時扣榮，顧偉鷹，劉 娟，羅 蘭，翟巧利，范 偉

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化的必經病理學過程，主要是由于肝星狀細胞(HSCs)的過度增殖和活化造成細胞外基質(ECM)過度沉積[1]。研究證據[2,3]表明，肝纖維化過程是可以逆轉的，抑制HSCs增殖或誘導其凋亡是阻止肝纖維化發(fā)展的潛在的治療策略。多條信號通路參與了肝纖維化的發(fā)生過程，其中最經典的為轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路，后者可促使HSCs轉化為肌成纖維細胞，合成ECM，導致肝纖維化，而HSCs又可釋放大量的TGF-β1，促進ECM的合成，加速推動肝纖維化進展[4]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliforator-activated receptor-γ，PPAR-γ)是TGF-β信號通路中的重要細胞因子。研究[5]指出，PPAR-γ可抑制TGF-β1信號通路，從而抑制ECM的合成，延緩肝纖維化的發(fā)生。血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)是PPAR-γ的目的基因，其轉錄受PPAR-γ的調控[6]。羅格列酮(rosiglitazone，RGZ)屬于PPAR-γ激動劑，可抑制HSCs的增殖和遷移，有效抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]，但羅格列酮的作用機制尚不清楚。本研究分析了羅格列酮干預對HSC-T6細胞增殖及細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平的影響，旨在為深入闡明羅格列酮抑制肝纖維化發(fā)生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 大鼠HSC-T6細胞購自上海鈺博生物科技有限公司，本實驗室自行保存、傳代培養(yǎng)，備用。羅格列酮購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司(取RGZ 0.5 mg，溶于二甲基亞砜溶液100μL，配制成5 mg/mL的儲存液，保存于-80℃?zhèn)溆?。使用時，用10%胎牛血清稀釋成15μmol/L工作液)；DMEM培養(yǎng)基、10%優(yōu)質胎牛血清購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自廣州杰特偉生物公司；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒購自中國天根生物有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京碧云天生物技術研究所；兔抗鼠α-肌動蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)、抗Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，COLⅠ)、抗Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ，COLⅢ)和抗TGF-β1單克隆抗體購自英國Abcam公司；抗β-actin單克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；離心機購自上海天本公司；實時熒光定量PCR擴增儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 取適量的HSC-T6細胞，接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基(含有10%優(yōu)質胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱，48 h換液一次。72 h傳代一次。當細胞生長狀態(tài)良好時，進行后續(xù)相關實驗。將細胞分為對照組、RGZ處理組和RGZ聯(lián)合HO-1抑制劑ZnPP-IX處理組。在對照組，不予任何處理，在實驗組，分別給予15μmol/L RGZ干預或RGZ聯(lián)合10μmol/L ZnPP-IX干預。

1.3 HSC-T6細胞增殖檢測 采用MTT法，取對數(shù)生長期的HSC-T6細胞，用0.25%胰蛋白酶1 mL消化，制備成細胞懸液，調整細胞數(shù)為1×104個/mL。取100 μL細胞懸液，接種于96孔板，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當細胞貼壁生長至融合度為 50%后，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，按以上要求分別加入RGZ或/和ZnPP-IX干預，每組設置8個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。每孔加入二甲基亞砜溶液150 μL，震蕩混勻10 min，于酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度(absorbance，A)值，計算細胞生長抑制率，即細胞生長抑制率=[對照組A值-實驗組A值]/對照組A值×100%

1.4 細胞凋亡檢測 使用流式細胞儀檢測，細胞處理同上，培養(yǎng)72 h后收集細胞上清，采用不含EDTA的胰蛋白酶消化，1000 r/m離心5 min，各組分別取1 ml加入2 mL離心管中，離心、混勻，并取PI 5μL和AnnexinV-FITC 10μL，充分混勻，置于室溫下避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測，并應用Cell Quest軟件計算各組細胞凋亡率。

1.5 細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平檢測 采用RT-PCR法檢測，細胞分組和處理同上。采用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用分光光度計在260 nm和280 nm處測定RNA純度和濃度。使用cDNA反轉錄試劑盒合成cDNA，再根據SYBR Green PCR Master Mix說明書進行RT-PCR檢測，引物見表1，以β-actin為內參，采用2-△△Ct法計算細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平。

1.6 細胞纖維化因子蛋白表達檢測 采用Western Blot法，細胞處理同上，收集細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，再電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加5%脫脂奶粉封閉1.5 h，用TBST清洗3次。分別加入一抗(工作濃度 均為1：1000)，4℃孵育過夜，用TBST清洗，加入辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG(工作濃度為 1：5000)，室溫孵育1 h，用TBST再次清洗。以β-actin為內參蛋白，采用ECL化學發(fā)光試劑盒顯影，在BIO-RAD 成像儀拍照，應用Image J 18.0軟件分析目的條帶灰度值，即目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

表1 RT-PCR引物序列

2 結果

2.1各組HSC-T6細胞增殖率比較 本研究對照組A值為(1.0±0.1)，RGZ干預組為(0.6±0.1)，較對照組細胞增殖活性降低了38.4%(P<0.05)，而RGZ聯(lián)合ZnPP-IX處理組為(0.8±0.1)，較對照組降低了17.2%(P<0.05)，較RGZ組顯著升高(P<0.05)，提示RGZ干預可顯著抑制HSC-T6細胞增殖，而加入ZnPP-IX干預卻能夠顯著削弱這種抑制作用。

2.2 各組HSC-T6細胞凋亡率比較 RGZ干預組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，RGZ聯(lián)合ZnPP-IX組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，但顯著低于RGZ組(P<0.05，圖1)。

2.3 各組HSC-T6細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平比較 RGZ處理細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)，而RGZ聯(lián)合ZnPP-IX處理細胞 HO-1 mRNA水平顯著低于RGZ組(P<0.05，表2)。

圖1 各組HSC-T6細胞凋亡率比較A～C：流式細胞儀檢測HSC-T6細胞凋亡；D：RGZ組細胞凋亡率顯著高于對照組(①P<0.05)，RGZ聯(lián)合ZnPP-IX組細胞凋亡率顯著高于對照組(①P<0.05)，但顯著低于RGZ組(②P<0.05)

表2 各組HSC-T6細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平比較

2.4 各組HSC-T6細胞纖維化因子相關蛋白表達比較 RGZ處理細胞α-SMA、COLⅠ、COLⅢ和TGF-β1蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)，而RGZ聯(lián)合ZnPP-IX處理細胞 α-SMA、COLⅠ、COLⅢ和TGF-β1蛋白表達顯著高于RGZ組(P<0.05，圖2)。

圖2 各組HSC-T6細胞相關蛋白表達比較 A：對照組；B：RGZ處理組；C：RGZ聯(lián)合ZnPP-IX處理組

3 討論

PPARγ是一種配體激活的轉錄因子，可調節(jié)正常細胞和癌細胞的生長和分化[8-12]。PPARγ在肝臟內主要表達于星狀細胞(HSCs)，但在活化的HSCs和肌成纖維細胞中缺乏表達[13]。研究[14]指出，PPARγ信號通路的激活能夠抑制HSCs的活化，延緩肝纖維化進展，PPARγ有可能作為治療肝纖維化的一種新的藥物作用的靶點。RGZ為胰島素增敏劑，亦為PPARγ的有效激動劑，近年來其抗纖維化作用越來越受到關注。RGZ能夠與PPARγ發(fā)生特異性結合，進而抑制TGF-β信號通路，減少炎性細胞因子的分泌、釋放，最終發(fā)揮抗纖維化作用[15]。為進一步探討RGZ的抗纖維化作用，本研究采用RGZ干預HSC-T6細胞，結果表明RGZ可顯著抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡。同時，RGZ干預還可顯著降低纖維化因子α-SMA、COLⅠ、COLⅢ和TGF-β1蛋白表達，這些結果均提示RGZ具有抑制細胞增殖、誘導凋亡和抗纖維化的作用。

HO-1是一種限速酶，可催化血紅素轉化為膽綠素、一氧化碳和游離鐵，具有很強的抗氧化、抗炎和調節(jié)細胞凋亡的作用[16]。HO-1又被稱為熱休克蛋白32，是一種HO同工酶，其在正常肝臟中表達于枯否細胞，處于應激狀態(tài)時肝臟實質細胞和非實質細胞HO-1均呈現(xiàn)高表達[17]。報道[18,19]表明，HO-1在肝臟缺血再灌注損傷、急性肝臟損傷、脂肪性和酒精性肝病等疾病中均可發(fā)揮一定的肝細胞保護作用，是一種有應用前景的肝臟疾病治療靶點。因此，在各種慢性肝病患者，誘導HO-1產生可能對于預防肝纖維化的發(fā)生具有重要的意義。HO-1與PPARγ之間存在協(xié)同調節(jié)作用。一項血管內皮細胞HO-1與PPARγ相互作用的研究[20]表明，HO-1酶活性可介導PPARγ配體的抗炎和抗增殖作用，且HO-1啟動子區(qū)基因多態(tài)性顯著影響了PPARα和PPARγ的轉錄活性。既往研究[21]也顯示，HO-1可能通過增加肝組織PPARγ的表達來預防肝纖維化。本研究結果表明，經RGZ干預的HSC-T6細胞PPARγ和HO-1 mRNA水平均顯著升高，而在加入HO-1抑制劑ZnPP-IX干預后，HSC-T6細胞HO-1 mRNA水平顯著降低，同時HSC-T6細胞增殖和纖維化相關因子的表達亦受到顯著抑制，細胞凋亡顯著增加。文獻報道[22]也表明，RGZ可通過調控PPARγ和HO-1表達，抑制HSCs增殖，減少膠原蛋白分泌和釋放。RGZ作為PPARγ的特異性和高效激動劑，可顯著上調PPARγ mRNA水平，同時上調HO-1 mRNA水平，而ZnPP-IX是一種選擇性的HO抑制劑，可通過阻斷一氧化氮的產生和限制血紅素向膽綠素轉化而抑制HO活性，抑制HO-1 mRNA水平，PPARγ mRNA水平亦有一定幅度的降低，表明PPARγ和HO-1存在雙向調控作用。以上結果提示RGZ干預上調PPARγ表達可能是通過調控HO-1表達來發(fā)揮抗炎、抗氧化應激和誘導細胞凋亡的作用，進而抑制HSC-T6細胞增殖和纖維化的形成。