王啟要

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋動(dòng)物疫苗工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動(dòng)物疫病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量連續(xù)30年穩(wěn)定增長(zhǎng)，占據(jù)世界總產(chǎn)量的近 70%，近年來漁業(yè)產(chǎn)值已超過1.35萬億元[1]，對(duì)世界糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)。隨著中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、規(guī)?；?、集約化高速發(fā)展，病害已成為產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重大挑戰(zhàn)[2]。在過去，人們常用抗生素解決養(yǎng)殖病害問題，不但引發(fā)了嚴(yán)重的多耐藥病原產(chǎn)生，同時(shí)也造成嚴(yán)重的環(huán)境危害、健康風(fēng)險(xiǎn)和食品安全問題等。世界海水養(yǎng)殖發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)在大西洋鮭等養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的成功實(shí)踐證明，在同各種水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的斗爭(zhēng)中，基于魚類免疫系統(tǒng)并以接種疫苗為核心的預(yù)防性疫病防控措施是最為突出的貢獻(xiàn)[3]。

疫苗是指用各類病原微生物及其成分制作的用于預(yù)防接種的一類生物制品。魚類疫苗是基于魚類免疫系統(tǒng)開發(fā)的用于預(yù)防魚類感染性病害發(fā)生的特殊類型疫苗。雖然魚類的特異性免疫機(jī)制還很不完善，但國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，魚類接種疫苗能使魚體產(chǎn)生免疫保護(hù)力。因此，開展魚類疫苗工程研究意義重大。本文綜述了目前國(guó)內(nèi)外魚類疫苗開發(fā)中包括滅活疫苗、減毒/弱毒活疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗在內(nèi)的主要技術(shù)策略及相應(yīng)的接種、遞送方式，著重介紹了已經(jīng)獲得中國(guó)新獸藥證書的9個(gè)魚類疫苗及其應(yīng)用，以及中國(guó)魚類疫苗審批管理的情況，并提出了未來中國(guó)在魚類疫苗工程領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害免疫防控體系的構(gòu)建及產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展提供科學(xué)參考。

1 魚類疫苗研究與開發(fā)概況

1942年，Duff[4]最早研制了殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida滅活疫苗，發(fā)現(xiàn)其對(duì)鮭鱒魚類有較好的免疫作用，由此打開了漁用疫苗開發(fā)理論和應(yīng)用的大門[5-6]。1976年，美國(guó)研制的鮭科魚類腸炎紅嘴病(ERM)疫苗獲得許可，這是第一種用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的商業(yè)化疫苗[7-9]。20世紀(jì)70年代中期，歐洲和美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)的鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)廣泛接種疫苗，用于防治鰻弧菌Vibrioanguillarum、魯氏耶爾森氏菌Yersiniaruckeri和殺鮭氣單胞菌等病原菌造成的病害[6-7]，取得顯著效果的同時(shí)，抗生素用量極大下降甚至基本停用。此后，各國(guó)加大了對(duì)漁用疫苗的開發(fā)并進(jìn)入快速發(fā)展時(shí)期。雖然漁用疫苗適用于魚類、爬行類和兩棲類等水產(chǎn)養(yǎng)殖脊椎動(dòng)物，但目前主要針對(duì)魚類開展。截至2020年，國(guó)外主要由19個(gè)跨國(guó)公司在全球40多個(gè)國(guó)家銷售26種商業(yè)化魚類疫苗，超過 20多種工業(yè)化養(yǎng)殖魚類有了各自的商業(yè)化疫苗，用于免疫防治 20 多種細(xì)菌性病害和6 種病毒性病害[6-7]。目前，挪威、美國(guó)、加拿大、荷蘭、日本和韓國(guó)等的漁用疫苗產(chǎn)業(yè)化程度較高，市場(chǎng)較成熟。值得關(guān)注的是，國(guó)際上魚群疫苗自動(dòng)注射機(jī)的推廣應(yīng)用，日本、韓國(guó)漁用疫苗國(guó)家補(bǔ)貼政策的大力實(shí)施,以及希臘漁用“自家苗”舉措的廣泛推行等，進(jìn)一步加快了漁用疫苗在全球養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用。

中國(guó)漁用疫苗的研究起步較晚。1960—1970年代，為預(yù)防草魚Ctenopharyngodonidella出血病，珠江水產(chǎn)研究所與華中農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位首先研制出魚組織勻漿滅活疫苗(又稱“土法”疫苗)[10]，從而揭開了中國(guó)漁用疫苗開發(fā)的序幕。草魚出血病病毒會(huì)引起淡水養(yǎng)殖主要品種草魚發(fā)生出血病，死亡率高達(dá)90%以上，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[11-13]。20世紀(jì)80年代，由浙江省淡水水產(chǎn)研究所與中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所等單位聯(lián)合攻關(guān)，成功建立了草魚出血病病毒(GCHV)人工敏感細(xì)胞系[14]，在此基礎(chǔ)上楊先樂等[15]于1984年研制出細(xì)胞培養(yǎng)草魚出血病滅活疫苗，并于1992年獲得國(guó)家一類新獸藥證書，標(biāo)志著中國(guó)漁用疫苗研發(fā)與應(yīng)用進(jìn)入實(shí)質(zhì)性的產(chǎn)業(yè)化階段。這種疫苗與其他8種獲得新獸藥證書的疫苗為中國(guó)水產(chǎn)病害免疫防治體系的構(gòu)建打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。2019年初，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等十部委聯(lián)合印發(fā)了《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見》綱領(lǐng)性文件，強(qiáng)調(diào)在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控中，應(yīng)該以防為主、防治結(jié)合，推廣接種疫苗等預(yù)防技術(shù)，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展。獲得中國(guó)新獸藥證書的9個(gè)魚類疫苗見表1。

表1 中國(guó)已取得注冊(cè)證書的8個(gè)魚類疫苗(截至2021年底)Tab.1 Eight licensed fish vaccines in China (by the end of 2021)

2 魚類疫苗研發(fā)的技術(shù)策略

魚類疫苗主要可以分為滅活疫苗、減毒/弱毒活疫苗、亞單位/合成肽疫苗和DNA疫苗等。目前，中國(guó)科研人員正在對(duì)不同類型的魚類疫苗進(jìn)行廣泛的基礎(chǔ)研究并取得了較好的突破。

2.1 魚類疫苗的主要類型

1)滅活疫苗。滅活疫苗是指將病原體擴(kuò)大培養(yǎng)后，通過物理和化學(xué)過程使得病原微生物失去了在宿主體內(nèi)感染或體外復(fù)制的能力，而不損害微生物制劑免疫原性的一類疫苗。滅活方法主要利用福爾馬林、甲醛、二乙烯亞胺及丙酰內(nèi)酯等化學(xué)物質(zhì)對(duì)病原進(jìn)行滅活[16]。當(dāng)然，不同的滅活方法會(huì)影響滅活疫苗的免疫原性。與活疫苗相比，滅活疫苗具有安全性高、開發(fā)周期短、工藝簡(jiǎn)單、易于制備多聯(lián)多價(jià)疫苗等優(yōu)點(diǎn)。滅活疫苗由于不能在體內(nèi)繁殖，所引起的免疫反應(yīng)較弱且免疫持續(xù)期較短，尤其是不能較好地激活細(xì)胞免疫。因此，要獲得更好的免疫保護(hù)效果，滅活疫苗需要更大的接種劑量，并需要各類佐劑來加強(qiáng)免疫效果。

早期大多數(shù)漁用疫苗試驗(yàn)都集中在滅活疫苗上。第一次報(bào)道的漁用疫苗是Duff[4]制備的殺鮭氣單胞菌滅活疫苗。中國(guó)科研人員早期采用草魚出血病魚組織勻漿法制備滅活疫苗，后來又研制了具有較高保護(hù)力、質(zhì)量穩(wěn)定的草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗[10,13,15]。目前獲批的鱖傳染性脾腎壞死病滅活疫苗、鰤虹彩病毒滅活疫苗和嗜水氣單胞菌敗血癥滅活疫苗等均采用滅活疫苗的形式。值得注意的是，中國(guó)目前已經(jīng)獲得臨床批件并正在進(jìn)行新獸藥注冊(cè)的幾種魚類疫苗，如石斑魚蛙虹彩病毒病滅活疫苗(HN株)(批件號(hào):2021006)、大菱鲆哈維氏弧菌滅活疫苗(MAVH402株)(2021028)、草魚嗜水氣單胞菌敗血癥-銅綠假單胞菌赤皮病二聯(lián)蜂膠滅活疫苗(GA201株+JP802株)(2018008)、大菱鲆鰻弧菌病滅活疫苗(EIBVA1株)(20180026)和石斑魚哈維氏弧菌病滅活疫苗(VHD株)(20180047)、大菱鲆鰻弧菌滅活疫苗(VAM003株)(2020026)和鯽維氏氣單胞菌敗血癥蜂膠滅活疫苗(AVCA07株)(2022007)等也是基于滅活疫苗的形式。

2)減毒/弱毒活疫苗。減毒/弱毒活疫苗與野生病毒、病原菌相比，其毒力顯著減弱，但還保留一定的細(xì)胞和宿主侵襲性，能夠感染宿主并在宿主體內(nèi)有限繁殖。相較于滅活疫苗，該類疫苗雖然存在一定的毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，但是活疫苗保留了更好的免疫原性，且能夠在宿主體內(nèi)一定限度內(nèi)繁殖，所以減毒活疫苗能有效激起細(xì)胞免疫且免疫持續(xù)期較長(zhǎng)，呈現(xiàn)較為優(yōu)良的相對(duì)免疫保護(hù)率。早期的減毒活疫苗是通過不斷傳代篩選到減毒株，但這種方法耗時(shí)較長(zhǎng)，毒力返強(qiáng)可能性較大。目前，對(duì)于各類病原都可以通過基因工程技術(shù)，刪除毒株的毒力和代謝相關(guān)基因，從而構(gòu)建出安全高效的減毒活疫苗株。理性設(shè)計(jì)這類疫苗需要一定的前期基礎(chǔ)研究，必須明確病原致病的相關(guān)機(jī)制。華東理工大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)研制的大菱鲆遲鈍愛德華氏菌活疫苗和大菱鲆鰻弧菌基因工程活疫苗，就是通過大量天然菌株篩選及基因工程技術(shù)獲得的減毒/弱毒海水魚類活疫苗。此外，由于該種疫苗能保留較好的宿主侵襲性并能在宿主體內(nèi)有限繁殖，故減毒/弱毒活疫苗也是優(yōu)良的載體疫苗出發(fā)菌株[17]。

3)亞單位/合成肽疫苗。亞單位/合成肽疫苗是僅僅保留了抗原性成分而制作的疫苗，主要是蛋白質(zhì)類、多肽類和多糖類物質(zhì)。由于去除了與免疫保護(hù)無關(guān)的成分，故亞單位/合成肽疫苗副作用較小，避免了病毒回復(fù)突變等危害，取得了較理性的免疫保護(hù)效果。亞單位疫苗開發(fā)過程中，前期需要大量的基礎(chǔ)研究以確定病原的保護(hù)性抗原。亞單位/合成肽疫苗可以通過合成肽技術(shù)生產(chǎn)，也可以利用DNA重組技術(shù)在大腸桿菌和桿狀病毒等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，再通過分離純化來實(shí)現(xiàn)。相對(duì)來說，亞單位疫苗工藝較復(fù)雜且成本較高，而合成肽疫苗工藝較為簡(jiǎn)單且易于生產(chǎn)。眾多的實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，亞單位/合成肽疫苗能為各種細(xì)菌和病毒性感染提供良好的免疫保護(hù)作用。也有研究表明，通過亞單位/合成肽技術(shù)獲得的多肽能引起相同的免疫反應(yīng)[3]。目前，鱸魚彈狀病毒基因工程亞單位滅活疫苗(E.coli-G2株)已獲得臨床試驗(yàn)許可(2021008)。中國(guó)尚未見合成肽漁用疫苗的報(bào)道。

4)DNA疫苗。DNA疫苗由攜帶編碼病原體抗原基因的重組表達(dá)質(zhì)粒組成，將質(zhì)粒接種進(jìn)入魚體后，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗原，并刺激魚體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，獲得免疫保護(hù)效果。實(shí)際上，早在20世紀(jì)90年代人們就已開始進(jìn)行魚類DNA疫苗的研究。如Kanellos等[18]發(fā)現(xiàn)，真核表達(dá)載體質(zhì)粒可以在金魚體內(nèi)誘導(dǎo)長(zhǎng)期外源蛋白表達(dá)，同時(shí)可以誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫。由于病毒的抗原成分較為簡(jiǎn)單，所以漁用DNA疫苗研究主要針對(duì)魚類病毒病。水產(chǎn)領(lǐng)域中最早研究的DNA疫苗是抗傳染性造血組織壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)的DNA 疫苗[19]。病毒性出血性敗血癥病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的表面糖蛋白(蛋白G)包含幾個(gè)中和表位。將編碼糖蛋白的質(zhì)粒DNA對(duì)成年虹鱒Oncorhynchusmykiss進(jìn)行肌內(nèi)注射后，質(zhì)粒 DNA可以持續(xù)存在45 d，在肌肉組織提取物中可檢測(cè)到蛋白G的mRNA，在注射部位的肌肉細(xì)胞內(nèi)還可檢測(cè)到表達(dá)的蛋白G，表明接種DNA疫苗可誘導(dǎo)虹鱒產(chǎn)生高水平的特異性抗VHSV的中和抗體[20]。值得關(guān)注的是，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所與珠江水產(chǎn)研究所合作開發(fā)的虹鱒IHNV核酸疫苗也取得了較好免疫效果，并于2021年獲批進(jìn)入農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)生產(chǎn)性試驗(yàn)階段。

2.2 魚類疫苗遞送途徑

1)注射途徑。魚類疫苗接種主要有注射、浸泡和口服3種途徑(表2)。大多數(shù)魚類疫苗是通過腹腔或肌肉注射來實(shí)現(xiàn)的，在中國(guó)獲得批文的9個(gè)魚類疫苗都可以通過注射途徑完成接種。傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗通常都通過腹腔注射來接種，而DNA疫苗等核酸疫苗一般會(huì)采用肌肉注射來接種。注射途徑有很多優(yōu)勢(shì)：接種劑量相對(duì)精確且劑量用量??；疫苗在體內(nèi)存在持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)；疫苗在腹腔或肌肉中能較好產(chǎn)生系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，免疫效果好。但注射途徑也存在不足：注射會(huì)給魚帶來應(yīng)激反應(yīng)；注射勞動(dòng)強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，雖然目前有機(jī)械注射裝置可以輔助自動(dòng)注射，但推廣程度還不高；注射方法僅適用于體型較大的魚，并不適用于稚魚的疫苗接種[21]。

表2 魚類疫苗3種接種途徑的比較Tab.2 Three administration routes for fish vaccines

2)浸泡途徑。對(duì)于稚魚，一般采用浸泡接種途徑進(jìn)行疫苗接種，即將魚浸泡在疫苗懸液中完成接種過程。疫苗可以通過皮膚和鰓等途徑進(jìn)入待免疫的魚體，從而激發(fā)包括黏膜免疫在內(nèi)的各種免疫應(yīng)答[21]。浸泡接種操作方便簡(jiǎn)單，適合大面積接種疫苗且對(duì)魚產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)較小。但是浸泡接種也存在劣勢(shì)，疫苗用量大，只適用于集中魚群，皮膚屏障也影響疫苗進(jìn)入魚體的效率。因此，與注射途徑相比，浸泡途徑產(chǎn)生的免疫效果較差且每尾魚的接種量也可能會(huì)存在差異。獲批的草魚出血病滅活疫苗和減毒活疫苗、魚類嗜水氣單胞菌敗血癥滅活疫苗、大菱鲆遲鈍愛德華氏菌活疫苗和鰻弧菌基因工程活疫苗也可以采用浸泡的接種方式。值得一提的是，西北農(nóng)林科技大學(xué)聯(lián)合深圳萬可森生物科技有限公司申報(bào)的鱸魚彈狀病毒基因工程亞單位滅活疫苗(E.coli-G2株)，就是采用碳納米管材料促進(jìn)抗原靶向遞送從而開發(fā)出的水產(chǎn)浸泡型疫苗。

3)口服途徑?？诜渤Ｓ糜隰~類疫苗的接種。腸道黏膜中含有豐富的抗菌肽、補(bǔ)體因子、IgT/M/D免疫球蛋白、cxcd1/scya109等細(xì)胞因子和各種抗原遞呈細(xì)胞及B-/T-細(xì)胞等，因此，腸道是魚類發(fā)揮黏膜免疫反應(yīng)的重要場(chǎng)所[21]。滅活疫苗、減毒活疫苗等經(jīng)過包封技術(shù)處理后，與飼料混合，通過魚的主動(dòng)攝食，使得疫苗進(jìn)入魚體?？诜緩降膬?yōu)勢(shì)是：操作簡(jiǎn)單，不需要大量的勞動(dòng)力；魚不會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)；待接種的魚不受大小限制且適用于分散魚群。口服途徑也有不足：與注射途徑相比，口服途徑由于只能激發(fā)腸道局部黏膜免疫，難以激發(fā)系統(tǒng)性的適應(yīng)性免疫，容易產(chǎn)生免疫耐受等，故免疫效果較差且有效期較短；口服途徑疫苗用量大，每尾魚的疫苗接種量難以精確；有些魚可能因未攝食飼料導(dǎo)致未接種疫苗等[22]。目前尚沒有口服劑型漁用疫苗獲得行政批準(zhǔn)。

3 中國(guó)漁用疫苗審批管理概況

根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《獸藥管理?xiàng)l例》和《獸藥注冊(cè)管理辦法》等法規(guī)，漁用疫苗在中國(guó)屬于獸藥范疇。因此，漁用疫苗及免疫調(diào)節(jié)劑、免疫增強(qiáng)劑等相關(guān)產(chǎn)品的獲批及上市應(yīng)用，須參照中國(guó)對(duì)新獸藥研發(fā)及生產(chǎn)的管理。疫苗要獲批上市，需要按照《獸藥注冊(cè)評(píng)審工作程序》進(jìn)行新獸藥評(píng)審和安全效力復(fù)核后，獲取新獸藥注冊(cè)證書(進(jìn)口獸藥注冊(cè)證書)及生產(chǎn)許可證。漁用疫苗等獸藥生產(chǎn)企業(yè)需要省級(jí)獸醫(yī)行政管理部門審核，獲批GMP證書和生產(chǎn)許可證后，才能進(jìn)行獸藥生產(chǎn)。

根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或農(nóng)產(chǎn)品加工相關(guān)的動(dòng)物、植物、微生物及其產(chǎn)品經(jīng)基因工程技術(shù)而導(dǎo)致基因組構(gòu)成改變的被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，其中包括了含有轉(zhuǎn)基因微生物或者其產(chǎn)品成分的獸藥等產(chǎn)品。因此,基因工程疫苗等新獸藥 (滅活疫苗和弱毒活疫苗除外)還需要進(jìn)行生物安全評(píng)價(jià)。獲得農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書才能進(jìn)入新獸藥注冊(cè)申報(bào)。華東理工大學(xué)牽頭研制的大菱鲆鰻弧菌基因工程活疫苗 (MVAV6203)就屬于基因工程新獸藥，獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書。

另外，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2464號(hào)等文件規(guī)定，自2018年1月1日起，新獸藥注冊(cè)申請(qǐng)?jiān)谂R床試驗(yàn)方面要嚴(yán)格按照獸藥GLP/GCP管理制度等有關(guān)規(guī)定開展相關(guān)工作。其中要求臨床試驗(yàn)單位通過GCP的注冊(cè)，這對(duì)漁用疫苗的臨床試驗(yàn)和注冊(cè)申請(qǐng)?zhí)岢隽烁叩囊蟆?/p>

4 中國(guó)魚類疫苗研發(fā)主要進(jìn)展

中國(guó)目前有9個(gè)魚類疫苗產(chǎn)品獲得了國(guó)家獸藥注冊(cè)證書，其中5個(gè)獲得了由政府頒發(fā)的獸藥生產(chǎn)文號(hào)。

4.1 草魚出血病滅活疫苗和活疫苗

草魚是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚類，也是中國(guó)“四大家魚”之一，草魚味道鮮美，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，廣受人們喜愛。2020年中國(guó)草魚養(yǎng)殖產(chǎn)量超過550萬t[1]。根據(jù)2020年中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動(dòng)物疫病專項(xiàng)監(jiān)測(cè)計(jì)劃報(bào)道，在監(jiān)測(cè)的9種水生動(dòng)物重點(diǎn)疫病中，陽性樣品檢出率最高的是草魚出血病[2]。草魚出血病是一種病毒性疾病，其病原是草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)。該病毒是一種雙鏈RNA病毒，其對(duì)酸堿的耐受能力較強(qiáng)，可以通過水體或寄生蟲傳播給健康的草魚和青魚等易感魚類。一般6—10月份是草魚出血病流行發(fā)病期，20～30 ℃水溫及養(yǎng)殖密度過高時(shí)易發(fā)草魚出血病。草魚出血病的臨床癥狀主要有：肌肉充血、出血，呈現(xiàn)深紅色；腸壁充血，呈現(xiàn)出紅腸；紅鰭紅鰓蓋等[11-12]。

早期經(jīng)過中國(guó)多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)的集體攻關(guān)，成功研制出草魚出血病滅活疫苗[13-15]。草魚出血病滅活疫苗對(duì)草魚出血病具有較好的免疫保護(hù)作用，接種該疫苗后魚體相對(duì)存活率可達(dá)到(77.1±10.8)%[15]。草魚出血病滅活疫苗于1992年獲得了新藥證書((93)新獸藥證字14號(hào))，成為中國(guó)第一個(gè)正式注冊(cè)獲批的魚類疫苗(表1)。此外，在1994年，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所許淑英等[23]還研制出草魚出血病活疫苗(GCHV-892)，接種后魚的相對(duì)存活率達(dá)到了80%，于2010獲得國(guó)家一類新獸藥證書((2010)新獸藥證字51號(hào))。該疫苗分別于2011年和2014年依托中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所和大華農(nóng)公司獲得了獸藥生產(chǎn)文號(hào)((2011)190986021)和((2014)190026031)。這也是世界上第一個(gè)獲批并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的針對(duì)草魚出血病的活疫苗。

4.2 嗜水氣單胞菌敗血癥滅活疫苗

2020年中國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量達(dá)2 580萬t[1]。然而，淡水魚養(yǎng)殖過程中卻飽受細(xì)菌敗血癥的危害，其主要病原是嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila。嗜水氣單胞菌敗血癥對(duì)鯽、鳙等淡水養(yǎng)殖魚類造成了嚴(yán)重危害[24]。嗜水氣單胞菌是一種重要的革蘭氏陰性條件致病菌。嗜水氣單胞菌的致病性由溶血素、細(xì)胞興奮性腸毒素和胞外酶等多種毒力因子共同組成[25]。1991年，陳懷青等[26]從患病的鯉科魚類中分離得到嗜水氣單胞菌J-1株。針對(duì)嗜水氣單胞菌J-1株，浙江省淡水水產(chǎn)研究所與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)合作開發(fā)了福爾馬林滅活全菌疫苗，并轉(zhuǎn)讓給中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得生產(chǎn)批文。給鯽注射接種該疫苗后，其相對(duì)存活率達(dá)到75%～85%[27]。2001年該疫苗獲得國(guó)家一類新獸藥證書((2001)新獸藥證字06號(hào))，成為中國(guó)第一個(gè)水產(chǎn)類細(xì)菌性疫苗。同時(shí)，該種疫苗還可以有效預(yù)防鰱、鯽、鳙等其他魚類嗜水氣單胞菌敗血癥的暴發(fā)和流行。該疫苗于2011年獲得國(guó)內(nèi)第一個(gè)漁用疫苗生產(chǎn)文號(hào)((2011)190986013)，標(biāo)志著中國(guó)漁用細(xì)菌疫苗走向了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段。

4.3 大菱鲆遲鈍愛德華氏菌活疫苗和鰻弧菌基因工程活疫苗

大菱鲆Scophthalmusmaximus俗稱多寶魚，于20世紀(jì)90年代由雷霽霖等[28]從歐洲引進(jìn)中國(guó)，其主產(chǎn)區(qū)在遼寧、天津、河北、山東和江蘇等省份。大菱鲆自從歐洲引進(jìn)以來，因經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高而被廣泛養(yǎng)殖，成為中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要品種。據(jù)中國(guó)海水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系年度報(bào)告，2019年中國(guó)大菱鲆產(chǎn)量總計(jì)6.2萬t，其中遼寧省占比達(dá)到了67.13%[29]。然而高度集約化的生產(chǎn)方式導(dǎo)致大菱鲆產(chǎn)業(yè)疾病發(fā)生的頻率較高，其中由愛德華氏菌屬細(xì)菌導(dǎo)致的腹水癥等病害和鰻弧菌等導(dǎo)致的弧菌病較為普遍，引起大菱鲆大量死亡[30]。在鲆鰈魚類中致病的愛德華氏菌屬細(xì)菌主要包括遲緩愛德華氏菌Edwardsiellatarda(也被稱為遲鈍愛德華氏菌和殺魚愛德華氏菌)[25]。由于個(gè)別養(yǎng)殖戶使用抗生素藥物等來防治病害，2006、2015年相繼受“藥殘超標(biāo)”事件的影響，中國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)受到較為嚴(yán)重的打擊。因此，高效疫苗的開發(fā)和應(yīng)用對(duì)大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)具有重大意義。

中國(guó)學(xué)者在國(guó)家“863”計(jì)劃、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃及國(guó)家海水魚產(chǎn)業(yè)體系等科研項(xiàng)目的持續(xù)資助下，進(jìn)行了鲆鰈類漁用疫苗的長(zhǎng)期攻關(guān)工作，并取得了較為重要的突破[31]。華東理工大學(xué)張?jiān)d教授團(tuán)隊(duì)利用基因工程技術(shù)研制了WED減毒活疫苗株，該疫苗去除了多耐藥大質(zhì)粒pEIB202和缺失了aroC和T3SS相關(guān)基因eseBCD等。野生型菌株比WED菌株的毒性高5 700倍，說明WED菌株具有顯著的減毒效果。同時(shí)，WED菌株對(duì)大菱鲆具有良好的免疫保護(hù)效果，其注射接種和浸泡接種4個(gè)月內(nèi)相對(duì)免疫保護(hù)率分別為(76.7±3.3)%和(70±0)%[32]。在此基礎(chǔ)上，該疫苗于2013年獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書。更為重要的是，基于天然缺失重要毒力因子T3SS和T6SS的菌株EIBAV1，該團(tuán)隊(duì)聯(lián)合廣東永順生物制藥有限公司等成功開發(fā)了相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)到70%以上的天然弱毒活疫苗(EIBAV1株)[33]。該疫苗于2015年和2016年分別獲得國(guó)家一類新獸藥證書((2015)新獸藥證字30號(hào))和獸藥生產(chǎn)文號(hào)((2016)110576037)，成為中國(guó)第一種用于海水養(yǎng)殖動(dòng)物的活菌疫苗產(chǎn)品。目前，該商品疫苗已在山東、遼寧、河北、天津等多個(gè)省份得到規(guī)?；茝V應(yīng)用。

在針對(duì)鰻弧菌的疫苗開發(fā)方面，該團(tuán)隊(duì)以野生型鰻弧菌 MVM425 為基礎(chǔ)，通過去除毒力相關(guān)質(zhì)粒 pEIB1和缺失了基因組中的aroC基因，構(gòu)建了基因工程減毒活疫苗菌株 MVAV6203[34]，魚類通過腹腔注射和浸泡接種后相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)到80%。通過長(zhǎng)達(dá)10余年的實(shí)驗(yàn)室研究、中間試驗(yàn)研究、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性評(píng)價(jià)等一系列轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)研究，證實(shí)該疫苗株保留了鰻弧菌野生出發(fā)株原有的免疫原性和侵染能力，并具有良好的生物安全性。該疫苗于2011年獲得了中國(guó)農(nóng)業(yè)生物轉(zhuǎn)基因安全證書，2019年獲批國(guó)家一類新獸藥證書((2019)新獸藥證字15號(hào))，是中國(guó)首個(gè)漁用基因工程減毒活疫苗。

4.4 牙鲆溶藻弧菌、鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌病多聯(lián)抗獨(dú)特型抗體疫苗

牙鲆Paralichthysolivaceus是名貴的海產(chǎn)魚類，其肉嫩、味美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都較高，目前主要在中國(guó)北方進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖，成為中國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的擴(kuò)大，牙鲆的病害發(fā)生情況也日益突出，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中由溶藻弧菌、鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌等引起的混合、交叉和多重感染性細(xì)菌病尤為嚴(yán)重[35-37]。開發(fā)多價(jià)多聯(lián)疫苗來應(yīng)對(duì)多種病原菌混合感染具有非常重要的意義。2006年，由北京卓越海洋生物科技有限公司和中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)共同申報(bào)的牙鲆溶藻弧菌、鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌病多聯(lián)抗獨(dú)特型抗體疫苗獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的國(guó)家一類新獸藥證書((2006)新獸藥證字66號(hào))。這是中國(guó)首個(gè)海水養(yǎng)殖魚類多聯(lián)抗獨(dú)特型抗體疫苗，該疫苗于2017年通過西安斯凱達(dá)生物制品有限公司獲得獸藥生產(chǎn)文號(hào)(獸藥生字270446033)，并進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段。

4.5 鱖傳染性脾腎壞死病毒滅活疫苗

魚類虹彩病毒是一類線狀雙股DNA、由二十面立體對(duì)稱的衣殼包被并含囊膜的病毒，是目前發(fā)現(xiàn)的危害魚類健康的重要病毒性病原。該科病毒地域分布廣泛，可感染近百種淡水、海水魚類，能導(dǎo)致感染魚大面積死亡。鱖是一種肉食性淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚種，2020年中國(guó)鱖產(chǎn)量為37.6萬t，較2019年增長(zhǎng)11.84%[1]。在長(zhǎng)期高密度養(yǎng)殖情況下，病害多發(fā)，導(dǎo)致鱖暴發(fā)性死亡，其中歸類為細(xì)胞腫大病毒屬的傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)導(dǎo)致的疾病尤為嚴(yán)重[38]。該病害主要是感染脾臟和腎臟，也感染其他組織和器官。該病毒在發(fā)病的時(shí)候基本會(huì)導(dǎo)致90%以上的魚死亡，而且發(fā)病時(shí)間非常短，大概在7～10 d之內(nèi)就會(huì)導(dǎo)致池塘70%～90%的魚死亡。ISKNV也是淡水魚和海水魚病毒性疾病的重要病原，安全高效的疫苗對(duì)相關(guān)病害防控至關(guān)重要。中山大學(xué)何建國(guó)團(tuán)隊(duì)通過十余年的技術(shù)攻關(guān)，聯(lián)合廣東永順生物制藥有限公司、廣東漁躍生物技術(shù)有限公司等成功研制出鱖傳染性脾腎壞死病滅活疫苗(NH0618株)，相對(duì)免疫保護(hù)率可達(dá)到90%以上[39]。該疫苗于2019年獲批國(guó)家一類新獸藥注冊(cè)證書((2019)新獸藥證字75號(hào))。

4.6 鰤虹彩病毒病滅活疫苗和格式乳球菌病滅活疫苗

虹彩病毒也經(jīng)常感染海水養(yǎng)殖魚類。鰤Seriolaquinqueradiata又稱五條鰤，隸屬于鲹科鰤亞科鰤屬，是一種溫水性深海魚類。鰤生長(zhǎng)速度快，肉質(zhì)鮮美，在日本已有數(shù)十年的養(yǎng)殖歷史，已成為日本海水網(wǎng)箱養(yǎng)魚產(chǎn)量居第一位的重要養(yǎng)殖對(duì)象，目前在中國(guó)南方開始試養(yǎng)。日本財(cái)團(tuán)法人阪大微生物病研究會(huì)將其研制的真鯛/鰤/擬鲹虹彩病毒病滅活疫苗(Ehime-1/GF14株)于2014年在中國(guó)成功獲批進(jìn)口注冊(cè)((2014)外獸藥證字48號(hào))，用于真鯛、鰤、擬鲹養(yǎng)殖過程中虹彩病毒病的防治。這是中國(guó)第二個(gè)進(jìn)口注冊(cè)的魚類疫苗。日本生命科學(xué)株式會(huì)社于2008年在中國(guó)進(jìn)口注冊(cè)鰤?mèng)~格式乳球菌病滅活疫苗(BYI株)((2008)外獸藥證字16號(hào)),用于預(yù)防鰤養(yǎng)殖過程中由格式乳球菌病造成的病害。

5 魚類疫苗研發(fā)面臨的主要問題和未來重點(diǎn)研究方向

與歐美養(yǎng)殖發(fā)達(dá)國(guó)家大西洋鮭等養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)相比，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中疫苗的普及率無論從覆蓋的品種還是單品種的推廣程度并不高。其主要問題在于目前獲得生產(chǎn)批文的疫苗品種不多、不全，不能完全覆蓋主要養(yǎng)殖品種的主要病害，還不足以支撐形成完備的病害免疫綜合防控體系。高效疫苗品種供給不足和開發(fā)進(jìn)程漫長(zhǎng)也削弱了養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中病害免疫防控的總體效果，并降低了養(yǎng)殖戶對(duì)疫苗產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的信心，對(duì)疫苗的推廣普及和漁用疫苗產(chǎn)業(yè)投入造成一定的負(fù)面影響。因此，針對(duì)中國(guó)漁用疫苗開發(fā)的現(xiàn)狀，需要加大對(duì)魚類疫苗工程學(xué)領(lǐng)域的研究，主要解決以下幾個(gè)方面的技術(shù)挑戰(zhàn)，加快推進(jìn)高效、多聯(lián)魚類疫苗開發(fā)。

5.1 加強(qiáng)魚類病原與病害相關(guān)基礎(chǔ)研究

中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖地域遼闊，養(yǎng)殖品種繁雜，病害也復(fù)雜多變。魚類是變溫動(dòng)物，復(fù)雜的養(yǎng)殖環(huán)境造成了病害暴發(fā)時(shí)多呈現(xiàn)條件致病、多病原感染的特征。基因組測(cè)序技術(shù)的顯著進(jìn)步，大大促進(jìn)了魚類病原的分子分型和系統(tǒng)鑒定，但是需要對(duì)病原的血清學(xué)和流行規(guī)律進(jìn)行持續(xù)系統(tǒng)研究，這也是高效疫苗開發(fā)的前提。草魚出血病減毒活疫苗(GCHV-892株)目前在推廣中發(fā)現(xiàn)其保護(hù)效力變差，可能是因?yàn)榱餍胁≡l(fā)生了顯著變異[13]。與國(guó)外相比，中國(guó)對(duì)于魚類流行病原的血清分型工作基礎(chǔ)非常薄弱，無法有力支撐高效疫苗的研究工作。另外，還需要加強(qiáng)對(duì)病原條件致病和病害暴發(fā)的機(jī)制研究。在病害暴發(fā)的病原、環(huán)境和宿主“三元”系統(tǒng)中，溫度、溶氧、鹽度、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子可能是魚類病害暴發(fā)的誘因，深入理解病原菌對(duì)相關(guān)因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，可為疫苗的開發(fā)和病害的免疫綜合控制奠定扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。

5.2 利用多組學(xué)技術(shù)推進(jìn)高效魚類疫苗的分子設(shè)計(jì)

需要整合最新的各種組學(xué)(基因組、功能基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組)技術(shù)進(jìn)行反向疫苗學(xué)的研究，促進(jìn)高效疫苗的分子設(shè)計(jì)。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因組編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，反向遺傳學(xué)和反向疫苗學(xué)已經(jīng)成為人類多種感染性疾病疫苗開發(fā)的有力工具，包括系統(tǒng)篩選高效的抗原分子、減毒活疫苗靶點(diǎn)等[7,19]。參考國(guó)際上細(xì)菌減毒活疫苗開發(fā)的成功經(jīng)驗(yàn)，轉(zhuǎn)座子插入測(cè)序(Tn-seq)[40]和CRISPRi-seq[41]等功能基因組學(xué)方法的發(fā)展，以及在病原感染動(dòng)態(tài)過程中的應(yīng)用，也可以促進(jìn)高效疫苗基因靶點(diǎn)的系統(tǒng)篩選，尤其是有助于篩選減毒活疫苗的減毒靶點(diǎn)和安全性靶點(diǎn)。值得注意的是，AlphaFold2等生物信息學(xué)工具的革命性突破，能高效準(zhǔn)確進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將極大地促進(jìn)高效疫苗的分子設(shè)計(jì)，推進(jìn)抗原表位的發(fā)現(xiàn)和亞單位/載體疫苗的開發(fā)等。

DNA疫苗、腺病毒載體疫苗和mRNA疫苗等核酸疫苗開發(fā)技術(shù)已成為預(yù)防病毒感染性疾病的熱點(diǎn)技術(shù)領(lǐng)域。未來需要采用合成生物學(xué)手段突破漁用核酸疫苗的設(shè)計(jì)和遞送等關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。同時(shí)探索核酸疫苗在魚類變溫動(dòng)物免疫保護(hù)中的作用機(jī)制和應(yīng)用潛力，系統(tǒng)研究不同接種/遞送途徑如何發(fā)揮系統(tǒng)性免疫和局部黏膜免疫的協(xié)同保護(hù)作用等。更為重要的是，采用系統(tǒng)免疫學(xué)技術(shù)利用單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)等從單細(xì)胞水平進(jìn)行疫苗效力的評(píng)價(jià)，有助于高效疫苗的開發(fā)。

5.3 構(gòu)建魚類疫苗工程研究技術(shù)平臺(tái)

魚類疫苗的開發(fā)過程顯然不是病原分離—滅活—注射的簡(jiǎn)單技術(shù)操作。魚類疫苗開發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，需要進(jìn)一步深入研究魚類的免疫系統(tǒng)，尤其是魚類接種后產(chǎn)生免疫反應(yīng)、免疫記憶、免疫耐受，以及天然免疫、適應(yīng)性免疫和訓(xùn)練免疫的穩(wěn)態(tài)平衡和轉(zhuǎn)換機(jī)制等。同時(shí)要加強(qiáng)疫苗接種規(guī)程、病害預(yù)警、動(dòng)物模型、疫苗佐劑、免疫增強(qiáng)/調(diào)節(jié)劑、治療性疫苗、GMP制造與注冊(cè)規(guī)程、疫苗自動(dòng)化接種設(shè)備和漁用疫苗經(jīng)濟(jì)學(xué)等方面的系統(tǒng)研究，形成具有中國(guó)特色的漁用疫苗工程技術(shù)平臺(tái)和技術(shù)聯(lián)盟，推進(jìn)中國(guó)魚類多聯(lián)疫苗的高效開發(fā)和應(yīng)用。尤其是針對(duì)重點(diǎn)魚類養(yǎng)殖品種和主要病害，做到采用疫苗接種進(jìn)行病害防控全覆蓋。

總之，在新冠疫情影響下，“全健康”(one health)理念已深入人心。中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也正在推行“生物安?！崩砟詈痛胧?。目前，中國(guó)已經(jīng)建立了滅活疫苗、減毒活疫苗等成熟的漁用疫苗技術(shù)開發(fā)路線并成功開發(fā)漁用疫苗產(chǎn)品。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建以疫苗接種為核心的水產(chǎn)病害免疫綜合防控體系，將極大地促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康綠色高質(zhì)量發(fā)展。