盧克祥，許柳雄，錢(qián)衛(wèi)國(guó)

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.浙江海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，舟山 316022)

斑馬魚(yú)Daniorerio是一種生活在緩慢流水水域的上層魚(yú)類，其生活的水環(huán)境植物茂盛、地形復(fù)雜，生物棲息地具有很大范圍的光亮度和光譜波長(zhǎng)分布[1]。復(fù)雜水環(huán)境中的日間活動(dòng)方式，表明斑馬魚(yú)具有發(fā)達(dá)的視覺(jué)能力[2]。斑馬魚(yú)是脊椎動(dòng)物視覺(jué)系統(tǒng)研究中一種典型的模式生物，其視網(wǎng)膜具有與其他脊椎動(dòng)物相同的神經(jīng)元類別[3-5]。成年斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜中擁有視覺(jué)感知所必需的視感受器，即視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞。不同類型的視細(xì)胞含有不同的感光色素，從而表現(xiàn)出不同的光譜敏感性，如視桿細(xì)胞的敏感峰值為500 nm，U-視錐細(xì)胞、S-視錐細(xì)胞、M-視錐細(xì)胞和L-視錐細(xì)胞的敏感峰值分別為362、415、480、570 nm[6]。不同類型視細(xì)胞共同作用決定了斑馬魚(yú)的光譜敏感性[7-8]。

視網(wǎng)膜電圖(ERG)是一種微創(chuàng)性的視覺(jué)研究方案，記錄了視網(wǎng)膜組織在光誘導(dǎo)下胞外場(chǎng)電位的變化[9]，可以用于評(píng)估動(dòng)物的視覺(jué)感知[10]。Huges等[3]和Saszik等[8]曾利用視網(wǎng)膜電圖技術(shù)研究了明適應(yīng)條件下不同發(fā)育階段斑馬魚(yú)的光譜敏感性，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的明視光譜敏感性隨著年齡的增加而增加，且明適應(yīng)條件下斑馬魚(yú)光譜敏感性曲線有4個(gè)峰值(360、400、500、580 nm)，并且在460、540 nm波長(zhǎng)處發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)光譜敏感性出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。Huges等[3]和Saszik等[8]的研究結(jié)果與Robinson等[6]利用分光光度計(jì)測(cè)試視細(xì)胞的光譜敏感性結(jié)果一致。Bilotta等[11]曾利用視網(wǎng)膜電圖技術(shù)研究了暗適應(yīng)條件下不同發(fā)育階段斑馬魚(yú)的光譜敏感性，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的暗視光譜敏感性會(huì)隨著年齡變化而變化，且視桿細(xì)胞對(duì)暗視光譜敏感性的貢獻(xiàn)隨著年齡的增加而增加。暗適應(yīng)條件下斑馬魚(yú)的光譜敏感性主要由暗視視覺(jué)主導(dǎo)[12]，而暗視視覺(jué)受暗適應(yīng)狀態(tài)的影響。Bilotta等[11]在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)暗適應(yīng)時(shí)間設(shè)定為60 min，閃光刺激時(shí)間間隔設(shè)定為15 s，但未考慮斑馬魚(yú)暗適應(yīng)狀態(tài)和ERG試驗(yàn)中閃光刺激時(shí)間間隔對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。為此，本研究中首先探究了斑馬魚(yú)ERG試驗(yàn)中暗適應(yīng)時(shí)間和閃光刺激時(shí)間間隔對(duì)ERG記錄的影響，并探究了斑馬魚(yú)在暗適應(yīng)條件下對(duì)不同波長(zhǎng)刺激光的ERG響應(yīng)和光譜敏感性，旨在為斑馬魚(yú)ERG試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化方案的確定和斑馬魚(yú)視覺(jué)生態(tài)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自上海乙諾水族科技有限公司，為體長(zhǎng)3.5～4.0 cm的6月齡成年斑馬魚(yú)。

1.2 方法

1.2.1 暫養(yǎng)與管理 試驗(yàn)前，將試驗(yàn)魚(yú)在上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院魚(yú)類行為實(shí)驗(yàn)室的循環(huán)水槽中暫養(yǎng)兩周，暫養(yǎng)水槽尺寸為500 cm×80 cm×60 cm。暫養(yǎng)用水為曝氣后的自來(lái)水，水溫為(28±0.5)℃[13]，pH為7.0～7.5。每周更換一次循環(huán)水槽的過(guò)濾棉和30%水體。暫養(yǎng)期間,由4個(gè)100 W的全光譜LED燈(上海寸景水族有限公司)提供照明，光照周期為14 h光照(L)∶10 h黑暗(D)(光照時(shí)段為8:00—22:00)[14]，每天投喂一次人工配合飼料。

1.2.2 刺激光 采用13組10 W的集成LED燈珠作為刺激光源，波長(zhǎng)范圍包含紫外光和可見(jiàn)光，峰值波長(zhǎng)分別設(shè)定為340、365、380、400、420、440、460、480、500、520、550、585、620 nm，額定功率為10 W，LED光源參數(shù)詳見(jiàn)表1。刺激光經(jīng)液芯光纖傳導(dǎo)至試驗(yàn)魚(yú)眼睛處，光路中設(shè)置了電子快門(mén)和中性密度濾光片。電子快門(mén)由上位機(jī)控制，用于控制刺激時(shí)長(zhǎng)和刺激時(shí)間間隔。中性密度濾光片用于產(chǎn)生不同刺激強(qiáng)度的光，本試驗(yàn)共設(shè)置10組中性密度濾光片，光密度(OD)為0～4.5。試驗(yàn)前，分別利用紫外光功率計(jì)(U-20，杭州遠(yuǎn)方光電)和可見(jiàn)光功率計(jì)(TES132，泰仕)測(cè)試刺激光源在額定功率下魚(yú)眼處的輻照度。由于不同波長(zhǎng)的刺激光在相同輻照度條件下輻射的光子數(shù)不同，為了保證不同波長(zhǎng)刺激光刺激強(qiáng)度的統(tǒng)一，本文中將輻照度轉(zhuǎn)換為單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位面積的光子數(shù)(photons/(s·cm2))。試驗(yàn)時(shí)，改變光路中的中性密度濾光片以控制魚(yú)眼處輻照度大小，刺激光的輻照度由小到大，以0.5個(gè)lg單位遞增(表1)。

表1 集成LED光源參數(shù)Tab.1 Parameters of integrated LED light source

1.2.3 ERG記錄裝置 ERG記錄裝置主要包括記錄電極、參考電極、前置放大器、帶通濾波器、消噪器、數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)、法拉第籠、環(huán)形水槽、微操縱器和上位機(jī)等。記錄電極為直徑0.25 mm的鉑金絲電極，參考電極為直徑0.25 mm的醫(yī)用鋼針電極(西安富德醫(yī)療，中國(guó))。ERG記錄時(shí)，通過(guò)手動(dòng)微操縱器(KITE-R，WPI，美國(guó))調(diào)整和固定記錄電極與參考電極，使記錄電極緊密接觸魚(yú)眼，參考電極插入試驗(yàn)魚(yú)顱骨中央處。記錄電極頂端彎曲成“O”形，避免電極尖端緊密接觸魚(yú)眼時(shí)損傷試驗(yàn)魚(yú)視網(wǎng)膜。試驗(yàn)時(shí)在魚(yú)眼處滴入人工淚液以維持魚(yú)角膜濕潤(rùn)，且保證記錄電極與角膜接觸良好。試驗(yàn)前后均需將電極浸泡于體積分?jǐn)?shù)75%的醫(yī)用乙醇中進(jìn)行消毒和去除電極上黏附的雜質(zhì)。

電極記錄的ERG信號(hào)經(jīng)前置放大器(NL 104，CED，英國(guó))進(jìn)行差分放大后輸入帶通濾波器(NL 125，CED，英國(guó))進(jìn)行濾波。本試驗(yàn)中設(shè)置帶通濾波器的低頻截止頻率為0.5 Hz，高頻截止頻率為100 Hz。濾波后的ERG信號(hào)經(jīng)消噪器(Humbug，加拿大)濾除信號(hào)中50 Hz的工頻噪聲后，傳入生物電信號(hào)采集分析系統(tǒng)(Micro3-1401，CED，英國(guó))進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換和處理。最終ERG信號(hào)傳導(dǎo)至上位機(jī)進(jìn)行顯示和保存。上位機(jī)軟件采用Spike 2 V8.00(CED)，系統(tǒng)采樣頻率為300 Hz。

1.2.4 試驗(yàn)魚(yú)預(yù)處理 試驗(yàn)時(shí)，將完成暗適應(yīng)的試驗(yàn)魚(yú)浸泡于0.4 g/L MS-222溶液中進(jìn)行麻醉[2]。待試驗(yàn)魚(yú)鰓蓋停止張合后，迅速在其軀干背部注射0.02 mL濃度為50 mg/kg的戈拉碘銨(加拉碘銨)溶液[2]。將試驗(yàn)魚(yú)一側(cè)朝上固定于法拉第籠中圓形水槽內(nèi)的平臺(tái)上，并用富氧的0.1 g/L MS-222溶液進(jìn)行人工灌流，灌流液水溫為28 ℃[3]。麻醉和注射加拉碘銨溶液的目的是抑制試驗(yàn)魚(yú)的肌肉活動(dòng)，保障電極的穩(wěn)定接觸和避免肌肉活動(dòng)所產(chǎn)生電信號(hào)干擾。人工灌流的目的是保障試驗(yàn)期間試驗(yàn)魚(yú)的氧氣供應(yīng)和維持試驗(yàn)魚(yú)麻醉狀態(tài)。

1.2.5 ERG記錄試驗(yàn) 試驗(yàn)在上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院魚(yú)類電生理實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，為了避免晝夜節(jié)律對(duì)斑馬魚(yú)ERG記錄的影響，試驗(yàn)在9:00—17:00時(shí)段進(jìn)行。

1)不同暗適應(yīng)時(shí)間下的ERG記錄。隨機(jī)選取30尾生長(zhǎng)狀態(tài)一致且健康有活力的成年斑馬魚(yú)分別置于避光水箱中暗適應(yīng)10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min后，以給定刺激光(波長(zhǎng)為500 nm，強(qiáng)度為1.84×1013photons/(s·cm2)，刺激時(shí)長(zhǎng)為300 ms[8])，記錄30尾斑馬魚(yú)在不同暗適應(yīng)時(shí)間下的ERGs。

2)不同閃光刺激時(shí)間間隔下的ERG記錄。隨機(jī)選取30尾生長(zhǎng)狀態(tài)一致且健康有活力的成年斑馬魚(yú)，暗適應(yīng)100 min后，以給定刺激光(光條件同上)，刺激時(shí)長(zhǎng)為300 ms[8]，分別以10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 s的時(shí)間間隔連續(xù)刺激眼睛10次，記錄30尾斑馬魚(yú)在不同閃光刺激時(shí)間間隔下的ERGs。

3)不同波長(zhǎng)刺激光下的ERG記錄。隨機(jī)選取30尾生長(zhǎng)狀態(tài)一致且健康有活力的成年斑馬魚(yú)，暗適應(yīng)100 min后，記錄其在不同波長(zhǎng)(340～620 nm)和不同強(qiáng)度(OD值為0～4.5)光刺激下的ERGs。為了避免系統(tǒng)誤差，同一尾斑馬魚(yú)在相同刺激條件下刺激3次(刺激時(shí)間間隔60 s)，結(jié)果取3次刺激的ERG響應(yīng)平均值。試驗(yàn)時(shí)，不同刺激波長(zhǎng)的順序隨機(jī)確定，且在不同波長(zhǎng)組之間測(cè)試試驗(yàn)魚(yú)對(duì)波長(zhǎng)500 nm、輻照度1.84×1013photons/(s·cm2)刺激光的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)，以進(jìn)行數(shù)據(jù)校正。

1.2.6 不同暗適應(yīng)時(shí)間、刺激時(shí)間間隔對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜電圖的影響試驗(yàn) 以視網(wǎng)膜電圖的b波振幅作為斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜對(duì)刺激光的響應(yīng)，記錄不同刺激條件下的視網(wǎng)膜電圖響應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。

1)暗適應(yīng)時(shí)間對(duì)ERG的影響。30尾斑馬魚(yú)在10～120 min暗適應(yīng)時(shí)間下的ERG b波振幅進(jìn)行t檢驗(yàn)(P=0.05)，當(dāng)ERG b波振幅的組間無(wú)顯著性差異時(shí)(P>0.05)，則認(rèn)為暗適應(yīng)時(shí)間對(duì)斑馬魚(yú)ERG響應(yīng)不再產(chǎn)生影響。

2)閃光刺激時(shí)間間隔的影響。參考Kanmizutaru等[15]方法，刺激時(shí)間間隔對(duì)ERG響應(yīng)的影響率(α)計(jì)算公式為

α=(R1-R10)/R1×100%。

(1)

其中：α為影響率(%)；R1為第1次刺激的ERG響應(yīng)；R10為第10次刺激的ERG響應(yīng)。

對(duì)30尾斑馬魚(yú)在10～100 s閃光刺激時(shí)間間隔下的ERG響應(yīng)R1和R10進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，當(dāng)R1和R10無(wú)顯著性差異時(shí)(P>0.05)，認(rèn)為此時(shí)的刺激時(shí)間間隔對(duì)斑馬魚(yú)ERG響應(yīng)無(wú)影響。

1.2.7 斑馬魚(yú)光譜敏感性的計(jì)算 通過(guò)繪制斑馬魚(yú)的ERG響應(yīng)和刺激光輻照度二者對(duì)數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系，找出其線性響應(yīng)區(qū)間，并在線性范圍內(nèi)確定斑馬魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)振幅。參考Demarco等[16]方法，通過(guò)插值法計(jì)算出每個(gè)波長(zhǎng)刺激光下產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)的lg(輻照度)值，即為斑馬魚(yú)在不同波長(zhǎng)下的光譜敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚(yú)的ERG

圖1顯示了刺激光波長(zhǎng)為500 nm、lg(輻照度)分別為11.0、11.5和12.0時(shí)，斑馬魚(yú)暗視ERG波形。試驗(yàn)中刺激時(shí)長(zhǎng)設(shè)為300 ms[8]，圖中on和off代表光刺激的開(kāi)始和結(jié)束。從圖1可見(jiàn)，斑馬魚(yú)ERG響應(yīng)振幅隨著刺激光lg(輻照度)的增加而增加。從圖中還觀察到3種ERG波形成分，包括刺激瞬間出現(xiàn)的a波、隨之出現(xiàn)的振動(dòng)幅度較大且增勢(shì)迅猛的b波以及在刺激結(jié)束后才出現(xiàn)的d波。ERG b波振幅明顯，反映了斑馬魚(yú)雙極細(xì)胞的電活動(dòng)[17]，代表了其第一層具有顏色分辨能力的視網(wǎng)膜神經(jīng)元[18]。因此，本文中以ERG b波振幅作為斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜對(duì)刺激光的響應(yīng)，即ERG響應(yīng)。

圖1 不同強(qiáng)度光刺激下斑馬魚(yú)的視網(wǎng)膜電圖(ERGs)Fig.1 ERGs of zebrafish stimulated by different light intensities

2.2 不同暗適應(yīng)時(shí)間下的ERG響應(yīng)

圖2顯示了30尾成年斑馬魚(yú)暗適應(yīng)10～120 min時(shí)的ERG振幅。從圖2可見(jiàn)，ERG振幅隨著暗適應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，并在90 min后趨于穩(wěn)定。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，暗適應(yīng)時(shí)間大于90 min后ERG響應(yīng)組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明斑馬魚(yú)暗視ERG記錄時(shí)至少需要暗適應(yīng)90 min。

2.3 不同閃光刺激間隔時(shí)間下的ERG響應(yīng)

圖3顯示了暗適應(yīng)100 min的30尾成年斑馬魚(yú)在閃光刺激時(shí)間間隔為10～100 s時(shí)的ERG響應(yīng)R1和R10。從圖3可見(jiàn)，R10隨著刺激時(shí)間間隔的延長(zhǎng)而逐漸增加，并不斷趨于R1值。對(duì)30尾斑馬魚(yú)的R1和R10兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)閃光刺激間隔時(shí)間大于50 s時(shí)，30尾斑馬魚(yú)的R1和R10兩組數(shù)據(jù)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這表明，連續(xù)的閃光刺激時(shí)間間隔大于50 s不會(huì)改變斑馬魚(yú)的暗適應(yīng)狀態(tài)，從而不影響后續(xù)ERG響應(yīng)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖2 不同暗適應(yīng)時(shí)間下的ERG響應(yīng)Fig.2 ERG amplitudes at different dark adaptation time

圖3 不同光刺激時(shí)間間隔下的EGR響應(yīng)R1和R10Fig.3 EGR R1 and R10 under different light stimulus intervals

繪制30尾暗適應(yīng)100 min的成年斑馬魚(yú)在閃光刺激時(shí)間間隔為10～100 s時(shí)的EGR影響率α。從圖4可見(jiàn)：隨著刺激時(shí)間間隔的延長(zhǎng)EGR影響率呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，并最終趨于0；刺激時(shí)間間隔分別為10、20、30、40、50 s時(shí)，EGR影響率分別為43.63%、25.32%、10.7%、5.1%、0.98%，刺激時(shí)間間隔大于60 s時(shí)，影響率趨于0。這表明，連續(xù)的閃光刺激時(shí)間間隔大于60 s時(shí)影響率趨于0，結(jié)合R1和R10兩組數(shù)據(jù)的配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)ERG試驗(yàn)中刺激時(shí)間間隔大于50 s時(shí)連續(xù)閃光刺激并不影響后續(xù)ERG響應(yīng)。

圖4 不同光刺激時(shí)間間隔對(duì)EGR響應(yīng)的影響率Fig.4 ERG effect ratio of different time intervals of light stimulation

2.4 斑馬魚(yú)光譜敏感性

為了確定斑馬魚(yú)ERG標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)振幅，對(duì)不同刺激條件下的斑馬魚(yú)ERG響應(yīng)取對(duì)數(shù)，并繪制了ERG響應(yīng)與輻照度二者對(duì)數(shù)(lg)間的關(guān)系(圖5)，從圖中的離散數(shù)據(jù)可以判斷二者呈線性相關(guān)。利用最小二乘法對(duì)二者的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示，13組波長(zhǎng)下lg(ERG響應(yīng))與lg(輻照度)的數(shù)據(jù)和最佳擬合線性方程之間擬合程度高，決定系數(shù)R2均大于0.95，且其中12組波長(zhǎng)擬合方程的剩余標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.1，僅420 nm波長(zhǎng)組擬合方程的剩余標(biāo)準(zhǔn)差高于0.1，為0.113。紫外光波段(340、365、380 nm)線性擬合方程的斜率分別為0.56、0.52、0.59，可見(jiàn)光波段(400～620 nm)線性擬合方程的斜率為0.67～0.88。不同刺激波長(zhǎng)斜率之間的差異未發(fā)現(xiàn)一致的趨勢(shì)。

圖5 不同波長(zhǎng)下ERG響應(yīng)與輻照度的關(guān)系Fig.5 Function relationship between response and irradiance at different wavelengths

由圖5可以判斷，50 μV(其lg值約1.7)的ERG響應(yīng)處在線性響應(yīng)區(qū)間內(nèi)，且始終高于噪聲水平。因此，本文以50 μV的ERG響應(yīng)作為標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)，計(jì)算斑馬魚(yú)的光譜敏感性。對(duì)30尾斑馬魚(yú)在13組不同波長(zhǎng)下的lg(ERG響應(yīng))與lg(輻照度)數(shù)據(jù)進(jìn)行插值(R2>0.95)，計(jì)算產(chǎn)生50 μV標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)的lg(輻照度)，并根據(jù)該lg(輻照度)值繪制斑馬魚(yú)的絕對(duì)光譜敏感性函數(shù)(圖6)。從圖6可見(jiàn)：斑馬魚(yú)暗視光譜敏感性在可見(jiàn)光波段(400～700 nm)峰值出現(xiàn)在500 nm處，在365 nm處(紫外光波段)發(fā)現(xiàn)了斑馬魚(yú)第二敏感峰值，365 nm的紫外敏感峰值相較于500 nm可見(jiàn)光敏感峰值低了約0.28個(gè)lg單位；斑馬魚(yú)的暗視光譜敏感性在可見(jiàn)光波段與視紫紅質(zhì)的光譜吸收曲線擬合較好，而視紫紅質(zhì)是斑馬魚(yú)視桿細(xì)胞的感光色素，說(shuō)明可見(jiàn)光波段的光譜敏感性由斑馬魚(yú)視桿細(xì)胞主導(dǎo)。

圖6 斑馬魚(yú)的暗視光譜敏感性Fig.6 Scotopic spectral sensitivity of zebrafish

3 討論

3.1 斑馬魚(yú)暗視ERG的最佳試驗(yàn)參數(shù)

人類從明亮的環(huán)境進(jìn)入完全黑暗的環(huán)境，眼睛需要20～30 min完全暗適應(yīng)，而從黑暗環(huán)境進(jìn)入明亮的環(huán)境僅需5 min左右就能完全明適應(yīng)[19]。國(guó)際臨床視覺(jué)電生理學(xué)會(huì)(ISCEV)明確規(guī)定，進(jìn)行人體臨床明視ERG記錄至少需要明適應(yīng)10 min，進(jìn)行人體臨床暗視ERG記錄至少需要暗適應(yīng)20 min[20]。明適應(yīng)過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間較短，在一般動(dòng)物試驗(yàn)中容易滿足。而暗適應(yīng)過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)過(guò)長(zhǎng)的暗適應(yīng)時(shí)間將影響試驗(yàn)進(jìn)程，而較短的暗適應(yīng)時(shí)間則無(wú)法滿足試驗(yàn)需要，可能導(dǎo)致試驗(yàn)誤差。在動(dòng)物ERG試驗(yàn)中并沒(méi)有明確的明、暗適應(yīng)時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)，因此，明確斑馬魚(yú)ERG試驗(yàn)的明、暗適應(yīng)時(shí)間有助于增加試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，也有助于斑馬魚(yú)ERG標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)方案的確定。本研究表明，暗適應(yīng)時(shí)間對(duì)ERG影響顯著，ERG振幅隨著暗適應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，且暗適應(yīng)時(shí)間為10 min和90 min時(shí)的ERG振幅的差異高至260 μV(圖2)。ERG振幅在暗適應(yīng)時(shí)間達(dá)到90 min后趨于穩(wěn)定，表明暗適應(yīng)90 min后，斑馬魚(yú)進(jìn)入完全暗適應(yīng)狀態(tài)。ERG試驗(yàn)中需要對(duì)暗適應(yīng)的斑馬魚(yú)進(jìn)行連續(xù)的閃光刺激，而連續(xù)的閃光刺激可能會(huì)激活斑馬魚(yú)明視視覺(jué)系統(tǒng)，從而改變斑馬魚(yú)的暗適應(yīng)狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致ERG響應(yīng)發(fā)生變化，影響ERG評(píng)估的準(zhǔn)確性。因此，明確不影響后續(xù)ERG記錄的閃光刺激時(shí)間間隔對(duì)于增加ERG試驗(yàn)的準(zhǔn)確性也具有重要的意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)的閃光刺激時(shí)間間隔為50 s時(shí)影響率為0.98%，閃光刺激時(shí)間間隔大于60 s時(shí)影響率趨于0(圖4)，由此可見(jiàn)，斑馬魚(yú)暗視ERG試驗(yàn)中大于50 s的閃光刺激時(shí)間間隔是較好的選擇。在斑馬魚(yú)ERG試驗(yàn)中，除了暗適應(yīng)時(shí)間和閃光刺激時(shí)間間隔外，晝夜節(jié)律也可能對(duì)ERG記錄產(chǎn)生影響[21]。

3.2 暗適應(yīng)條件下斑馬魚(yú)的光譜敏感性

成年斑馬魚(yú)擁有發(fā)達(dá)的視覺(jué)系統(tǒng)[22-23]，其視覺(jué)系統(tǒng)可分為視桿視覺(jué)系統(tǒng)(暗視)和視錐視覺(jué)系統(tǒng)(明視)兩個(gè)子系統(tǒng)[12]。暗適應(yīng)條件下，視桿視覺(jué)系統(tǒng)是主導(dǎo)斑馬魚(yú)視覺(jué)的系統(tǒng)[12]。視桿細(xì)胞中含有視紫質(zhì)和視紫紅質(zhì)兩種感光色素，視紫質(zhì)的光譜吸收峰值波長(zhǎng)為523 nm，視紫紅質(zhì)的光譜吸收峰值波長(zhǎng)為500 nm[24]。本研究表明，暗適應(yīng)條件下斑馬魚(yú)對(duì)可見(jiàn)光的光譜敏感性峰值與視紫紅質(zhì)光譜吸收峰值波長(zhǎng)一致，且斑馬魚(yú)在可見(jiàn)光波段的光譜敏感性曲線與視紫紅質(zhì)的光譜吸收曲線基本吻合，說(shuō)明暗適應(yīng)條件下斑馬魚(yú)的光譜敏感性主要由視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)決定。而溫度和光線會(huì)影響魚(yú)類視桿細(xì)胞中視紫質(zhì)和視紫紅質(zhì)的比率[25]，可能會(huì)導(dǎo)致不同環(huán)境下的斑馬魚(yú)光譜敏感性存在差異。此外，不同發(fā)育階段對(duì)斑馬魚(yú)的光譜敏感性也有影響，如斑馬魚(yú)幼魚(yú)在14 dpf(受精時(shí)長(zhǎng))時(shí)的光譜敏感性峰值為540 nm，而發(fā)育到24 dpf時(shí)光譜敏感性峰值向短波遷移，為500 nm[11]。本研究結(jié)果顯示，暗適應(yīng)的斑馬魚(yú)成魚(yú)對(duì)可見(jiàn)光的光譜敏感性峰值也為500 nm，說(shuō)明斑馬魚(yú)視桿細(xì)胞在24 dpf時(shí)可能已經(jīng)基本發(fā)育完全。Douglas等[26-27]認(rèn)為，生活在水深大于200 m的深水魚(yú)類對(duì)470～490 nm波長(zhǎng)的光最敏感，而生活在200 m以內(nèi)淺水的中上層魚(yú)類對(duì)490～520 nm的波長(zhǎng)最敏感。魚(yú)類視覺(jué)系統(tǒng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中具有適應(yīng)性特征，斑馬魚(yú)光譜敏感性可能是其在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)了其生活的中上層水層光環(huán)境的結(jié)果。

3.3 暗適應(yīng)條件下斑馬魚(yú)的紫外敏感性

本研究表明，暗適應(yīng)狀態(tài)的斑馬魚(yú)不僅對(duì)可見(jiàn)光敏感，也表現(xiàn)出對(duì)紫外光敏感，在斑馬魚(yú)的暗視光譜敏感性的紫外光波段發(fā)現(xiàn)了一個(gè)敏感峰值(約365 nm處)(圖6)，且該峰值的波長(zhǎng)比視紫紅質(zhì)峰值吸收光譜(500 nm)或視紫質(zhì)峰值吸收光譜(523 nm)低得多，說(shuō)明斑馬魚(yú)的紫外敏感性并非由視桿細(xì)胞介導(dǎo)。而U-視錐細(xì)胞視色素的光譜吸收峰值波長(zhǎng)為362 nm[6]，紫外波段的光譜敏感峰值(365 nm)與U-視錐細(xì)胞的峰值吸收光譜(362 nm)相匹配[6]，表明暗適應(yīng)條件下的斑馬魚(yú)紫外光譜敏感性由U-視錐細(xì)胞介導(dǎo)。這一結(jié)果表明，暗適應(yīng)條件下，斑馬魚(yú)的U-視錐細(xì)胞參與了暗視視覺(jué)，因此，可以判斷斑馬魚(yú)的短波視覺(jué)類型屬于Losey等[28]提出的紫外特化型短波視覺(jué)。U-視錐細(xì)胞是斑馬魚(yú)視覺(jué)系統(tǒng)中非常重要的組成成分，占總視細(xì)胞數(shù)的25%，且U-視錐細(xì)胞是最先發(fā)育的視細(xì)胞[6,29]。斑馬魚(yú)明視視覺(jué)中U-視錐細(xì)胞的參與有著重要的生態(tài)原因，斑馬魚(yú)生活的淺水水域紫外線含量豐富?；赨-視錐細(xì)胞的紫外視覺(jué)可以增強(qiáng)對(duì)獵物的探測(cè)能力，有利于斑馬魚(yú)生存[30]。而斑馬魚(yú)暗視視覺(jué)中U-視錐細(xì)胞的參與并不意味著斑馬魚(yú)在暗適應(yīng)條件下具有色覺(jué)，而是有助于斑馬魚(yú)的暗視光譜敏感性功能。暗適應(yīng)的斑馬魚(yú)通過(guò)視桿細(xì)胞和U-視錐細(xì)胞共同作用，擴(kuò)大了其暗視視覺(jué)光譜敏感范圍。此外，視錐細(xì)胞相對(duì)視桿細(xì)胞而言對(duì)光更為敏感，暗視視覺(jué)中U-視錐細(xì)胞的參與也有助于增加斑馬魚(yú)暗視視覺(jué)的靈敏度[28]。

4 結(jié)論

1)斑馬魚(yú)暗適應(yīng)90 min以上，其暗視ERG響應(yīng)趨于穩(wěn)定。

2)連續(xù)的閃光刺激時(shí)間間隔大于50 s時(shí)不影響后續(xù)暗視ERG響應(yīng)的記錄。

3)本試驗(yàn)條件下，暗適應(yīng)的斑馬魚(yú)對(duì)可見(jiàn)光(400～700 nm)的光譜敏感性峰值為500 nm，對(duì)UV的光譜敏感性峰值為365 nm。其視網(wǎng)膜中的視桿細(xì)胞和U-視錐細(xì)胞共同參與了暗視視覺(jué)，增加了暗視光譜敏感范圍，提高了暗視視覺(jué)的靈敏度。