馬 亮,孫一鳴,張語(yǔ)涵,王若瀾,孔令提,劉 哲(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科,蚌埠 33004;蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;通訊作者,E-mail:liuzhe@bbmc.edu.cn;共同通訊作者,E-mail:875368@qq.com)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤,據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)編制的癌癥發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計(jì),結(jié)直腸癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)排名第五(10.0%)、致死率排名第五(9.4%)[1]。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3, STAT3)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子家族(signal transduction and activator of transcription,STATs)的成員之一,能夠參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡,調(diào)節(jié)血管生成等生物活動(dòng),具有多種重要的生物功能[2]。STAT3在正常生理?xiàng)l件下短暫激活,能夠調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[3]。然而,STAT3在腫瘤細(xì)胞中持續(xù)激活,影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。研究表明,STAT3參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的重要途徑是作為轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)下游腫瘤相關(guān)基因表達(dá)[2]。此外,STAT3參與調(diào)控血管生成的關(guān)鍵步驟,STAT3高表達(dá)往往預(yù)示較差的預(yù)后以及較低的5年生存率[5]。因此,STAT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。

結(jié)直腸癌的主要治療手段包括手術(shù)治療和放化療[6],目前公認(rèn)的治療方案為FOLFIRI(伊立替康、亞葉酸鈣、5-氟尿嘧啶聯(lián)用)、mFOLFOX6(奧沙利鉑、四氫葉酸、5-氟尿嘧啶聯(lián)用)、CapeOX(奧沙利鉑、卡培他濱聯(lián)用),配合手術(shù)治療[7]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種合成的氟嘧啶類似物,5-FU及其衍生物是臨床上最常用的化療藥物。通過(guò)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞DNA合成和抑制胸苷酸合成酶活性發(fā)揮作用,5-FU可以改變結(jié)直腸癌細(xì)胞的主要細(xì)胞生物學(xué)功能(如凋亡、自噬、細(xì)胞周期等等)[8]。盡管5-FU能夠在癌癥早期治療中起到較好的效果,但是長(zhǎng)期使用5-FU會(huì)導(dǎo)致腫瘤耐藥,且結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)患者往往對(duì)5-FU敏感性不高[9]。耐藥在很大程度上限制了5-FU的化療效果,其治療患者生存中位數(shù)約為20個(gè)月[10]。研究表明STAT3與結(jié)直腸癌耐藥性有相關(guān)性,并且高表達(dá)STAT3可導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性降低。LL1是新型STAT3小分子抑制劑,通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì),特異性靶向STAT3的SH2結(jié)構(gòu)域。研究表明LL1具有很高的特異性和安全性[11],有望應(yīng)用于結(jié)直腸癌的臨床治療。本研究通過(guò)5-FU與新型STAT3抑制劑LL1聯(lián)用,觀察其對(duì)于結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,以期對(duì)于LL1與5-FU聯(lián)用治療結(jié)直腸癌提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司;胎牛血清、Trizol購(gòu)于南京邁克沃德生物公司;CCK-8試劑盒(碧云天C0038);Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于貝博公司(BB-4101);RIPA裂解液購(gòu)于碧云天公司,STAT3、p-STAT3(tyr705)、Bcl-2、c-Myc、Survivin一抗購(gòu)于武漢三鷹公司,二抗購(gòu)于南京邁克沃德生物公司,LL1{4-((2-(piperazin-1-yl)phenyl)amino)-5H-naphtho[1,8-cd]isothiazol-5-one 1,1-dioxide},由中國(guó)藥科大學(xué)余文穎課題組提供;人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院鄭海倫課題組提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HT29細(xì)胞使用含10%胎牛血清,1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1.3 PCR法檢測(cè)基因表達(dá)

使用不同濃度LL1(2,4 μmol/L)處理HT-29細(xì)胞24 h,使用Trizol從細(xì)胞中分離總mRNA,使用Hiscrip Q RT SuperMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)合成cDNA,在安裝有IQ5多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR儀上使用SYBR GREEN進(jìn)行定量RT-PCR(qRT-PCR)分析,比較組間細(xì)胞c-Myc、Survivin和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活

使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率,按照其說(shuō)明書進(jìn)行使用。體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞使用胰蛋白酶進(jìn)行消化,以5×103cells/孔的密度接種于96孔板中,每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔。24 h后,觀察細(xì)胞貼壁良好,密度適宜。對(duì)照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實(shí)驗(yàn)組使用含藥培養(yǎng)液處理,實(shí)驗(yàn)組濃度設(shè)置如下:LL1(0,1,2,4,6,8 μmol/L),5-FU(0,0.1,1,10,100,1 000 μmol/L),5-FU(0,0.1,1,10,100,1 000 μmol/L)+LL1(2 μmol/L),然后將其放回37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育。24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育1 h,使用多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度A值,記錄數(shù)據(jù),使用空白孔調(diào)零,以對(duì)照組為100%,計(jì)算各組細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%)。

1.5 集落克隆實(shí)驗(yàn)

體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞使用胰蛋白酶進(jìn)行消化,使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù),隨后稀釋成所需濃度的細(xì)胞懸液,以2×103cells/孔的密度接種于6孔板中,待其貼壁后對(duì)照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實(shí)驗(yàn)組使用含藥培養(yǎng)液處理,實(shí)驗(yàn)組分別用0.8 μmol/L 5-FU或0.8 μmol/L 5-FU+0.1 μmol/L LL1處理,放置于培養(yǎng)箱中,15 d后使用顯微鏡觀察其集落形成情況。棄去培養(yǎng)液后,使用PBS沖洗一遍。隨后使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定0.5 h,棄去多聚甲醛,使用PBS沖洗一遍后,加入結(jié)晶紫染液染色0.5 h,棄去結(jié)晶紫,倒扣在紙上待其干后進(jìn)行拍照,比較不同處理組集落形成能力差別。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞使用胰蛋白酶進(jìn)行消化,使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù),隨后稀釋成所需濃度的細(xì)胞懸液,以2×105cells/孔的密度接種于6孔板中,待其貼壁后對(duì)照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實(shí)驗(yàn)組使用含藥培養(yǎng)液處理,實(shí)驗(yàn)組分別用1 μmol/L 5-FU或1 μmol/L 5-FU+2 μmol/L LL1處理,放置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,PBS洗滌一遍后使用不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化,細(xì)胞懸液以1 000g,4 ℃離心5 min收集細(xì)胞,棄去上清,用冷PBS洗滌兩次,用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,濃度大約為1×106cells/ml。按照說(shuō)明書在細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC,輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min,加入5 μl PI后輕輕混勻于2～8 ℃避光條件下孵育5 min。在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè),記錄相關(guān)數(shù)據(jù),比較不同組凋亡率。

1.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞使用胰蛋白酶進(jìn)行消化,使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法進(jìn)行計(jì)數(shù),隨后稀釋成所需濃度的細(xì)胞懸液,以2×105cells/孔的密度接種于6孔板中,待其貼壁后對(duì)照組使用新鮮培養(yǎng)液,而實(shí)驗(yàn)組使用含藥培養(yǎng)液處理,實(shí)驗(yàn)組分別用1 μmol/L 5-FU或1 μmol/L 5-FU+2 μmol/L LL1處理,放置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,使用胰酶消化收集HT-29細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,BCA(bicinchoninic acid)法校正不同組別蛋白濃度,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis PAGE)后半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜;快速封閉液封閉30 min后4 ℃過(guò)夜孵育STAT3總蛋白,p-STAT3(tyr705)蛋白,Bcl-2,c-Myc,Survivn蛋白抗體,TBST洗膜15 min后加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗,孵育2 h。Bio-rad成像系統(tǒng)曝光。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 LL1影響STAT3下游基因mRNA表達(dá)水平

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,與0 μmol/L組相比,2,4 μmol/L LL1組結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞c-Myc,Survivin和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 RT-PCR檢測(cè)LL1對(duì)c-Myc,Survivin和Bcl-2基因表達(dá)水平的影響

2.2 LL1增強(qiáng)5-FU對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞存活的抑制作用

CCK-8結(jié)果顯示,LL1可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖(見(jiàn)表2)。與相應(yīng)濃度的5-FU組相比,5-FU+LL1聯(lián)用組結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表2 不同濃度LL1對(duì)HT-29細(xì)胞存活的影響

2.3 LL1增強(qiáng)5-FU對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞集落克隆形成的抑制作用

細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,低濃度聯(lián)用組和低濃度5-FU組集落數(shù)均顯著減

表3 不同濃度5-FU單用及與LL1聯(lián)用對(duì)HT-29細(xì)胞存活的影響

少(P<0.05),且低濃度聯(lián)用組集落數(shù)小于低濃度5-FU組(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與低濃度5-FU相比,#P<0.05圖1 5-FU對(duì)HT-29細(xì)胞集落克隆形成的影響Figure 1 Effect of 5-FU on colony formation of HT-29 cells

2.4 LL1增強(qiáng)5-FU對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用

PI/Annexin Ⅴ雙染實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,高濃度聯(lián)用組和高濃度5-FU組細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<0.05),且高濃度聯(lián)用組凋亡率大于高濃度5-FU組(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與高濃度5-FU組相比,#P<0.05圖2 LL1增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡的能力Figure 2 LL1 enhances the induction of 5-FU to apoptosis of HT-29 cells

2.5 LL1與5-FU聯(lián)用抑制STAT3及下游蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,與高濃度5-FU組相比,高濃度聯(lián)用組p-STAT3及下游蛋白c-Myc,Survivin和Bcl-2表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與高濃度5-FU組相比,#P<0.05圖3 Western blot檢測(cè)LL1與5-FU聯(lián)用對(duì)STAT3及下游蛋白表達(dá)水平的影響Figure 3 The effect of LL1 combined with 5-FU on the expression of STAT3 and downstream proteins by Western blot

3 討論

近年來(lái),世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率和致死率逐步攀升。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示,在歐美國(guó)家,結(jié)直腸癌是第三常見(jiàn)的癌癥。而在亞洲國(guó)家,其發(fā)生率也在逐步上升。在中國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)病率近十年幾乎翻了一倍,其發(fā)病越來(lái)越趨向于低齡化、年輕化[12],約50%的結(jié)直腸癌患者在數(shù)年內(nèi)死亡[13,14]。

結(jié)直腸癌常用的治療方法有手術(shù)治療、放療、化療等。其中,手術(shù)治療對(duì)于早期患者有著較好的療效,可以顯著改善患者的生存質(zhì)量[15]。然而,隨著病程的進(jìn)展,結(jié)直腸癌的治療難度急劇上升,單一的手術(shù)治療已難以達(dá)到令人滿意的效果。此時(shí),需要根據(jù)患者實(shí)際情況采用化療、放療聯(lián)合手術(shù)治療的綜合治療方法。5-FU作為最常見(jiàn)的結(jié)直腸癌化療藥物之一,擁有良好的治療效果。其作用機(jī)制包括干擾RNA的合成和功能,抑制胸苷酸合酶等。隨著化療的深入,耐藥性的產(chǎn)生不可避免。5-FU的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜,耐藥性會(huì)限制化療效果,最終導(dǎo)致治療失敗[16]。

STAT3是STATs蛋白家族成員之一,參與細(xì)胞的增殖分化、凋亡、侵襲遷移等等過(guò)程。在惡性腫瘤中,其最主要參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的途徑是作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控下游腫瘤基因表達(dá),同時(shí)參與血管基底膜重構(gòu)[2]。研究發(fā)現(xiàn),STAT3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌以及前列腺癌等多種實(shí)體瘤組織與細(xì)胞中異常表達(dá)或活性增強(qiáng)[17]。研究表明,STAT3下游的Bcl-2、Survivn與結(jié)直腸癌產(chǎn)生的5-FU耐藥性相關(guān)[18],且c-Myc基因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[19]。在本研究中,我們分別使用了RT-PCR法以及Western blot法檢測(cè)LL1對(duì)于結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞Bcl-2、c-Myc、Survivn mRNA表達(dá)情況的影響以及與高濃度5-FU組相比,LL1與5-FU聯(lián)用對(duì)于STAT3以及其下游Bcl-2、c-Myc、Survivn蛋白表達(dá)情況的影響。結(jié)果表明,LL1可以抑制HT-29細(xì)胞Bcl-2、c-Myc、Survivn mRNA表達(dá),且高濃度聯(lián)用組相比較高濃度5-FU組,p-STAT3以及Bcl-2、c-Myc、Survivn蛋白表達(dá)均顯著下降。同時(shí),CCK-8法結(jié)果顯示5-FU+LL1聯(lián)用組對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制較5-FU組較強(qiáng),而集落克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低濃度聯(lián)用組較低濃度5-FU組集落數(shù)目顯著減少。此外,Bcl-2是經(jīng)典的抗凋亡基因,Cory等[20]報(bào)道,在許多腫瘤中存在Bcl-2的過(guò)度表達(dá)。在本研究中,我們進(jìn)行了PI & Annexin Ⅴ雙染實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高濃度聯(lián)用組細(xì)胞凋亡率顯著高于高濃度5-FU組,結(jié)合Western blot以及PCR結(jié)果,猜想可能是通過(guò)抑制STAT3進(jìn)而抑制Bcl-2表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此,LL1可能通過(guò)抑制STAT3并影響其下游基因Bcl-2、c-Myc、Survivn等表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)增加結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。

綜上,本研究表明LL1可增加結(jié)直腸癌對(duì)于5-FU化療的敏感性,其機(jī)制可能是抑制STAT3并影響其下游基因表達(dá)。本研究為臨床治療結(jié)直腸癌及逆轉(zhuǎn)5-FU耐藥提供新的思路。