羅 丹,李媛媛,秦雪梅,杜冠華,周玉枝(山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 00006;山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所;通訊作者,E-mail:zhouyuzhi@sxu.deu.cn)

在我國(guó)中華文明史中酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng),適當(dāng)飲酒有益于加快代謝、還可舒緩心情,具有通絡(luò)散寒止痛等功效。但酒為濕熱有毒之品,短時(shí)間內(nèi)引入過量酒精會(huì)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體多種臟器功能,其中對(duì)肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)的傷害尤為嚴(yán)重。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,主要表現(xiàn)在行為學(xué),如運(yùn)動(dòng)平衡功能失調(diào)、空間記憶力及肢體肌力的降低等[1-4]。肝臟作為乙醇代謝及解毒的重要器官,飲酒過度會(huì)導(dǎo)致肝臟病理性損傷,從而引發(fā)酒精性肝病(alcoholic liver dieaseas,ALD)[5]。越來越多研究表明ALD與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[6,7]。這是由于乙醇代謝過程中會(huì)增加人體內(nèi)的自由基或活性氧,此時(shí)機(jī)體抗氧化水平降低,促氧化劑的產(chǎn)生增加,致使酗酒者體內(nèi)促氧化劑和抗氧化劑之間存在不平衡,引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。從目前看來,市場(chǎng)上涌現(xiàn)出的解酒護(hù)肝藥物都有一定的局限性[9,10]。因此,開發(fā)天然、有效的抗氧化劑作為解酒護(hù)肝產(chǎn)品是一個(gè)良好的策略。

黃芩葉(Scutellaria baicalensis leaves,SBL)作為唇形科黃芩屬植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的非藥用部位,同樣具有清熱燥濕、瀉火解毒、消炎、促消化之功效。并且黃芩葉作為別樣茶飲用歷史悠久,山西等地民間常將黃芩葉自制成具有保健功能的黃芩葉茶[11],目前黃芩葉食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)已被列入山西省2020年食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)制定計(jì)劃中?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃芩葉因含有豐富的黃酮類化合物而具有良好的抗氧化保肝活性[12]。目前已有報(bào)道明確黃芩莖葉總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷和肝纖維化有顯著的保護(hù)作用[13,14]。因此為進(jìn)一步擴(kuò)大黃芩葉資源利用,也為開發(fā)具有保健食用功能的黃芩茶等產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù),需要進(jìn)一步研究黃芩葉是否具有解酒和防治酒精性肝損傷的功效。本文圍繞黃芩葉總提物(Scutellaria Baicalensis leaf extract,SBLE)的解酒保肝作用展開研究,在實(shí)驗(yàn)中以56°紅星二鍋頭灌胃小鼠,然后用SBLE進(jìn)行干預(yù),通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)探討SBLE的解酒作用。并對(duì)肝損傷小鼠血清AST、ALT、TG水平和肝組織中SOD、GSH-Px、ADH活性和MDA含量進(jìn)行分析,明確SBLE的解酒護(hù)肝作用,以期為黃芩葉的開發(fā)應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測(cè)試劑盒(C010-2-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測(cè)試劑盒(C009-2-1)、甘油三酯(triglycerides,TG)檢測(cè)試劑盒(A110-1-1)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒(A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒(A003-1-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(A005-1-2)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydroge-nase,ADH)檢測(cè)試劑盒(A005-1-2);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Morris水迷宮(150 cm×60 cm×30 cm;北京眾實(shí)科技股份有限公司);infinite M200 PRO酶標(biāo)儀(ECAN公司);自制金屬網(wǎng)格(孔徑1 cm×1 cm);G50組織勻漿研磨儀(上海生工公司);Centrifuge TDL-5高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);TU-1810紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 藥物

黃芩葉樣本購(gòu)于山西佳辰中藥材開發(fā)有限公司,經(jīng)山西大學(xué)秦雪梅教授鑒定為黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的葉,然后進(jìn)行干燥并保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心;56°紅星二鍋頭白酒(北京紅星二鍋頭股份有限公司);水飛薊賓膠囊(天津天士力圣特制藥有限公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,體質(zhì)量為18 ～22 g,每8只小鼠飼養(yǎng)在一個(gè)籠子,使其自由飲食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境良好、恒溫(25 ±1)℃、恒濕(50 ±5)%、光照周期為12 h的晝夜交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得山西大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.4 黃芩葉總提物的制備

取一定質(zhì)量的干燥黃芩葉,第一次加10倍的水煎煮1 h,過濾得濾液。同時(shí)藥渣進(jìn)行第二次提取,繼續(xù)加10倍量的水,煎煮1 h,過濾得濾液,合并兩次濾液并濃縮,使用冷凍干燥技術(shù)制備黃芩葉總提物。

1.5 動(dòng)物分組及模型建立

選用60只SPF級(jí)ICR雄性小鼠,每組10只。各實(shí)驗(yàn)均設(shè)立空白組、模型組、黃芩葉總提物高、中、低劑量組(生藥量分別3.2,1.6,0.8 mg/kg)、水飛薊賓組(0.06 g/kg)?？瞻捉M小鼠予以0.1 ml/10 g蒸餾水灌胃;模型組小鼠灌胃同體積蒸餾水30 min后,按照1.2 ml/10 g的劑量給予56°紅星二鍋頭;黃芩葉總提物高、中、低劑量組分別按照生藥量3.2,1.6,0.8 mg/kg劑量灌胃,水飛薊賓組按0.06 g/kg劑量灌胃,30 min后,均以0.12 ml/10 g的56°紅星二鍋頭進(jìn)行酒精灌胃。各實(shí)驗(yàn)組按相應(yīng)受試物持續(xù)灌胃2周。通過行為學(xué)檢測(cè)(轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、攀爬實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)、步態(tài)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn))考察SBLE的解酒作用。并在最后一次給予酒精2 h后處死,通過計(jì)算小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)、血清肝損傷指標(biāo)和肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)、乙醇脫氫酶活性以此來評(píng)價(jià)SBLE對(duì)急性酒精誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用。

1.6 行為學(xué)檢測(cè)

1.6.1 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 小鼠分組、給藥方案同“1.5”。實(shí)驗(yàn)前剔除掉在棒上停留時(shí)間不超過3 min的小鼠。空白組給予生理鹽水,其余各組灌酒10 min時(shí)分別將動(dòng)物放入15 r/min轉(zhuǎn)棒式疲勞儀內(nèi),1只/室,記錄3 min內(nèi)小鼠第一次從轉(zhuǎn)棒上掉落的時(shí)間以及平衡失誤次數(shù)即掉落次數(shù)。

1.6.2 攀爬實(shí)驗(yàn) 小鼠分組、給藥方案同“1.5”。目前常用攀爬實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)動(dòng)物肢體肌力與協(xié)調(diào)力。給予酒精后立即將小鼠放至在水平懸空的金屬網(wǎng)中央,然后立即翻轉(zhuǎn)金屬網(wǎng),使小鼠呈倒掛狀態(tài)。觀察小鼠的攀附運(yùn)動(dòng)情況,并記錄下各組小鼠的攀附時(shí)間。以掉落3次為終止,計(jì)算3次攀附時(shí)間的均值作為其最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6.3 爬桿實(shí)驗(yàn) 小鼠分組、給藥方案同“1.5”。小鼠的肢體協(xié)調(diào)能力及運(yùn)動(dòng)遲緩狀態(tài)主要由爬桿實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià),小鼠爬桿用時(shí)越短或得分越少,說明小鼠四肢攀附能力強(qiáng)且協(xié)調(diào)性好,反之則說明小鼠協(xié)調(diào)性及攀附能力差。參考文獻(xiàn)[15]中爬桿實(shí)驗(yàn),選用直徑為15 mm,長(zhǎng)50 cm的木桿,表面包裹紗布,以增加摩擦力,防止小鼠爬桿時(shí)打滑或順桿滑下。正式實(shí)驗(yàn)開始前訓(xùn)練小鼠爬桿,直至小鼠利用后腿抱桿向下爬行,同時(shí)剔除掉抱桿停留或反向爬行的小鼠。實(shí)驗(yàn)時(shí),灌胃56°紅星二鍋頭白酒10 min后,將小鼠頭向下放置在桿的頂部,記錄其爬行總時(shí)長(zhǎng)并觀察爬行過程中的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,將3次爬桿時(shí)長(zhǎng)的平均值作為該只小鼠的爬行時(shí)間。依據(jù)文獻(xiàn)[16]所述將向下爬行過程中的行為按照如下標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分:四肢并用,一次順利從桿上爬下為0分;一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為的為0.5分;上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下,但可抱緊金屬桿為1分;滑行后掉落為1.5分;不能抓桿,直接掉落為2分。

1.6.4 步態(tài)實(shí)驗(yàn) 通過統(tǒng)計(jì)酒精誘導(dǎo)后小鼠左前肢、左后肢、右前肢、右后肢的平均步長(zhǎng)來反映小鼠肢體的步態(tài)異常。小鼠兩前肢或者兩后肢之間的平均步長(zhǎng)距離越短,則說明步態(tài)出現(xiàn)異常。參考文獻(xiàn)[17]中正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行訓(xùn)練,直至所有的動(dòng)物在沒有刺激的條件下可以不停頓地完成在跑道上的行走。實(shí)驗(yàn)裝置為長(zhǎng)60 cm,寬10 cm,兩側(cè)高8 cm的U型透明亞克力通道,開口向上,底面提前墊好已裁剪的白紙。通道的一端放置10 cm×10 cm×8 cm的立方體黑色暗盒,通道的另一端,放置前足已涂好黑色、后足已涂好紅色顏料的小鼠,使其通過亞克力通道跑入暗盒中,而后通過對(duì)白紙上留下的足印進(jìn)行步態(tài)分析。計(jì)算步態(tài)數(shù)據(jù)時(shí),一般剔除第一步和最后一步,選取足印中較清晰的連續(xù)3步。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)量并記錄以下數(shù)據(jù):左前肢平均步長(zhǎng),左后肢平均步長(zhǎng),右前肢平均步長(zhǎng),右后肢平均步長(zhǎng)。

1.6.5 水迷宮實(shí)驗(yàn) 為評(píng)估黃芩葉總提物對(duì)醉酒小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用,利用水迷宮系統(tǒng)對(duì)各組小鼠進(jìn)行連續(xù)4 d的訓(xùn)練和測(cè)試,通過定位航行和空間探索兩部分實(shí)驗(yàn)考察小鼠的認(rèn)知功能[18]。定位航行試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前4 d為訓(xùn)練階段,將水中加入黑色染料后,隨機(jī)選取第一、二、三、四象限中任意象限放入水中。每天訓(xùn)練兩次,記錄小鼠在60 s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間,即為逃避潛伏期。如果小鼠60 s內(nèi)成功找到平臺(tái),則記錄實(shí)際找到平臺(tái)所需時(shí)間則為逃避潛伏期;如果小鼠在60 s內(nèi)未能成功找到平臺(tái),此時(shí)逃避潛伏期記錄為60 s,且人為進(jìn)行引導(dǎo)使其在平臺(tái)上停留15 s?？臻g探索試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)第5天撤去平臺(tái),將小鼠面向池壁放入與平臺(tái)象限正好相對(duì)的區(qū)域水中,開始記錄小鼠60 s內(nèi)潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)以及目標(biāo)象限停留的時(shí)間,并以此判斷小鼠空間記憶能力。

1.7 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

末次灌胃后禁食不禁水6 h,小鼠摘眼球采血,3 000 r/min離心10 min,分離得到的血清按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,測(cè)定血清AST、ALT、TG;解剖取出肝臟稱重后,以生理鹽水為緩沖液制備10%肝組織勻漿,然后以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書方法測(cè)定肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、ADH的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

釆用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用one way-ANOVA進(jìn)行多組間差異比較,多組間兩兩比較采用Tukey’st檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SBLE對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能的影響

酒精灌胃處理小鼠后,空白對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)較為敏捷,且無醉酒表現(xiàn)。而在灌胃酒精10 min左右,模型組小鼠相繼出現(xiàn)行為異常的現(xiàn)象,如精神狀態(tài)不佳、后腹拖地、共濟(jì)失調(diào)等狀況。上述行為表現(xiàn)在給藥后有明顯改善。

2.1.1 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,模型組轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯縮短(P<0.001),轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)明顯增多(P<0.001,見圖1)。與模型組比較,黃芩葉總提物中劑量組和高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間明顯升高(P<0.05),水飛薊賓組和黃芩葉總提物低、中、高劑量組轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)均顯著性回調(diào)(P<0.001或P<0.01,見圖1)。提示黃芩葉具有改善乙醇所致小鼠平衡失調(diào)現(xiàn)象。

2.1.2 攀爬實(shí)驗(yàn) 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,模型組小鼠攀爬時(shí)間較空白組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。相較于模型組,給藥后黃芩葉低、中劑量組攀爬時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而黃芩葉總提物高劑量組較模型組攀爬時(shí)間提升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。以上結(jié)果說明經(jīng)黃芩葉干預(yù)后醉酒后小鼠的動(dòng)作協(xié)調(diào)性與肌肉力量得以改善。

2.1.3 爬桿實(shí)驗(yàn) 與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠爬桿時(shí)間顯著減少(P<0.001),爬桿得分明顯增大(P<0.001,見圖1)。與模型組比較,低劑量、中劑量和高劑量組小鼠爬桿時(shí)間顯著減少(P<0.01或P<0.001),低劑量和中劑量組小鼠爬桿得分較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而黃芩葉總提物高劑量組干預(yù)的小鼠爬桿得分明顯增加(P<0.05,見圖1)。說明乙醇灌胃小鼠在給予SBLE治療后,可起到改善其運(yùn)動(dòng)遲緩、協(xié)調(diào)肢體平衡的作用。

2.1.4 步態(tài)實(shí)驗(yàn) 與空白組比較,模型組小鼠的左右側(cè)的前后肢平均步長(zhǎng)均縮短(P<0.05)。與模型組比較,低劑量和中劑量組小鼠平均步長(zhǎng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是黃芩葉總提物高劑量組小鼠左前肢和左后肢平均步長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)。同時(shí)水飛薊賓組小鼠的左前肢、左后肢、右前肢、右后肢平均步長(zhǎng)較模型組均顯著增加(P<0.05或P<0.01,見圖1)。以上結(jié)果說明SBLE可緩解醉酒小鼠的步態(tài)紊亂,延長(zhǎng)平均步長(zhǎng)延長(zhǎng),從而改善其醉酒步態(tài)。

與空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖1 SBLE對(duì)醉酒小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的影響Figure 1 The effect of SBLE on the motor coordination ability of drunk mice

2.2 SBLE對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響

訓(xùn)練期間1～4 d,相比空白對(duì)照組,模型組小鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間略有下降,但是尋找到平臺(tái)的時(shí)間仍多于其余各組;同時(shí)各給藥組的逃逸潛伏期有下降趨勢(shì),但相較于模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。實(shí)驗(yàn)第5天,與正常對(duì)照組比較,模型組逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.001);給藥后,黃芩葉總提物中劑量組的潛伏期較模型組顯著縮短(P<0.001,見圖2)。與空白組比較,模型組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.001),穿越目標(biāo)象限的時(shí)間也顯著下降(P<0.05,見圖2),表明乙醇誘導(dǎo)小鼠空間探索能力和學(xué)習(xí)記憶能力有所下降。與模型組比較,黃芩葉總提物中、高劑量組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(P<0.01),而穿越目標(biāo)平臺(tái)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,急性酒精誘導(dǎo)會(huì)對(duì)空間識(shí)別和學(xué)習(xí)記憶能力造成一定的損傷,損傷的程度可能與飲酒的劑量和周期有一定的關(guān)系。而黃芩葉可以通過縮短逃逸潛伏期、增加穿越平臺(tái)次數(shù)表現(xiàn)出對(duì)醉酒小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用。

空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,* *P<0.01,* * *P<0.001圖2 SBLE對(duì)醉酒小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Figure 2 The effect of SBLE on the learning and memory of drunk mice

2.3 SBLE對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響

從實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(第0天),各組別之間的體質(zhì)量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第14天,與正常對(duì)照比較,模型組小鼠體質(zhì)量減輕(P<0.001)。給予SBLE治療后,與模型組相比,黃芩葉總提物低、中劑量組體質(zhì)量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而高劑量組體質(zhì)量較模型組相比明顯升高(P<0.05,見圖3)。與空白組比較,模型組肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01),經(jīng)過藥物干預(yù)后,黃芩葉總提物高劑量組和水飛薊賓組較模型組均有顯著回調(diào)(P<0.05,見圖3)。以上結(jié)果表明,黃芩葉總提物能夠有效逆轉(zhuǎn)酒精引起的體質(zhì)量減輕和肝臟指數(shù)升高。

2.4 SBLE對(duì)小鼠血清肝損傷指標(biāo)的影響

與正常組比較,模型組中小鼠血清AST、ALT和TG水平顯著性升高(P<0.001或P<0.05)。相較于模型組,黃芩葉總提物中劑量組和高劑量組AST水平顯著下降(P<0.001或P<0.05);中劑量組ALT水平顯著降低(P<0.01);高劑量組和水飛薊賓組TG水平均明顯下降(P<0.05,見圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩葉提取物具有一定的保肝作用。

2.5 SBLE對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

相較于空白組,模型組SOD和GSH-Px活性顯著衰減(P<0.01),MDA水平明顯增高(P<0.01),提示肝損傷小鼠體內(nèi)氧化還原失衡。相較于模型組,黃芩葉總提物中劑量組肝臟SOD和GSH-Px活性顯著提升(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.01);黃芩葉總提物高劑量組GSH-Px活性明顯增強(qiáng)(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.01,見圖5)。說明SBLE可通過提高機(jī)體抗氧化能力,來緩解乙醇對(duì)小鼠肝臟造成的損傷。

與空白組比較,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05圖3 SBLE對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響Figure 3 The effect of SBLE on body weight and liver index of mice

與空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖4 SBLE對(duì)小鼠血清肝損傷指標(biāo)的影響Figure 4 The effect of SBLE on liver injury indicators in serum of mice

空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,* *P<0.01圖5 SBLE對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)影響Figure 5 The influence of SBLE on the oxidative stress indicators of mouse liver

2.6 小鼠肝臟ADH的活性變化及其與神經(jīng)行為學(xué)的關(guān)聯(lián)分析

相對(duì)于空白組,模型組中小鼠肝臟的ADH活力極顯著下降(P<0.05),但給予黃芩葉中劑量提取物預(yù)處理后,其活力明顯增強(qiáng)(P<0.05,見圖6),而低劑量組和高劑量組ADH活性相較于模型組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明黃芩葉總提物通過提高小鼠肝臟中ADH活性,加速體內(nèi)酒精的代謝,從而減輕酒精對(duì)機(jī)體的毒性作用,達(dá)到改善酒精引起的行為異常的目的。除此之外,通過對(duì)小鼠肝組織ADH活性與醉酒小鼠行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)ADH活性與乙醇誘導(dǎo)的醉酒行為學(xué)指標(biāo)存在相關(guān)性,其中與轉(zhuǎn)棒停留時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.756 3,P<0.001),與轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.635 0,P<0.001),與攀爬時(shí)間呈正相關(guān)(r=0.501 0,P<0.05),與爬桿時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.537 6,P<0.01),與逃逸潛伏期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.670 2,P<0.001),與穿越平臺(tái)次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.633 0,P<0.001,見圖6)。從圖中可以看出,隨著肝組織中ADH活性越強(qiáng),體內(nèi)酒精代謝速度明顯加快,此時(shí)醉酒引起的共濟(jì)失調(diào)和學(xué)習(xí)記憶能力下降等癥狀得到明顯改善,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中在棒運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨之增加、掉落次數(shù)減少;攀爬實(shí)驗(yàn)中攀爬時(shí)間隨之增加;爬桿實(shí)驗(yàn)中爬行總時(shí)間隨之減少;水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃逸潛伏期也隨之降低、目標(biāo)象限穿越次數(shù)隨之增加。其中與ADH活性相關(guān)性最強(qiáng)的為轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中在棒運(yùn)動(dòng)時(shí)間,提示轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)可以作為反映醉酒平衡狀態(tài)失調(diào)可靠的行為學(xué)指標(biāo)。

圖6 肝臟ADH活性的變化與酒精誘導(dǎo)小鼠醉酒行為之間的相關(guān)性Figure 6 Changes of hepatic ADH activity and its correlation with alcohol-induced drunkeness behavior in mice

3 討論

近年來,黃芩葉作為黃芩的非藥用部位,資源量豐富卻尚未得到充分利用就被丟棄的現(xiàn)象受到人們的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,黃芩葉具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、保肝等豐富的藥理活性和藥用價(jià)值,顯示出良好的應(yīng)用前景[19]。開發(fā)的產(chǎn)品主要有可清熱燥濕、瀉火解毒、消炎、促消化的“黃芩茶”[11]、用于急性咽炎、急性扁桃體炎的“黃芩莖葉解毒膠囊”等[20]。于是為了進(jìn)一步開發(fā)出具有保健功能的產(chǎn)品,我們對(duì)其保肝活性進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研,發(fā)現(xiàn)黃芩莖葉總黃酮對(duì)乙醇損傷的小鼠肝細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用[21]。于是本實(shí)驗(yàn)針對(duì)黃芩葉總提物對(duì)于酒精誘導(dǎo)小鼠的解酒及抗酒精性肝損傷作用展開進(jìn)一步研究。水飛薊賓作為保肝藥在臨床上被廣泛應(yīng)用,其作用機(jī)制與抗氧化、清除自由基、防止脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等有關(guān),因此本研究以其為陽(yáng)性對(duì)照藥。乙醇經(jīng)由消化道吸收后,在肝臟內(nèi)代謝,當(dāng)血液中乙醇濃度過高時(shí)進(jìn)一步會(huì)隨著血液循環(huán)短時(shí)間內(nèi)大量入腦,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而產(chǎn)生明顯的醉酒反應(yīng)。臨床表現(xiàn)為昏睡、平衡失調(diào)、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力減退等癥狀。同時(shí)還會(huì)嚴(yán)重?fù)p害肝功能等[22,23]。因此,本研究采用急性酒精誘導(dǎo),從協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)、改善學(xué)習(xí)記憶能力、保肝護(hù)肝等多個(gè)方面研究黃芩葉的解酒保肝功效,初步探索其作用機(jī)制。

目前,針對(duì)酒精對(duì)機(jī)體造成的損傷主要集中在對(duì)肝損傷的研究,而對(duì)于乙醇誘發(fā)的神經(jīng)行為學(xué)變化的研究仍不是很多。因此為了較為全面地評(píng)價(jià)SBLE的解酒功效,我們對(duì)醉酒小鼠進(jìn)行了行為學(xué)評(píng)價(jià)。文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)格實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)、步態(tài)實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)小鼠醉酒后肌力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力[15,17,24]。Morris迷宮法較為廣泛地應(yīng)用于研究動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶、空間探索與認(rèn)知能力[25]。于是在本研究中,通過酒精致小鼠共濟(jì)失調(diào)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn),對(duì)SBLE的解酒作用進(jìn)行考察。結(jié)果顯示SBLE對(duì)急性酒精中毒的小鼠平衡運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)有一定的逆轉(zhuǎn)作用。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SBLE對(duì)急性酒精誘導(dǎo)所致的小鼠空間探索能力和學(xué)習(xí)記憶障礙有一定緩解作用。說明SBLE可改善小鼠醉酒后的共濟(jì)失調(diào)和學(xué)習(xí)記憶障礙,提示SBLE可能具有良好的解酒作用。

保肝功效的研究主要對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的體質(zhì)量、肝臟系數(shù)、血清肝損傷指標(biāo)、肝組織乙醇脫氫酶和氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定。當(dāng)攝入過量酒精時(shí),肝臟內(nèi)代謝生成的大量乙醛會(huì)導(dǎo)致其抗氧化系統(tǒng)的活性降低,SOD等抗氧化能力減弱,從而致使機(jī)體的氧化和抗氧化失衡,誘發(fā)氧化應(yīng)激,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化等連鎖反應(yīng),從而引起肝損傷。此時(shí)變化較為明顯的是肝臟中血清酶類,其中轉(zhuǎn)氨酶類的變化最為突出,如ALT和AST,被認(rèn)為是肝損傷的敏感指標(biāo)[26]。當(dāng)脂乙醇進(jìn)入體內(nèi)后,大量增多的磷酸甘油進(jìn)一步生成TG,導(dǎo)致脂肪在肝臟內(nèi)沉積,因此酒精性肝病往往伴隨著肝重增大。在ADH氧化系統(tǒng)中,乙醇氧化生成的乙醛是致使肝損傷的直接原因。ADH活性表現(xiàn)為降低時(shí),肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積的乙醛會(huì)進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞的損傷[27]。酒精對(duì)肝組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[28],表現(xiàn)為SOD與GSH-Px活性降低,致使MDA等脂質(zhì)過氧化物大量積聚,加速損傷肝細(xì)胞。因此,藥物一方面可以通過直接加快體內(nèi)的乙醇氧化代謝來解酒,另一方面通過增強(qiáng)清除自由基的抗氧化能力來保肝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),水飛薊賓可以顯著降低血清TG水平、增強(qiáng)肝組織GSH-Px和ADH活性。SBLE能顯著降低乙醇導(dǎo)致的小鼠血清AST、ALT、TG水平的升高;通過提高小鼠肝組織SOD和GSH-Px活性,降低肝組織MDA含量,來達(dá)到減弱酒精代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體損害的目的;通過升高肝臟內(nèi)ADH活性、加強(qiáng)肝細(xì)胞中乙醇代謝來減弱酒精對(duì)肝臟造成的損害。除此之外,將ADH和行為學(xué)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)SBLE可以通過提高ADH活性來逆轉(zhuǎn)乙醇所致的小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙及平衡性失調(diào)現(xiàn)象,因此具有良好的解酒及中樞保護(hù)作用。結(jié)果表明SBLE可以通過加速乙醇在肝臟內(nèi)的快速代謝,改善乙醇代謝物及其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致的肝細(xì)胞損傷,來發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在肝損傷保護(hù)作用方面,黃芩葉通過發(fā)揮其顯著的抗氧化功效,體現(xiàn)出與水飛薊賓同樣良好的治療作用。除此之外,對(duì)于醉酒和肝損傷指標(biāo)的逆轉(zhuǎn)方面黃芩葉表現(xiàn)出一定的效果。而且針對(duì)于目前化學(xué)藥療效不明顯、不良反應(yīng)多等問題,黃芩葉具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮藥效,毒副作用較小、安全性較高等優(yōu)勢(shì),具有良好的研發(fā)潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)SBLE對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠共濟(jì)失調(diào)和認(rèn)知記憶功能障礙具有一定的緩解作用,而且對(duì)于酒精所致小鼠的肝損傷有良好的保護(hù)作用。并通過初步探討其作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)SBLE可以提高ADH的活性從而加速乙醇在肝內(nèi)代謝,同時(shí)也減輕了乙醇對(duì)肝細(xì)胞的氧化損傷。這為黃芩葉新食品原料的研發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ),同時(shí)為黃芩葉的資源開發(fā)利用提供一定的思路。