馬 琳，楊 明，王宣懿，葉紹輝

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

羊肉在世界各地廣泛食用，但由于其膻味，在許多亞洲國(guó)家并不受歡迎。4-甲基辛酸（4-Methyl octanoic acid，MOA）、4-乙基辛酸（4-Ethyl octanoic acid，EOA）和4-甲基壬酸（4-Methyl Nonanoic acid，MNA）［1-3］這3 種化合物是引起羊肉膻味的主要物質(zhì)，此外還有3-甲基吲哚（3-Methyl indole，MI）和4-甲基苯酚（4-Methyl phenol，MP）［4，5］。龍陵黃山羊（Longling yellow goat，LLG）是產(chǎn)于云南省保山市龍陵縣及周邊的地方品種，其具有體大、屠宰率高、耐粗飼等良種特性［6］。但膻味卻一直制約著龍陵黃山羊的發(fā)展。羊的肝臟具有代謝功能，膻味物質(zhì)的形成需要肝臟參與代謝，進(jìn)而沉積到脂肪組織中，產(chǎn)生特有的羊膻味。目前龍陵黃山羊的研究主要集中在肉品質(zhì)、養(yǎng)殖方式、繁殖性能和疾病的研究，鮮見(jiàn)其膻味研究的相關(guān)報(bào)道。

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP），是指單個(gè)核苷酸的變異而導(dǎo)致的基因多態(tài)性，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。每個(gè)SNP 位點(diǎn)都可以是4 種不同的變異形式（轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失），其中轉(zhuǎn)換和顛換二者之比為2∶1，可能是因?yàn)镃pG 二核苷酸中5-甲基胞嘧啶（5mC）脫氨基對(duì)胸腺嘧啶的高自發(fā)率而導(dǎo)致［7］。SNP 在CG 序列上出現(xiàn)最為頻繁，是因?yàn)镃G 中的C 常被甲基化而轉(zhuǎn)換成T。SNP 位點(diǎn)極其豐富，幾乎遍及整個(gè)基因組。雖然隨著時(shí)空的改變轉(zhuǎn)錄基因種類可能會(huì)有些許變化，但轉(zhuǎn)錄組運(yùn)用于檢測(cè)轉(zhuǎn)錄區(qū)域多態(tài)性仍是1 種高效且經(jīng)濟(jì)的方法［8］。該研究旨在通過(guò)對(duì)龍陵黃山羊肝臟轉(zhuǎn)錄組SNP 進(jìn)行分析，探索龍陵黃山羊膻味相關(guān)差異基因，為龍陵黃山羊膻味的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇飼養(yǎng)健康的龍陵黃山羊、云嶺山羊（Yunling goat，YLG）和大理綿羊（Dali sheep，DLS）共14只；龍陵黃山羊取自云南省保山市龍陵縣，云嶺山羊和大理綿羊取自云南省大理市賓川縣。

1.2 樣品采集

對(duì)試驗(yàn)山羊采用頸動(dòng)脈放血處死，快速取其100～150 g 腰部皮下脂肪組織和肝臟組織，分別置于保鮮袋和無(wú)酶凍存管中，液氮條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，分別放入-20、-80 ℃冰箱保存待用。所采集的皮下脂肪組織用于測(cè)定致膻物質(zhì)（MOA、EOA、MNA、MI 和MP）的含量。所采集的肝臟組織用于轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序，按提取要求取適量樣本，采用Trizol 法提取RNA，對(duì)提取的總RNA 按一定比例進(jìn)行稀釋。利用NanoPhotometer?分光光度計(jì)檢測(cè)樣品純度（IMPLEN 公司），Qubit?3.0Flurometer（Life Technologies公司）檢測(cè)RNA 樣品濃度，安捷倫2100 RNA Nano 6000 AssayKit（Agilent Tech-nologies 公司）檢測(cè)RNA樣品的完整度和濃度。

1.3 膻味值計(jì)算

通過(guò)氣相色譜法測(cè)定致膻物質(zhì)（MOA、MEA、EOA、MI、MP）5 個(gè)指標(biāo)的含量，然后將致膻物質(zhì)的含量除以其膻味閾值得到膻味值，再將其膻味值進(jìn)行加和得到總膻味值。其中膻味閾值是指人們能夠感知該化合物氣味的最小濃度［9］，在pH=2 的介質(zhì)中MOA 的膻味閾值是0.02 μg/g，MNA 的膻味閾值是0.65 μg/g，EOA 的膻味閾值是0.006 μg/g［9，10］，MI的膻味閾值是0.303 μg/g，MP 的膻味閾值是0.7 μg/g［11，12］。對(duì)3 個(gè)羊品種的膻味值進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)。

1.4 高通量測(cè)序

根據(jù)膻味含量測(cè)定以及膻味值計(jì)算比較后，對(duì)挑選出的龍陵黃山羊（6 只）的肝組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?？俁NA 樣本檢測(cè)合格后，選用帶有Oligo（dT）的磁珠進(jìn)行富集純化mRNA，向純化得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer 使其片段成為短片段，以片段后的mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA 第1 鏈，并 加 入 緩 沖 液、dNTPs、RNaseH 和DNA Polymerase Ⅰ合 成cDNA 第2 鏈，經(jīng) 過(guò)QIAQuick PCR 試劑盒純化并加EB 緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA 再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。質(zhì)量合格的文庫(kù)用Illumina 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由北京擎科科技有限公司昆明分公司完成。完成測(cè)序和質(zhì)控的數(shù)據(jù)被用來(lái)與山羊參考基因組ARS1做比對(duì)，之后進(jìn)行SNP 檢測(cè)以及GO、KEGG 富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選轉(zhuǎn)錄組樣本

以14 個(gè)樣本總膻味值的平均數(shù)（771.845）來(lái)分類，高于771.845 膻味值的樣本為高膻味水平組，低于771.845 膻味值的樣本為低膻味水平組，14 個(gè)樣本的膻味水平分組如表1 所示。

表1 所有樣本膻味水平分組

對(duì)高膻味水平組和低膻味水平組進(jìn)行差異檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表2），云嶺山羊和大理綿羊種內(nèi)高低膻味水平組無(wú)顯著差異（P＞0.05），而龍陵黃山羊種內(nèi)2 個(gè)水平組差異極顯著（P＜0.01），龍陵黃山羊種內(nèi)高膻味水平和低膻味水平符合轉(zhuǎn)錄組樣本的要求。

表2 高膻味水平與低膻味水平樣本的差異檢驗(yàn)

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

對(duì)高膻味水平（LLG-H）和低膻味水平（LLG-L）的龍陵黃山羊肝臟組織共6 個(gè)RNA 樣品進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如表3 所示，經(jīng)過(guò)測(cè)序質(zhì)量控制，共得到40.41 Gb 過(guò)濾后的數(shù)據(jù)，測(cè)序樣本的總過(guò)濾序列數(shù)約為4 490 萬(wàn)，高質(zhì)量序列數(shù)約為4 132 萬(wàn)，高質(zhì)量序列比率約為92.01%，各樣品Q30比率均大于89.00%。這表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

表3 龍陵黃山羊肝臟組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

2.3 SNP 檢測(cè)

2.3.1 SNP 統(tǒng)計(jì) 利用samtools 軟件將經(jīng)過(guò)排序、去PCR 重復(fù)后的比對(duì)文件同參考序列進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)樣品的SNP 檢測(cè)結(jié)果（表4）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中LLG-H 特有的SNP（SNPLLG-H）有411 973個(gè)，LLG-L 特有的SNP（SNPLLG-L）有444 638 個(gè)，LLG-H 和LLG-L 共 有SNP（SNPLLG）856 611 個(gè)。根據(jù)變異的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，對(duì)高膻味水平（LLG-H）和低膻味水平（LLG-L）龍陵黃山羊的SNP 突變類型的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖1），結(jié)果顯示6 種單核苷酸變異中，C/T 和A/G 發(fā)生的頻率最高。

圖1 SNP 突變類型

表4 肝臟轉(zhuǎn)錄組SNP 檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 SNP 所在基因的注釋 利用Omicshare 統(tǒng)計(jì)SNPLLG-H、SNPLLG-L 和SNPLLG 3 組的SNP 所在基因的GO 富集情況，結(jié)果見(jiàn)圖2，發(fā)現(xiàn)SNPLLG-H、SNPLLG-L 和SNPLLG 的SNP 所在的基因參與生物進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組成3 個(gè)部分富集比例基本一致。但是SNPLLG-H 的SNP 所在基因在每個(gè)功能的富集比例均大于SNPLLG-L 所在基因。

圖2 SNP 所在基因的GO 分析

利用Kobas 對(duì)所有SNP 所在基因進(jìn)行KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)總共有4 073 個(gè)基因注釋到339 個(gè)通路上。SNP 所在基因顯著富集在磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、胰島素抵抗、拼接體、自噬-動(dòng)物、輔因子的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、胞吞作用、AMPK 信號(hào)等通路（圖3）。

圖3 SNP 所在基因的KEGG 分析

2.4 脂肪酸生物合成通路中SNP 功能的生物信息學(xué)分析

脂肪酸生物合成是膻味的關(guān)鍵來(lái)源，動(dòng)物脂肪細(xì)胞中脂肪的合成直接影響脂肪酸的含量，羊肉膻味相關(guān)的脂肪酸正是在各種酶的參與調(diào)控下發(fā)揮作用。乙酸是脂肪酸合成的主要前體物質(zhì)，在反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵下可以產(chǎn)生乙酸。在脂肪細(xì)胞內(nèi)，乙酸在酶的作用下合成乙酰輔酶A，然后在乙酰輔酶A羧化酶的催化下形成丙二酸單酰輔酶A，隨后由還原型煙酰氨腺嘌呤二核苷酸磷酸生成酶提供還原氫，脂肪酸合成酶（FASN）催化合成長(zhǎng)鏈脂肪酸，之后細(xì)胞利用脂蛋白脂酶水解產(chǎn)生的脂肪酸和細(xì)胞從頭合成的脂肪酸酯化形成甘油三酯，而激素敏感酯酶則催化甘油三酯水解為甘油和游離脂肪酸（短鏈脂肪酸）［13］。膻味就是由于其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸而產(chǎn)生的。

根據(jù)KEGG 富集結(jié)果，發(fā)現(xiàn)共有19 個(gè)含SNP 的基因富集到脂肪酸生物合成通路，從其中隨機(jī)挑選6 個(gè)有SNP 的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，6 個(gè)基因中共有7 個(gè)SNP 位于同義編碼（SYNONYMOUS_CODING）區(qū)域，利用Editseq將含有SNP 的SYNONYMOUS_CODING 區(qū)域序列翻譯為氨基酸，與原氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNP 引起了氨基酸的改變，F(xiàn)ASN、ACACA基因?yàn)槌聊蛔?，ACSL3基因?yàn)槌聊蛔儭o(wú)義突變和錯(cuò)義突變，其中ACSL3基因上的SNP 在高膻味水平和低膻味水平的龍陵黃山羊都有表現(xiàn)，ACSL6基因上的SNP 是低膻味水平龍陵黃山羊特有，但是其氨基酸沒(méi)有改變，F(xiàn)ASN、ACACA基因上的SNP 為高膻味水平龍陵黃山羊所特有。

表5 脂肪酸生物合成通路SNP 功能的生物信息學(xué)分析

3 小結(jié)與討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序廣泛應(yīng)用于定量基因表達(dá)和非注釋轉(zhuǎn)錄本的鑒定，作為生物學(xué)信息的來(lái)源，可用于鑒定導(dǎo)致復(fù)雜性狀變異的原因［14］。除此之外，也有研究表明利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行SNP 的篩選是可行的［15］。使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)大大降低了試驗(yàn)成本，并且獲得的數(shù)據(jù)反映了基因表達(dá)，這是最基本的分子表型。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序還能夠在特定基因座處提供較高的深度，能夠發(fā)現(xiàn)高表達(dá)基因中的偶發(fā)等位基因［16，17］。

該研究發(fā)現(xiàn)，6 種單核苷酸變異中，以C/T 和A/G 發(fā)生頻率最高，這與轉(zhuǎn)換突變發(fā)生頻率高于顛換的結(jié)果相符合。通過(guò)對(duì)SNPLLG-H、SNPLLG-L、SNPLLG 的SNP 所在基因進(jìn)行GO 富集，發(fā)現(xiàn)SNPLLG-H 的SNP 所在基因在每個(gè)功能的富集比例均大于SNPLLG-L 的SNP 所在基因。SNPLLG-H 的SNP 所在基因顯著富集在核體、細(xì)胞器內(nèi)膜、細(xì)胞-基底粘附體結(jié)、細(xì)胞質(zhì)、胞內(nèi)膜-有界細(xì)胞器、細(xì)胞外空間、嘌呤核糖核苷結(jié)合、過(guò)渡金屬離子結(jié)合、核糖核酸結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的調(diào)節(jié)、囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸代謝過(guò)程、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、膽固醇代謝過(guò)程等類別，SNPLLG-L 的SNP 所在基因顯著富集在胞內(nèi)膜-有界細(xì)胞器、細(xì)胞外區(qū)域、核腔、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞-基底粘附體結(jié)、細(xì)胞外空間、膜、核糖核酸結(jié)合、蛋白結(jié)合、陽(yáng)離子結(jié)合、過(guò)渡金屬離子結(jié)合、嘌呤核糖核苷結(jié)合、激酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸酶結(jié)合、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的調(diào)節(jié)、修飾依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)

程、活性氧代謝過(guò)程、內(nèi)胚層形成、細(xì)胞連接組件等類別。兩組SNP（SNPLLG）所在基因富集在不同的生物功能，可能與龍陵黃山羊的膻味有關(guān)，龍陵黃山羊支鏈脂肪酸的產(chǎn)生導(dǎo)致羊膻味的發(fā)生。而膻味相關(guān)基因究竟是如何影響其膻味的，還需要進(jìn)一步研究。

研究表明，ACACA、FASN是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵限速酶，在細(xì)胞之類代謝過(guò)程以及脂肪酸生物合成中起重要調(diào)控作用，F(xiàn)ASN表達(dá)模式雖有差異但其表達(dá)水平與脂肪含量都顯著正相關(guān)［18］，其表達(dá)受到多種激素的調(diào)控，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)時(shí)，能增加膻味的產(chǎn)生［19］。ACSL基因家族成員中不同成員在不同組織中有著不同的作用和表達(dá)，暗示了每種ACSL成員可能在特定的組織中發(fā)揮著不同的特定作用，ACSL6往往會(huì)促進(jìn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的產(chǎn)生［20］，而支鏈脂肪酸是膻味的來(lái)源，ACSL6可能會(huì)抑制短鏈脂肪酸的生成，因此可能會(huì)降低羊的膻味［21］。該研究通過(guò)對(duì)SNP 所在基因KEGG 富集發(fā)現(xiàn)，SNP 所在基因顯著富集在在磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、胰島素抵抗、拼接體、自噬-動(dòng)物、輔因子的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、胞吞作用、AMPK 信號(hào)等通路。從與膻味相關(guān)的脂肪酸生物合成通路中隨機(jī)挑選出6 個(gè)含SNP 的基因，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)基因中，有2 個(gè)基因的SNP 導(dǎo)致了氨基酸的改變，其中ACSL3基因上的SNP 在高膻味水平和低膻味水平的龍陵黃山羊都有表現(xiàn)，ACSL6基因上的SNP 存在于低膻味水平的龍陵黃山羊，而FASN、ACACA基因上的SNP 為高膻味水平龍陵黃山羊特有。因此，ACSL6基因的變異可能會(huì)降低龍陵黃山羊的膻味，而FASN、ACACA基因的變異可能與龍陵黃山羊的高膻味有關(guān)。