夏 棟，盧 衛(wèi)，張 俊，譚艷平，劉學(xué)群，王春臺

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074）

糖基轉(zhuǎn)移酶通過對細(xì)胞中不同化合物的糖基化，參與植物各種代謝及代謝的調(diào)節(jié)［1］。糖基轉(zhuǎn)移酶參與植物細(xì)胞壁多糖的合成，從而介導(dǎo)植物形態(tài)建成的過程［2］。糖基轉(zhuǎn)移酶對微生物分泌的毒素的糖基化修飾使其對病原菌產(chǎn)生抗性，同時(shí)參與植物對逆境的防御。糖基轉(zhuǎn)移酶基因Twi1沉默的轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出Twi1底物的顯著積累和斑點(diǎn)枯萎病毒的易感性增強(qiáng)，進(jìn)一步研究其機(jī)理發(fā)現(xiàn)是由于Twi1可調(diào)節(jié)番茄植物中的類黃酮槲皮苷和山柰酚水平，從而影響植物對病毒的抵抗力［3］。擬南芥中用PstDC3000 感染后，UGT76D1敲除突變體內(nèi)二羥基苯甲酸（DHBA）糖苷和SA 水平降低，免疫反應(yīng)延遲，而過表達(dá)UGT76D1會導(dǎo)致SA 大量積累，出現(xiàn)類似HR 的病斑表型，證明UGT76D1通過促進(jìn)DHBA的糖基化，在SA 平衡和植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［4］。MeSA 作為植物系統(tǒng)獲得抗性的移動信號同樣在植物體內(nèi)存在糖基化修飾現(xiàn)象。擬南芥中UGT71C3通過對MeSA 葡萄糖化調(diào)節(jié)MeSA 和SA的平衡，促進(jìn)對SAR 響應(yīng)的負(fù)調(diào)控［5］。

sm-Ngt1基因是從煙草中分離得到1 個(gè)受甲基茉莉酸和水楊酸雙重誘導(dǎo)的基因序列，其具有糖基轉(zhuǎn)移酶的特性［6］。秦漢花等［7］將sm-Ngt1基因在擬南芥中超表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其具有抗菌核病的功能。胡文［8］將sm-Ngt1基因轉(zhuǎn)入水稻品種粵泰B（YTB）中，獲得了部分可自花授粉結(jié)實(shí)的轉(zhuǎn)基因植株，抗性鑒定表明帶有這些轉(zhuǎn)基因植株獲得了稻瘟病抗性［9］。

外源基因能否在受體植株中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，直接關(guān)系到其商品化和實(shí)用化價(jià)值［10］。外源基因在受體植株中的表達(dá)方式十分復(fù)雜，其可能受轉(zhuǎn)入方法、整合方式、甲基化以及環(huán)境條件等因素的影響導(dǎo)致沉默或者丟失。本試驗(yàn)旨在對外源基因sm-Ngt1在轉(zhuǎn)基因YTB 植株后代中遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

15 個(gè)轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻株系（編號見表1）以及非轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化受體品種水稻粵泰B（YTB），均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 轉(zhuǎn)sm-Ngt1 基因水稻材料編號

DL2000 DNA Marker、10×DNA loading buffer、rTaq、RNase、10×PCR Buffer、dNTP Mix 均購自Takara 公司；無水乙醇、CTAB、Tris-base、EDTA、氯仿、異戊醇等均為分析純級國產(chǎn)試劑。

根據(jù)持家基因actin序列設(shè)計(jì)了引物actin-F/actin-R，sm-Ngt1基因的CDS 序列設(shè)計(jì)了2 對引物GT-F1/GT-R1 和GT-F2/GT-R2 用于目的基因檢測；根據(jù)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物鑒定方法設(shè)計(jì)9 對檢測引物用于轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物的檢測［11-13］；序列由昆泰銳（武漢）生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，具體見表2。

表2 引物序列

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

5415D、5417D 冷凍離心機(jī)（德國eppendorf）；BioPhotometer DNA 濃度測定儀（德國eppendorf）；Bio-Rad laboratories MJ Research 041BR-26334 電泳儀（美國）；SBD50-1 Heto-Holten 水浴鍋（丹麥）；Universal Hold II 凝膠成像系統(tǒng)（美國）；C1000 touch thermal cycler PCR 儀（美國Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 材料種植 將15 個(gè)轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因的株系材料連續(xù)兩代（T5、T6 代）和品種YTB 種植在課題組實(shí)驗(yàn)室和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物試驗(yàn)基地水稻種植區(qū)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)面積為11 m2（2 m×5.5 m）。所有材料除全生育期不使用任何防稻瘟藥物外，均按常規(guī)栽培管理。

1.3.2 農(nóng)藝性狀比較 對轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻株系與受體品種進(jìn)行生育期、株高、結(jié)實(shí)率及千粒重進(jìn)行考察和統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 CTAB 法提DNA 取材料長約2 cm 葉片于1.5 mL EP 管中，加入液氮迅速研磨至粉末狀。加入65 ℃預(yù)熱的1.67% CTAB 溶液650 μL 于EP 管中，65 ℃條件下保溫1 h。室溫冷卻后加650 μL 的氯仿∶異戊醇（24∶1），4 ℃12 000 r/min 離心10 min，吸取上清于新的1.5 mL EP 管中，加入-20 ℃預(yù)冷的無水乙 醇800 μL，在-20 ℃條件 下 冷 卻1 h 后，4 ℃12 000 r/min 離心15 min。沉淀中加入800 μL 75%乙醇，4 ℃12 000 r/min 離心1 min。加入1×TE 緩沖液（含RNase）30 μL 室溫溶解DNA 后保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 目的基因sm-Ngt1的PCR 檢測 根據(jù)目的基因sm-Ngt1編碼區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，對轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻株系及YTB 的基因組DNA 進(jìn)行actin和sm-Ngt1基因鑒定。PCR 擴(kuò)增體系為：10×rTaq buffer 1.5 μL、F、R 引 物（10 μmol/L）各0.25 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 1.0 μL、DNA 模板1.5 μL、5 U/μL rTaq 聚合酶0.1 μL、去離子水10.4 μL；PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃30 s-57 ℃30 s-72 ℃1 min，34 個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸5 min。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物的分子檢測 根據(jù)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因鑒定方法設(shè)計(jì)鑒定轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物的9 對引物bar-QF/bar-QR、 35S-F1/35S-R1、 FMV35S-F1/FMV35s-R1、PONS-F1/PONS-R1、NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35S-R1、 NPTF68/NPTR356、 HPTF226/HPTF697、PMIF43/PMIR303，以轉(zhuǎn)化水稻的pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質(zhì)粒DNA 為模板，檢測其可擴(kuò)增性和最佳復(fù)性溫度，擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序同上，復(fù)性溫度在54～62 ℃，以1 ℃為溫度梯度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，找出最佳溫度后再進(jìn)行轉(zhuǎn)基因材料的擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因sm-Ngt1 的PCR 檢測與分析

將采集的15 個(gè)轉(zhuǎn)基因sm-Ngt1水稻株系連續(xù)兩代（T5、T6 代）的劍葉葉片（每個(gè)株系取3 個(gè)單株作為重復(fù)）進(jìn)行DNA 提取，actin-F/actin-R 擴(kuò)增檢測材料DNA 質(zhì)量，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 轉(zhuǎn)基因材料DNA 質(zhì)量

如圖2 所示，用GT-F1/GT-R1 和GT-F2/GT-R2對T6 代進(jìn)行轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻陽性鑒定，編號2、4、6、10 這4 個(gè)株系中無條帶，這表明這4 個(gè)株系均為陰性，sm-Ngt1基因沒有插入；編號8 的株系中，3株有1 株無條帶，表明該株系還處于分離狀態(tài)；其余轉(zhuǎn)基因株系均為陽性，sm-Ngt1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入了YTB。

圖2 PCR 鑒定陽性轉(zhuǎn)基因株系

2.2 轉(zhuǎn)sm-Ngt1 基因水稻株系與YTB 的農(nóng)藝性狀對比

轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻株系與受體品種YTB 相比，除了莖稈明顯增粗外，其生長適應(yīng)性方面無明顯差異。如表3 所示，T6 代轉(zhuǎn)基因植株（編號1、編號3）的抽穗期、株高、結(jié)實(shí)率及千粒重與陰性（編號4）及受體YTB 差異均不顯著。

表3 轉(zhuǎn)sm-Ngt1 基因水稻轉(zhuǎn)化體與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏霓r(nóng)藝性狀對比

2.3 轉(zhuǎn)sm-Ngt1 基因水稻中轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物分子檢測

將轉(zhuǎn)化水稻YTB 用的pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質(zhì)粒DNA 作為模板檢測9 對引物的可擴(kuò)增性和最佳復(fù)性溫度，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，溫度對不同引物的擴(kuò)增無明顯影響，5 對引物（35S-F1/35S-R1、NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35SR1、HPTF226/HPTF697、NPTF68/NPTR356）可以擴(kuò)增明顯的條帶，說明載體pCAMBIAI1305.1 含有這5種元件。表明pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質(zhì)?？梢宰鳛閟m-Ngt1植株中不同轉(zhuǎn)基因原件PCR 鑒定時(shí)穩(wěn)定的對照。

圖3 梯度PCR 檢測引物的最佳復(fù)性溫度

用這5 對引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻不同株系基因組DNA，結(jié)果顯示有3 對引物（NOS-F1/NOSR1、T35S-F1/T35S-R1、NPTF68/NPTR356）在轉(zhuǎn)基因水稻T5 代和T6 代中都能擴(kuò)增出特異性條帶（圖4）。2 對引物（35S-F1/35S-R1、HPTF226/HPTF69）在編號2、4、6、10 這4 個(gè)株系（T5 和T6）中無條帶，編號8的株系中，3 株T6 中有1 株無條帶，其余株系都有條帶（圖5）。

圖4 PCR 分子標(biāo)記檢測

圖5 PCR 分子標(biāo)記檢測

3 小結(jié)與討論

外源基因在轉(zhuǎn)基因受體中的遺傳穩(wěn)定性受進(jìn)入受體植株基因組位置的影響，其在轉(zhuǎn)基因后代中的表達(dá)可能受到特異性抑制而出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默。Singh 等［14］和張小紅等［15］對玉米和轉(zhuǎn)Xa23 基因水稻進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，外源基因插入受體植物基因組位置不同，其表達(dá)水平有明顯的差異。此外，外界環(huán)境因素對轉(zhuǎn)基因植物遺傳穩(wěn)定性也有影響。蔣佳宏等［16］研究tak基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，用光誘導(dǎo)tak基因促進(jìn)了tak2 基因轉(zhuǎn)錄，抑制了tak1 基因轉(zhuǎn)錄。本研究根據(jù)sm-Ngt1基因序列設(shè)計(jì)2 對引物，對連續(xù)種植2年的15 個(gè)轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因水稻兩代家系的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在15 個(gè)株系中，編號2、4、6、10 的4 個(gè)轉(zhuǎn)基因家系中無sm-Ngt1基因，編號為8 的家系中含有sm-Ngt1基因但遺傳不穩(wěn)定，在其余株系中sm-Ngt1基因均能穩(wěn)定遺傳。

將轉(zhuǎn)基因用的pCAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1載體質(zhì)粒DNA 作為模板對農(nóng)業(yè)部要求的9 對引物的可擴(kuò)增性進(jìn)行檢測，有5 對引物（35S-F1/35S-R1、NOS-F1/NOS-R1、 T35S-F1/T35S-R1、 NPTF68/NPTR356、HPTF226/HPTF6975）能擴(kuò)增出特異條帶，與pCAMBIAI1305.1 質(zhì)粒載體各原件相符合。用這5 對引物鑒定15 個(gè)轉(zhuǎn)sm-Ngt1基因株系的轉(zhuǎn)基因標(biāo)記 物，有3 對 引 物（NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35S-R1、NPTF68/NPTR356）在所有轉(zhuǎn)基因水稻株系的后代中（T5 代和T6 代）都能擴(kuò)增出特異性條帶，可能是因?yàn)閜CAMBIAI1305.1：35S∷sm-Ngt1整合進(jìn)入受體YTB 基因組時(shí)，其T-DNA 未被酶完全切開，導(dǎo)致pCAMBIAI1305.1 載體的NOS基因和NPT基因進(jìn)入水稻YTB 基因組DNA 中。2 對引物（35SF1/35S-R1、HPTF226/HPTF69）檢測結(jié)果與sm-Ngt1檢測結(jié)果相同。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出編號1、3、5、7-9、11-15 的11 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系含35S 啟動子和HPT基因，編號8 株系35S 啟動子和HPT基因的遺傳不穩(wěn)定，其余的10 個(gè)株系中的35S 啟動子和HPT基因在后代中均能穩(wěn)定遺傳。