖床,100 r/min,在預(yù)定時間點1,2,5,10,15,20,30,60,80 h后,取出透析袋,用移液槍吸取1 ml釋放液,并加入等體積的釋放介質(zhì),采用上述紫外法測定QT的釋放量,釋放實驗重復(fù)3次。

1.5.4 CMD-ZIF-8@QT的穩(wěn)定性實驗 將新制的CMD-ZIF-8@QT粒子,分別置于等體積的0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液和含有10% FBS的0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液中,在預(yù)定時間點0,6,12,18,24,36,48 h取出透析袋,用移液槍收集1 ml溶液,同時補(bǔ)入等量的釋放介質(zhì),將收集的溶液用馬爾文粒徑儀檢測粒徑和電勢,重復(fù)3次。

1.6 CMD-ZIF-8@QT的體內(nèi)評價

1.6.1 CMD-ZIF-8@QT體內(nèi)分布實驗 在雄性BALB/c裸鼠右側(cè)皮下注射100 μl(1×106個A549細(xì)胞)預(yù)冷的PBS溶液,待腫瘤長至200 mm3左右時,尾靜脈注射Cy5與Cy5-CMD-ZIF-8并將其分為對照組和Cy5-CMD-ZIF-8組。分別于注射后1,6,12,24 h采用小動物活體成像儀測量腫瘤部位的熒光強(qiáng)度,觀察結(jié)束后解剖小鼠取臟器和腫瘤,并測量各個臟器和腫瘤組織內(nèi)的熒光強(qiáng)度,進(jìn)行ROI半定量分析。

1.6.2 CMD-ZIF-8@QT在動物體內(nèi)的藥效實驗 在4～5周齡的雄性BALB/c小鼠右側(cè)皮下注射100 μl(1×106個A549細(xì)胞)預(yù)冷的PBS溶液。待腫瘤長至100 mm3左右時,將小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(saline)、QT組、ZIF-8@QT組與CMD-ZIF-8@QT組,每組5只。以5 mg/kg藥物劑量尾靜脈注射藥物。每3 d給藥1次,每2 d測量記錄腫瘤的體積,每3 d記錄裸鼠的體質(zhì)量,第1次給藥當(dāng)天記為0 d,于第21天處死小鼠,取出臟器進(jìn)行HE染色。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 仿生納米載體的表征

2.1.1 動態(tài)光散射系統(tǒng)(DLS)檢測結(jié)果 QT與CMD均帶負(fù)電荷,ZIF-8因表面的Zn2+帶正電荷,首先將藥物QT包封進(jìn)ZIF-8,結(jié)果顯示,粒子的Zeta電勢由正變負(fù),同時粒徑由(127.3 ±2.23)nm增長到(145.2 ±3.24)nm。將帶負(fù)電荷的脂質(zhì)類混合膜材料與ZIF-8@QT結(jié)合,結(jié)果顯示,Zeta電勢絕對值進(jìn)一步增大,粒徑由(145.2 ±3.21)nm增長到(176.4 ±2.72)nm。因此初步得出QT成功載入ZIF-8和CMD包封ZIF-8@QT粒子(見圖1)。

2.1.2 透射電鏡(TEM)結(jié)果 TEM結(jié)果表明,ZIF-8、ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8的粒徑結(jié)果分別為(85.3 ±3.22)nm,(96.2 ±2.73)nm,(109.3 ±3.71)nm。在納米粒的整個制備過程中,納米粒形貌由多面體形變?yōu)轭惽蛐?且納米粒的粒徑逐漸增大(見圖2)。

2.1.3 SDS-PAGE 結(jié)果表明,ZIF-8作為金屬有機(jī)骨架材料,在凝膠上不存在蛋白印跡;CMD存在完整的蛋白印跡;與CMD電泳條帶相比,CMD-ZIF-8@QT的蛋白印跡位置大致相同,條帶顏色相似(見圖3),說明兩者含有相同的蛋白成分,即癌細(xì)胞膜在制備和超聲包覆的過程中,蛋白很好地保留下來。

圖1 ZIF-8,ZIF-8@QT,CMD-ZIF-8@QT的表征圖Figure 1 Characterization of ZIF-8,ZIF-8@QT, CMD-ZIF-8@QT

圖2 ZIF-8,ZIF-8@QT與CMD-ZIF-8@QT的透射電鏡形貌與粒徑結(jié)果圖Figure 2 Morphology and particle size of ZIF-8, ZIF-8@QT and CMD-ZIF-8@QT under transmission electron microscope

2.2 CMD-ZIF-8@QT的制劑學(xué)評價

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以QT濃度x對吸光度y

1.ZIF-8;2.CMD;3.CMD-ZIF-8@QT圖3 SDS-PAGE的蛋白印跡結(jié)果Figure 3 SDS-PAGE of ZIF-8, CMD and CMD-ZIF-8@QT

作圖,進(jìn)行線性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；貧w方程為y=0.057 9x-0.011,R2=0.999,槲皮素的濃度在1～10 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見圖4)。

圖4 QT的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 Standard curve of QT

2.2.2 包封率與載藥量的測定 結(jié)果表明,ZIF-8在加入低質(zhì)量的QT時,具有較高的包封率和較低載藥量,且隨著QT質(zhì)量的增加,包封率明顯下降,載藥量增加不明顯。綜合不同質(zhì)量的QT對ZIF-8納米粒包封率和載藥量的影響,QT的加入量確定為15 mg,此時具有較高的包封率和載藥量,包封率和載藥量分別為84.2% ±1.42%和16.8% ±0.64%(見圖5)。

圖5 包封率與載藥量隨著QT的給藥劑量變化趨勢圖Figure 5 Change trend of encapsulation efficient and drug loading content with the dose of QT

2.2.3 酸響應(yīng)釋藥 結(jié)果表明,CMD-ZIF-8@QT在正常生理pH條件下是穩(wěn)定的,在酸性的環(huán)境中,ZIF-8中的2-甲基咪唑和Zn2+之間的配位鍵會被破壞,導(dǎo)致ZIF-8裂解,從而實現(xiàn)藥物的釋放。在pH 5.0的條件下,孵育15 h,有高達(dá)88.6% ±1.6%的QT從CMD-ZIF-8@QT載體中釋放出來,而在pH 7.4的條件下,15 h僅有8.1% ±2.3%的QT釋放出來(見圖6)。因此,得出仿生納米載藥系統(tǒng)CMD-ZIF-8@QT在正常生理條件下pH是穩(wěn)定的,并具有良好的酸敏感性。

2.2.4 CMD-ZIF-8@QT的穩(wěn)定性實驗 采用pH 7.4 PBS溶液和含有10% FBS的pH 7.4 PBS溶液模擬體內(nèi)正常生理環(huán)境,考察CMD-ZIF-8@QT在48 h內(nèi)納米粒的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,CMD-ZIF-8@QT在PBS溶液中48 h內(nèi)能保持其穩(wěn)定性,粒徑小幅度增加,表明穩(wěn)定性良好。在含有10% FBS的pH 7.4 PBS溶液,納米載體由于FBS中含有一些蛋白質(zhì)和無機(jī)物,粒徑整體略大于在PBS溶液中的粒徑(見圖7)。因此,可知CMD-ZIF-8@QT納米粒子在體內(nèi)遞送時具有一定的穩(wěn)定性。

圖6 CMD-ZIF-8@QT在pH 5.0與pH 7.4條件下的QT累積釋放情況Figure 6 QT cumulative release of CMD-ZIF-8@QT under pH 5.0 and pH 7.4

圖7 CMD-ZIF-8@QT在PBS和含10% FBS的PBS中的穩(wěn)定性Figure 7 Stability of CMD-ZIF-8@QT in PBS and PBS containing 10% FBS

2.3 CMD-ZIF-8@QT的體內(nèi)評價

2.3.1 CMD-ZIF-8@QT體內(nèi)分布實驗 結(jié)果表明,注射Cy5與Cy5-CMD-ZIF-8后,熒光大部分聚集于肝臟,與對照組相比,Cy5-CMD-ZIF-8組在腫瘤部位表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光,用小動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)一步ROI半定量分析,發(fā)現(xiàn)Cy5-CMD-ZIF-8組具有較好腫瘤組織靶向性和聚集性(P<0.01,見圖8)。

2.3.2 CMD-ZIF-8@QT在動物體內(nèi)的藥效實驗 結(jié)果表明,CMD-ZIF-8@QT組與QT組相比在體內(nèi)抑制腫瘤效果方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),藥物對腎臟無明顯影響(見圖9)。因此,得出構(gòu)建了一種可以增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果,并且對小鼠的肝腎無明顯影響的藥物遞送系統(tǒng)。

B.Cy5-CMD-ZIF-8離體心、肝、脾、肺、腎與腫瘤的熒光分布 與對照組相比,* *P<0.01圖8 CMD-ZIF-8在體內(nèi)分布情況Figure 8 Distribution of CMD-ZIF-8 in vivo

圖9 CMD-ZIF-8@QT的抗腫瘤作用Figure 9 Anti-tumor effect of CMD-ZIF-8@QT

3 討論

最近,研究者從紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞獲取仿生材料進(jìn)行納米藥物研究已成為研究熱點,其中2種或2種以上細(xì)胞膜混合得到性能更優(yōu)越的納米靶向載體也開始成為研究方向。例如,Long等[17]構(gòu)建的紅細(xì)胞膜和癌細(xì)胞膜雜交后與酸敏感脂質(zhì)體結(jié)合的復(fù)合遞藥系統(tǒng),Hao等[18]利用靶向多肽修飾紅細(xì)胞膜包裹ZIF-8等都是采用仿生材料作為遞藥系統(tǒng)的典型。但是,復(fù)雜的仿生遞藥系統(tǒng)不僅帶來更多的不穩(wěn)定性,也帶來工藝復(fù)雜性和工業(yè)化生產(chǎn)成本高昂的弊端[19]。

在本研究的合成工藝中,納米藥物外層包裹混合膜材料后,粒子接近類球形,提高了納米藥物在體內(nèi)的流動性,有利于載體藥物在體內(nèi)的遞送。動物實驗中,與其他組相比,CMD-ZIF-8@QT組抑瘤效果明顯,并且治療結(jié)束后,與對照組相比,CMD-ZIF-8@QT組肝腎的HE染色結(jié)果無明顯差異,這表明癌細(xì)胞膜的修飾不僅增強(qiáng)了藥物的腫瘤靶向性,顯著抑制腫瘤生長,同時,藥物CMD-ZIF-8@QT對肝腎功能均無明顯損害,確保了仿生藥物的用藥安全性。另外,仿生藥物能夠有效抑制腫瘤體積,這也提示癌細(xì)胞表面可能保留了多種腫瘤相關(guān)抗原分子,當(dāng)其被抗原呈遞細(xì)胞攝取時,提高腫瘤的適應(yīng)性免疫反應(yīng),最終抗腫瘤作用大大增強(qiáng),其相關(guān)具體免疫機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之,本研究通過簡單的工藝將癌細(xì)胞膜與DSPE混合制成混合膜修飾在ZIF-8@QT表面,成功制備出一種仿生納米藥物,其不但提高了QT的抗腫瘤效果,而且減小了藥物對肝腎的毒副作用,使藥物的安全性得到改善,也為藥物的仿生化提供了參考依據(jù)。