王梓祎，茍盼盼，楊金，馬明星，楊詩晨，李楠，仇雪梅

(大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023)

生長激素釋放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)由下丘腦合成分泌[1]，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。生長激素釋放激素不僅具有調節(jié)生長激素的釋放和調節(jié)神經(jīng)的作用，而且能促進動物的生長發(fā)育，參與免疫系統(tǒng)調節(jié)、細胞分化、細胞增殖等生物學過程[2-4]。在GHRH基因研究中，有關SNP位點與生長性狀的關聯(lián)分析在畜牧中報道較多。張存芳[5]發(fā)現(xiàn)，GHRH基因中有3個位于非編碼區(qū)的SNP位點與南陽牛Nanyangcattle的體質量、體斜長等生長性狀相關。Cheong等[6]在韓國本土牛GHRH基因中發(fā)現(xiàn)了1個與胴體相關的SNPs位點。水產(chǎn)動物GHRH基因的SNP位點與生長性狀的關聯(lián)分析也有少量報道，如Guo等[7]在點帶石斑魚Epinepheluscoioides的GHRH基因中篩選到2個與生長性狀相關的SNP位點。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因組中特定位置的單個核苷酸發(fā)生堿基突變引起的DNA序列的多態(tài)性[8-9]。SNP優(yōu)勢在于其一般只由兩種堿基構成，因此，可快速、規(guī)模化地進行篩選[10-11]。目前，SNP在水產(chǎn)領域也有較多應用，如構建遺傳圖譜或關聯(lián)分析。相關研究中，張建勇[12]根據(jù)對中國對蝦Fenneropenaeuschinensis的高通量測序結果，設計了800組SNP引物，構建了中國對蝦親本遺傳連鎖圖譜，其中，父本覆蓋率為 51.94%，母本覆蓋率為53.77%。樊佳佳等[13]在草魚Ctenopharyngodonidella檸檬酸合酶基因上篩選出2個SNPs位點，將其與草魚的6個生長性狀進行關聯(lián)分析，結果顯示，兩位點不同基因型在6個性狀的平均值上有差異但不顯著，又將其組成7種雙倍型，其中，D6屬生長優(yōu)勢雙倍型。

紅鰭東方鲀Takifugurubripes在分類學上隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes鲀形目Tetraodontiformes鲀亞目 Tetraodontoidei鲀總科Tetraodntoidea鲀科 Tetraodontidae東方鲀屬Takifugu，在中國主要分布于東海、黃海，國外則主要分布于日本、韓國、朝鮮等沿海地區(qū)，屬暖水性海洋底棲魚類[14]。紅鰭東方鲀味道鮮、營養(yǎng)高、肉質嫩，富含多種維生素，經(jīng)濟價值較高[15-16]，是中國北方重要的經(jīng)濟魚類之一。目前，國內養(yǎng)殖紅鰭東方鲀一直源自日本紅鰭東方鲀及其后代，長期繁育有可能導致該魚生長緩慢、易患疾病，一定程度上影響了紅鰭東方鲀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[17-19]。因此，開展紅鰭東方鲀的選育研究，探索分子標記輔助育種技術勢在必行。本研究中，挑選紅鰭東方鲀與生長相關的GHRH基因作為候選基因，利用PCR直接測序技術篩選GHRH基因上的SNPs，分析SNPs與紅鰭東方鲀生長性狀的相關性，以期為紅鰭東方鲀分子標記輔助育種提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅鰭東方鲀?yōu)楸狙芯繄F隊在河北省唐山市天正實業(yè)有限公司培育的紅鰭東方鲀群體，從中隨機挑選219尾個體，分別于該群體6月齡及12月齡時，參照王新安等[20]的方法測量其體長(BL)、體高(BD)、頭長(HL)、尾柄長(CPL)、尾柄高(CPD)、尾柄寬(CPW)、眼間距(IS)、體寬(BW)、頭長+軀干長(HL+TR)和體質量(BWH)共10個生長相關性狀，并取尾鰭用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 參考紅鰭東方鲀GHRH基因序列(GenBank登錄號：101063685)，利用Primer Premier 5.0軟件，針對GHRH基因的6個外顯子和5個內含子，共設計4對引物，覆蓋了GHRH整段基因(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA提取及PCR擴增 按照天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書，以尾鰭為材料提取基因組DNA，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。

PCR總反應體系(共25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP M Mixture 2 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 0.5 μL，TaKaRa Taq 0.3 μL，用ddH2O補足至25 μL。

PCR反應程序為：94 ℃下預變性30 min；94 ℃下循環(huán)變性1 min，退火復性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min，4 ℃下保存。退火溫度見表1。從紅鰭東方鲀樣本中隨機選取10尾魚的基因組用于PCR擴增，擴增后進行PCR產(chǎn)物的分離純化，然后經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 紅鰭東方鲀GHRH基因的引物序列Tab.1 Primers of GHRH gene in tiger puffer Takifugu rubripes

1.2.3 SNP分型及統(tǒng)計分析 試驗結果均以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，利用直接測序法對序列進行分析，結合Chromas和DNAman 8軟件查看測序結果峰圖，查看已知位點的基因型，確定所需的SNP位點，并擴群測序、分型。利用SeqMan軟件對全部基因型進行統(tǒng)計。用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行整理。采用 SPSS 22 軟件一般線性模型中的多元方差分析模塊進行關聯(lián)分析，因變量為形態(tài)性狀，自變量為篩選到的SNPs位點的不同基因型，顯著相關性水平設為0.05，極顯著相關性水平設為0.01。

連鎖不平衡是給定群體中不同位點等位基因的非隨機關聯(lián)現(xiàn)象[24]，利用Hapioview 4.1軟件，對篩選出的GHRH基因SNPs位點進行連鎖不平衡分析，結果由r2和D′表示，其中r2表示重組和突變的程度，D′表示重組程度。當D′>0.8且r2>0.33時，兩位點為完全連鎖狀態(tài)，此時兩個位點將作為一個整體進行遺傳，若只滿足一個條件，則為連鎖狀態(tài)[25]。用Excel 2019的TTEST、AVERAGE和STDEV.P公式進行雙倍型分析。

2 結果與分析

2.1 GHRH基因的PCR擴增結果

將設計好的4對引物均進行PCR試驗，擴增目的片段，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示，PCR條帶單一，特異性好，無雜帶，將4對引物的PCR產(chǎn)物片段純化回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

2.2 GHRH基因序列的SNP位點獲得和分析

通過PCR測序結果發(fā)現(xiàn)，在GHRH基因的4對引物中，除G2引物外其余3對引物中均檢測出SNP位點。因此，將G1、G3和G4共3對引物分別進行PCR批量擴增,將PCR產(chǎn)物直接測序，對篩選出的SNP位點進行分型，采用Chromas軟件查看結果，如圖1所示，測序結果用DNAman 8軟件進行比對，共發(fā)現(xiàn)7個SNPs位點。將起始密碼子ATG的A堿基命名為1，7個SNPs位點分別為C81T、G315C(外顯子)、C1083T(外顯子)、A1524G(外顯子)、G2107A、T2125C和G2256A。

圖中黑色方框代表突變位置。The black box in the figure represents the location of the mutation.圖1 紅鰭東方鲀GHRH基因7個SNPs位點基因型Fig.1 Seven SNPs locus genotypes in GHRH gene of tiger puffer Takifugu rubripes

對3個處于外顯子上的SNPs進行突變分析，發(fā)現(xiàn)只有C1083T和A1524G兩位點突變引起氨基酸的變異，屬于錯義突變，其中，C1083T中由ATG(M)變?yōu)锳CG(T)，A1524G中GTC(V)變?yōu)锳TC(I)；而G315C位點無氨基酸的變化，屬于同義突變(圖2)。

圖2 GHRH基因3個外顯子SNPs氨基酸變化Fig.2 Amino acid changes in SNPs of 3 exons of GHRH gene

2.3 GHRH基因SNPs位點與生長性狀關聯(lián)分析

各SNPs位點與生長性狀相關性結果見表2、表3。從表2可見：在6月齡紅鰭東方鲀群體中，C81T、G315C和A1524G位點與大多數(shù)生長性狀的關聯(lián)性均呈顯著狀態(tài)，而G2107A、T2125C和G2256A位點僅與頭長和眼間距兩個性狀顯著相關；在C81T位點上，TT基因型的體質量、頭長+軀干長、眼間距和尾柄寬的平均值顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)，TT基因型的體長平均值顯著高于CT基因型(P<0.05)；在G315C位點上，CC基因型的體質量、體高、頭長、頭長+軀干長、眼間距和體寬的平均值顯著高于GC和GG基因型(P<0.05)；在A1524G位點上，AA基因型的體質量、體長、尾柄高、體高和頭長+軀干長的平均值顯著高于GG基因型(P<0.05)；在G2107A、T2125C和G2256A位點上，GG和GA基因型的頭長和眼間距均顯著高于CC基因型(P<0.05)。

表2 GHRH基因SNP位點基因型與6月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關聯(lián)分析Tab.2 Correlation analysis between the SNP genotype of GHRH gene and the growth traits of 6-month-old tiger puffer Takifugu rubripes

從表3可見：在12月齡紅鰭東方鲀群體中，各突變位點與性狀顯著關聯(lián)性與6月齡群體基本一致；在C81T位點上，TT基因型的體質量、頭長和體寬平均值顯著高于CC基因型(P<0.05)；在G315C位點上，CC基因型的體質量和頭長平均值顯著高于GC和GG基因型(P<0.05)；在A1524G位點上，AA基因型的頭長平均值顯著低于GG和AG基因型(P<0.05)，而其體長、體寬和尾柄高平均值則顯著高于GG基因型(P<0.05)；在G2256A位點上，GG基因型的頭長平均值顯著高于AA基因型(P<0.05)；在G2107A和T2125C位點上，各基因型生長性狀均無顯著性差異(P>0.05)。

另外，從表2和表3還可以看出，GHRH基因C1083T 位點的多態(tài)性與6月齡和12月齡紅鰭東方鲀的生長性狀均無顯著關聯(lián)(P>0.05)。

表3 GHRH基因SNP位點基因型與12月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關聯(lián)分析Tab.3 Correlation analysis between the SNP genotype of GHRH gene and the growth traits of 12-month-old tiger puffer Takifugu rubripes

2.4 連鎖不平衡及雙倍型分析

利用Hapioview 4.1軟件對GHRH基因的7個SNPs位點進行連鎖不平衡分析(圖3)。從圖3可見，G2256A與T2125C的D′值為0.81，兩位點處于連鎖不平衡狀態(tài)，G2107A與C1083T的D′值為0.83，也處于連鎖不平衡狀態(tài)，然而二者的r2值分別為0.311和0.089，不能同時滿足D′>0.8且r2>0.33的條件，這說明這些位點并非完全連鎖；其他位點兩兩間既不能滿足D′>0.8，也不能滿足r2>0.33，說明位點間處于彼此獨立的狀態(tài)。

從上述6月齡和12月齡紅鰭東方鲀的SNPs位點與生長性狀關聯(lián)分析中可知，7個SNPs位點中，C81T、G315C和A1524G位點與大多數(shù)生長性狀的關聯(lián)性均呈顯著狀態(tài)，因此，可用這3個位點進行雙倍型與體質量的關聯(lián)分析。在雙倍型分析中，若一種雙倍型組合的個體數(shù)小于10尾，則結果不具有參考價值，經(jīng)排除，最終形成5種雙倍型(理論雙倍型數(shù)為8種)，結果如表4所示。其中，雙倍型D3出現(xiàn)頻率最低(0.09)，雙倍型D5出現(xiàn)頻率最高(0.48)。6月齡群體中，雙倍型D3的體質量平均值最低且顯著低于雙倍型D4和D5(P<0.05)，雙倍型D4體質量平均值最高；12月齡群體中，雙倍型D3的體質量平均值最低且顯著低于雙倍型D5(P<0.05)(表4)。推測6月齡時，雙倍型D3對體質量有負相關影響，雙倍型D4和D5對體質量有正相關影響，12月齡時，雙倍型D4和D5對體質量有正相關影響。

圖中數(shù)值為D′值，單位為%。The numerical value in the figure is D′ value expressed as a percentage.圖3 GHRH基因SNPs連鎖不平衡分析Fig.3 Linkage disequilibrium analysis about the SNPs of GHRH gene

表4 GHRH基因雙倍型與6月齡及12月齡紅鰭東方鲀體質量的關聯(lián)分析Tab.4 Correlation analysis between GHRH gene diplotypes and body mass traits of 6-month-old and 12-month-old tiger puffer Takifugu rubripes

3 討論

GHRH是下丘腦分泌的肽類激素，其通過與垂體前葉生長激素受體結合來調節(jié)生長激素的合成和分泌。Farmer等[21]通過給不同年齡的豬注射GHRH，得出GHRH有促進個體生長效果的結論。張永亮等[22]通過直接注射將改良的生長激素釋放因子導入兔和鼠的骨骼肌中，發(fā)現(xiàn)可增強其體內的GH濃度。在水產(chǎn)動物方面，Tao等[8]在北極紅點鮭的GHRH基因中發(fā)現(xiàn)，特定 SNP 等位基因與早期生長之間存在顯著關聯(lián)。在紅鰭東方鲀中，僅見王艷玲[23]利用PCR-SSCP方法和DNA測序方法研究GHRH基因突變的報道，但未發(fā)現(xiàn)SNPs。因此，本研究中首次發(fā)現(xiàn)了紅鰭東方鲀GHRH基因突變與生長性狀間的關聯(lián)。

3.1 紅鰭東方鲀GHRH基因的SNPs位點篩選及其與生長性狀的關聯(lián)分析

本試驗中結果顯示，紅鰭東方鲀GHRH基因上共有7個SNP位點，分別為C81T、G315C、C1083T、A1524G、G2107A、T2125C及G2256A，其中，G315C、C1083T、A1524G存在于外顯子上，C1083T位點所在的序列由ATG(M)變?yōu)锳CG(T)，A1524G中GTC(V)變?yōu)锳TC(I)，位點突變導致氨基酸種類的改變，屬于錯義突變。外顯子上的突變如果導致氨基酸的改變，通常會導致蛋白質結構與活性的變化，甚至導致蛋白質翻譯提前終止，從而發(fā)生一系列生物學效應并對動物機體產(chǎn)生影響。本研究中位于外顯子上的3個SNP突變位點G315C、C1083T和A1524G，尤其是C1083T與A1524G 2個多態(tài)位點導致了氨基酸的改變，可能是紅鰭東方鲀個體生長性狀差異的主要原因。本研究結果顯示，GHRH基因上只有3個突變位點G315C、A1524G和C81T與2個階段的生長性狀顯著相關，且CC、AA、TT基因型分別為優(yōu)勢基因型，該研究結果也證實了GHRH基因是一個魚類生長性狀的功能候選基因，相似的研究結果在斑點交叉尾鮰Ictaluruspunetaus中也有報道。張世勇等[24]對斑點交叉尾鮰采用DNA混池測序法篩選其GHRH基因的SNP位點,并進行連鎖不平衡和單倍型分析，最終在GHRH基因中發(fā)現(xiàn)了4個與生長性狀相關的SNPs標記位點。因此，筆者推測本試驗中獲得的3個與生長性狀顯著相關的位點可以作為紅鰭東方鲀的分子標記輔助選擇位點。

3.2 SNPs位點的連鎖不平衡及雙倍型分析

連鎖不平衡是給定群體中不同位點等位基因的非隨機關聯(lián)現(xiàn)象。本研究中，G2256A與T2125C兩位點及G207A與C083T兩位點間都滿足D′>0.8，處于連鎖不平衡狀態(tài)，然而其他位點兩兩間既不能滿足D′>0.8，也不能滿足r2>0.33，說明位點間處于彼此獨立的狀態(tài)，這表明這7個SNPs位點更趨向于獨立遺傳。生物的生長性狀并非受單一位點調控，而是多個位點或微效基因互相作用共同影響，因此，分析某一單個位點并不能準確得到相關性，應將多個位點組成雙倍型組合共同分析[26-27]。本研究中對C81T、G315C和A1524G 3個SNPs位點進行雙倍型與體質量的關聯(lián)分析，去除個體數(shù)少于10的雙倍型組合，共得到5種雙倍型，將雙倍型組合與紅鰭東方鲀的體質量進行關聯(lián)分析，結果表明，6月齡群體中雙倍型D4、D5的平均值顯著高于雙倍型D3，12月齡群體中雙倍型D5的平均值顯著高于雙倍型D3，推測6月齡時，雙倍型D4、D5可能對紅鰭東方鲀的體質量有正相關影響，12月齡時，雙倍型D4、D5可能對紅鰭東方鲀的體質量有正相關影響，雙倍型D3可能有負相關影響。C81T的優(yōu)勢基因型為TT，G315C的優(yōu)勢基因型為CC，A1524G的優(yōu)勢基因型為AA。然而，TT、CC、AA的雙倍型組合個體太少而無法進行分析，從雙倍型分析結果上看，6月齡時雙倍型D4、D5為優(yōu)勢基因型，12月齡時雙倍型D5為優(yōu)勢基因型。

4 結論

1)本研究中根據(jù)紅鰭東方鲀GHRH基因序列設計引物，用直接測序法在GHRH基因上共篩選到7個SNP位點，這表明紅鰭東方鲀群體中GHRH基因存在較為豐富的突變。

2)C81T、G315C和A1524G 3個位點是對紅鰭東方鲀生長有正向影響的優(yōu)勢位點，雙倍型D4和D5為優(yōu)勢基因型，說明在后續(xù)紅鰭東方鲀選育過程中可以優(yōu)先選擇這些位點及基因型，本研究結果為紅鰭東方鲀的分子標記輔助選育提供了科學依據(jù)。