蔡蕭君,王 欽,江柏華,劉 松,李 宇,吳圓圓,胡 楊,頡彥鵬(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院內(nèi)分泌科,哈爾濱 150036;通訊作者,E-mail:ssycxj@163.com)

肺纖維化是一種病因不明的致死性肺部疾病。患者表現(xiàn)為肺功能減退、呼吸困難和干咳[1-7]。異常的肺泡上皮傷口愈合和促纖維化途徑的激活被認為是肺纖維化的主要始發(fā)事件[8]。在不確定的情況下,臨床診斷需要兼容的放射學(xué)成像技術(shù)及侵入性方法,如支氣管鏡和外科肺活檢等,給患者及家庭帶來極大的壓力和痛苦。目前,肺纖維化的病理生理機制尚不完全清楚,且患者可能會長期伴有呼吸困難等癥狀,長此以往會誘發(fā)患者心理上的障礙,導(dǎo)致抑郁癥等心理疾病[9,10]。因此,針對性地診斷兩種疾病的“結(jié)合狀態(tài)”是有效治療的關(guān)鍵。

丹貝益肺方出自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院,由江柏華教授自擬經(jīng)驗而成;組成為丹參、黃芪、平貝、黨參、麥冬、桔梗、川芎、桃仁、五味子、補骨脂、地龍等;其對肺纖維化療效確切[11-26]。但其組方復(fù)雜、體內(nèi)作用機制不明確,這嚴重影響了該方劑的臨床有效應(yīng)用。本研究采用最新的非靶向的、高通量的糞便代謝組學(xué)技術(shù),在無損傷的前提下獲取生物體全面的生物學(xué)信息,為客觀、全面認識肺纖維化伴抑郁癥的發(fā)病機制和有效藥物的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

UltiMate 3000-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國,Thermo Fisher公司);Toledo MS204TS電子天平分析天平(美國梅特勒-托利多公司);酶標儀(MS芬蘭,型號:Labsystems Multiskan);ZJHK-40L超純水機(天津卓精虹科儀器設(shè)備技術(shù)有限公司);丹參、平貝、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補骨脂、麥冬、五味子購自于哈爾濱世一堂有限公司,經(jīng)蔡蕭君教授鑒定為正品;水合氯醛(上海源葉生物技術(shù)有限公司);谷胱甘肽試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、丙二醛試劑盒購自于京建成生物工程研究所(批號20191101、20190204、20191112);IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:ml063132);IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:ml064292);TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號:ml077385);博萊霉素:日本化藥株式會社;脂多糖(Sigma-Aldrich公司,批號:L2630-100 mg)。

1.2 動物

雄性清潔級SD大鼠30只,體質(zhì)量(150±20)g;黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實驗室提供(動物許可證號SCXK(黑)2019-0004);飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(22 ±5)℃,濕度54% ±19%;給與大鼠標準飼料和飲水。為排除性別因素引入的系列干擾,且考慮肺纖維化伴抑郁復(fù)合模型對動物體質(zhì)要求較高,故本實驗選取健康雄性SD大鼠。

1.3 丹貝益肺方溶液配制

丹貝益肺方由丹參、貝母、川芎、桃仁、地龍、黃芪、黨參片、麥冬、五味子、補骨脂、桔梗等組成,藥物飲片由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥局提供,水煎濃縮制成生藥濃度為0.6 g/ml的水煎液[26],大鼠灌胃劑量為6 g/kg。

1.4 模型復(fù)制及樣本制備

健康雄性SD大鼠24只,根據(jù)實驗第0天體質(zhì)量隨機分為三組,即對照組、模型組、丹貝益肺方組。所有大鼠在適應(yīng)環(huán)境1周后給與10%水合氯醛進行麻醉,對照組大鼠氣管內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液,同時腹腔注射無菌生理鹽水,每日1次,連續(xù)4 d。模型組及丹貝益肺方組大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素(5 mg/kg),同時連續(xù)4 d腹腔注射脂多糖(0.5 mg/kg)建立抑郁模型[27],造模1 d后丹貝益肺方組大鼠灌胃給與丹貝益肺方進行干預(yù)(每天1次,劑量6 g/kg),連續(xù)28 d。收集所有組實驗第28天糞便,-80 ℃保存,以電子天平精確稱取100 mg的糞便樣品,置于1.5 ml的離心管中,加入2 ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH=7.0);渦旋震蕩10 min、超聲15 min,離心(12 000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液400 μl用于代謝組學(xué)分析。實驗第29天,以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,血清樣本和大腦前額皮質(zhì)組織用于1.5部分檢測生化指標。其中收集的新鮮血液樣本靜置30 min后離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min),取上清液置于-80 ℃保存,腦組織置于液氮環(huán)境5 min后-80 ℃保存。

1.5 檢測各組大鼠MDA、GSH、SOD、IL-1β、IL-6、TNF-α活性

分離的大腦前額葉皮質(zhì)制備組織勻漿,離心(4 ℃,12 000 r/min,10 min),收集上清液,采用生化分析儀測定MDA、GSH、SOD含量,按照ELISA檢測試劑盒操作說明書檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平。

1.6 大鼠定位航行實驗

實驗階段隔1星期進行1次水迷宮實驗,記錄各組大鼠找到平臺花費時間。

1.7 糞便代謝組學(xué)分析條件

UltiMate 3000-Q-Exactive液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國,Thermo Fisher公司),柱溫45 ℃,流速0.4 ml/min,錐孔電壓正離子3 500 V、負離子2 500 V。流動相A(0.1%甲酸水),流動相B(0.1%乙腈)。糞便代謝物梯度洗脫條件:0～1 min,98%A;1～2 min,95%～80%A;2～6 min,80%～40%A;6～10 min,40%～98%A。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

采用Compound Discoverer 3.2小分子數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),將獲取到的Raw文件直接帶入,并進行數(shù)據(jù)預(yù)處理和數(shù)據(jù)處理流程,以Student’sttest,P<0.05且倍數(shù)差(fold change)>1的值為差異代謝物標準,結(jié)合開源的MzCloud標準品數(shù)據(jù)庫進行精準鑒定。生化指標采用SPSS 18軟件以Student’sttest進行單變量分析比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標結(jié)果

各組大鼠前額皮質(zhì)中IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA、GSH和SOD的表達比較結(jié)果見表1。與對照組相比,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,丹貝益肺方組IL-1β、IL-6和TNF-α均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。與對照組比較,模型組MDA、GSH、SOD顯著降低(P<0.05);與模型組比較,丹貝益肺方組MDA、GSH和SOD指標均顯著增加(P<0.05)。

表1 各種大鼠肺纖維化及抑郁癥生化指標結(jié)果

2.2 大鼠定位航行能力結(jié)果

與對照組相比,模型組大鼠定位平臺時間顯著增加(P<0.05);與模型組相比,丹貝益肺方組定位平臺的時間明顯減少(P<0.01)。說明模型組大鼠定位能力下降,給予丹貝益肺方有明顯回調(diào)作用。

表2 大鼠水迷宮定位航行結(jié)果

2.3 大鼠糞便代謝組學(xué)研究

通過主成分分析可知,三組大鼠的糞便的代謝輪廓聚類明顯,由組間聚類可知對照組和模型組分離明顯(見圖1),證明肺纖維化伴抑郁癥大鼠的整體代謝發(fā)生變化,致使與健康狀態(tài)大鼠發(fā)生顯著分離,給與丹貝益肺方治療后,發(fā)生回調(diào),部分大鼠整體代謝狀態(tài)與對照組一致,證明丹貝益肺方對肺纖維化伴抑郁癥的療效顯著。

圖1 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便PCA得分圖Figure 1 Fecal PCA score of rats with pulmonary fibrosis and depression

進一步通過火山圖篩選生物標記物,對空白組和模型組代謝數(shù)據(jù)進行t檢驗及Fold Change分析,生物標記物結(jié)果見表3,圖2。

與模型組比,丹貝益肺方組5個生物標記物有降低趨勢,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。對獲取到的5個生物標記物進行代謝通路分析可知,肺纖維化伴抑郁癥大鼠主要涉及色氨酸代謝和嘌呤代謝(見圖3)。為可視化丹貝益肺方在治療肺纖維化合并抑郁癥的作用機制,將涉及的標記物及關(guān)鍵代謝酶帶入Cytoscape3.2.1軟件進行通路分析,繪制針對“肺纖維化伴抑郁癥的代謝通路圖”。如圖3所示,本次復(fù)合模型得到的5個生物標記物中,只有3個涉及在代謝網(wǎng)絡(luò)中,即犬尿酸、肌苷和硫酸雄甾酮。此代謝過程涉及多個代謝酶及代謝產(chǎn)物,且上述3種代謝酶都處于核心位置,將多個代謝酶及其他成分進行關(guān)聯(lián),由此推斷丹貝益肺方可能通過上述靶標的調(diào)節(jié)達到整體調(diào)節(jié)代謝通路、有效干預(yù)代謝通路中其他代謝成分的目的。

表3 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便生物標志物信息

圓圈代表代謝物,紅色和綠色圓圈代表FC小于1,同時t檢驗絕對值小于0.05的代謝組,藍色圓圈為符合標準的代謝物圖2 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便火山圖Figure 2 Fecal volcanogram of rats with pulmonary fibrosis and depression

3 討論

臨床上肺纖維化患者因長期患病對生活和工作引入生理及病理狀態(tài),多數(shù)伴有不同程度的抑郁癥發(fā)生。精準針對及有效預(yù)防此類復(fù)合型疾病的應(yīng)對措施是控制這一發(fā)病率高、危害性大疾病的有效手段。本研究采用高通量的組學(xué)技術(shù)對糞便代謝物數(shù)據(jù)進行采集和分析,在對生物體無損傷的前提下發(fā)現(xiàn)了與抑郁癥相關(guān)的一系列代謝物變化,為臨床抑郁癥生物標記物及有效診斷提供實驗依據(jù)。

模型組大鼠糞便代謝物中一致地發(fā)現(xiàn)溶血磷脂膽堿(LysoPC)成分的顯著性變化,LysoPC是溶血磷脂酸的前體,溶血磷脂酸是一種具有生物活性的甘油磷脂。在脂肪酸的長度和飽和度上,存在多種不同的溶血磷脂酸類型。溶血磷脂酸涉及全身性硬化或多發(fā)性硬化、神經(jīng)性硬化、溶血磷脂酸炎癥、胚胎性硬化。溶血磷脂酸通過上皮細胞死亡、血管滲漏和成纖維細胞遷移和增殖誘導(dǎo)肺、腎和肝纖維化[28-30]。溶血磷脂酸受體1的基因抑制和自體毒素酶的拮抗都可以預(yù)防肺纖維化。溶血磷脂酸受體1缺陷小鼠在博萊霉素損傷后沒有發(fā)生肺纖維化[31]。此外,溶血磷脂酸受體2基因敲除小鼠在應(yīng)用博萊霉素后不會出現(xiàn)肺纖維化。此外,人肺成纖維細胞中TGF-β的表達受到抑制[32]。目前,溶血磷脂酸的來源尚不清楚。溶血磷脂酸的生產(chǎn)至少有兩種不同的來源。一種是磷脂酶A1和A2水解細胞膜上的磷脂酸。但大多數(shù)溶血磷脂酸是由溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰絲氨酸的酶切產(chǎn)生的,溶血磷脂酰絲氨酸是由溶血磷脂酰磷酸酶D活性的自毒素(ATX)產(chǎn)生的。在肺纖維化患者體內(nèi)上皮細胞損傷,特別是2型肺泡上皮細胞,被認為是引發(fā)纖維化過程的原因。肺損傷后,二棕櫚酰磷脂酰膽堿作為主要的表面活性物質(zhì)脂質(zhì)成分,被2型肺泡上皮細胞的磷脂酶A2活性降解為溶血磷脂酰膽堿。這與本次實驗發(fā)現(xiàn)的模型組大鼠糞便代謝物中LysoPC表達水平升高一致。給與丹貝益肺方進行治療后,其含量有降低趨勢,證明丹貝益肺方能靶向性調(diào)節(jié)磷脂酶A2活性,最終達到調(diào)節(jié)代謝物L(fēng)ysoPC含量的目的。

犬尿酸與抑郁癥有極為密切的關(guān)系,抗抑郁藥治療前抑郁癥患者血漿犬尿酸濃度與疾病嚴重程度的關(guān)系最為顯著。然而,是否有代謝物或單核苷酸多態(tài)性基因型可能與抑郁癥癥狀的基線嚴重程度相關(guān)尚不清楚。抑郁癥的病理生理幾乎肯定是異質(zhì)性的。大量的數(shù)據(jù)支持單胺類神經(jīng)傳遞的變異有助于抑郁癥病理生理學(xué)的假說。此外,炎癥也可能在抑郁癥病理生理學(xué)中起重要作用。與非抑郁癥患者相比,抑郁癥患者的促炎性細胞因子濃度已顯示出增加,并且與抑郁癥狀的嚴重程度呈正相關(guān)[33-35]。此外,感染、內(nèi)毒素暴露、細胞因子的治療性應(yīng)用和心理壓力都會引發(fā)炎癥并導(dǎo)致抑郁癥狀。腸道微生物相關(guān)的炎性細胞因子釋放也可能是通過“微生物群—腸道—大腦”軸導(dǎo)致抑郁癥狀的機制。重要的是,具有高水平炎癥的抑郁癥患者對傳統(tǒng)的抗抑郁治療反應(yīng)不佳,但他們可能對細胞因子拮抗劑有反應(yīng)。此外,“神經(jīng)傳遞”和“炎癥”假說并不相互排斥,可能與色氨酸代謝有關(guān)。色氨酸是5-羥色胺和犬尿酸的前體。鑒于5-羥色胺神經(jīng)傳遞的重要性,色氨酸代謝從5-羥色胺分流到犬尿酸生物合成途徑可能有助于抑郁癥的病理生理學(xué)?！叭蛩嵬緩健钡牡谝徊接蛇胚岚?,3-雙加氧酶1和吲哚胺2,3-雙加氧酶1或色氨酸2,3-雙加氧酶2催化。炎性細胞因子可增加吲哚胺2,3-雙加氧酶的表達,從而激活“犬尿酸途徑”,導(dǎo)致出現(xiàn)抑郁樣行為。犬尿酸與5-羥色胺不同,它能穿過血腦屏障,大腦中的大部分犬尿酸來源于外周血。犬尿隨后被犬尿酸途徑氨基轉(zhuǎn)移酶進一步代謝,產(chǎn)生下游代謝物,例如具有神經(jīng)保護作用的犬尿喹啉酸。這些下游代謝物可通過其對N-甲基-D-天冬氨酸受體的作用在疾病病理生理學(xué)中發(fā)揮作用。這可能是導(dǎo)致抑郁癥癥狀的機制。綜上所述,本次實驗發(fā)現(xiàn)的犬尿酸含量異常與模型中抑郁癥的表現(xiàn)一致,給與丹貝益肺方治療后呈顯著回調(diào)趨勢,在以方驗證的同時,證實了犬尿酸與肺纖維化伴抑郁癥的高度相關(guān)性,由下游代謝物的含量變化推測丹貝益肺方可能通過干預(yù)上游的5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的活性,達到干預(yù)疾病的目的,同時犬尿酸可能作為肺纖維化伴抑郁癥的有效的臨床診斷方式之一。

圖3 肺纖維化伴抑郁癥大鼠糞便代謝通路圖Figure 3 Fecal metabolic pathway of rats with pulmonary fibrosis and depression

通過上述針對性的聚焦分析發(fā)現(xiàn),本次得到的5個糞便生物標記物對肺纖維化伴抑郁癥有直接相關(guān)的內(nèi)在聯(lián)系;通過給與丹貝益肺方后得到有效回調(diào),這驗證了生物標記物與疾病及藥物的高度響應(yīng)程度;通過代謝通路分析發(fā)現(xiàn),丹貝益肺方對肺纖維化伴抑郁癥有良好的療效。調(diào)節(jié)嘌呤代謝、色氨酸代謝通路可能是其治療肺纖維化伴抑郁癥的作用機制。