李 帆，薛 暢，張金華，任仙櫻，喻明軍，吳志剛，姜程曦

溫郁金中茉莉酸氨基酸合酶關鍵基因的克隆及生物信息學分析

李 帆1，薛 暢2#，張金華3，任仙櫻4，喻明軍5，吳志剛2*，姜程曦1*

1. 溫州大學生命科學研究院，浙江 325035 2. 溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江 溫州 325035 3. 大理藥業(yè)股份有限公司，云南 大理 671000 4. 溫州莪金醫(yī)藥有限公司，浙江 樂清 325600 5. 安徽環(huán)球基因科技有限公司，安徽 滁州 239004

克隆溫郁金茉莉酸氨基酸合酶關鍵基因（JA-amino acid synthetase）的全長cDNA序列，并進行生物信息學和表達分析。根據(jù)溫郁金轉錄組數(shù)據(jù)設計特異性引物。以溫郁金根莖的cDNA為模板，通過RT-PCR擴增獲得全長cDNA序列，利用生物信息學軟件預測基因編碼蛋白的特征；利用ClustalW和MEGA 6.06軟件構建溫郁金的系統(tǒng)進化樹；構建原核表達載體PET-22B(+)-JAR，純化重組蛋白JAR5，并進行鑒定。擴增后的基因編碼582個氨基酸，全長1749 bp，且具有典型的GH3特征結構域，不具跨膜域，不存在信號肽，屬于不穩(wěn)定蛋白；PCR擴增后得到約1 800 bp大小的片段，經(jīng)凝膠過濾色譜純化，最終得到基于蛋白印跡實驗（Western blotting）驗證正確的66 200大小的重組蛋白。首次克隆并分析了溫郁金基因，純化了JAR5蛋白，為進一步研究溫郁金基因蛋白功能研究提供依據(jù)。

溫郁金；基因；基因克?。籎AR5；蛋白純化

溫郁金Y. H. Chen & C. Ling系姜科姜黃屬藥用植物，其根莖、塊根均可供藥用，為《中國藥典》2020年版收載品種[1]，是浙江省著名道地藥材，屬“浙八味”之一[2]?，F(xiàn)代藥理與臨床研究表明溫郁金主要有效成分為萜類和姜黃素類[3-5]，具有抗腫瘤、抗血栓、保肝、抗過敏等多種藥理活性[6-7]。

JA-amino Acid Synthetase（）為編碼茉莉酸氨基酸合酶的重要基因，是植物響應茉莉酸途徑的重要基因[8]。而茉莉酸類物質（JAs），作為一種激素，廣泛存在于植物的幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中[9]，在其生長發(fā)育、應激反應和次生代謝過程中起著重要的調控作用[10-11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸信號途徑在萜類合成過程中發(fā)揮了重要的作用，茉莉酸甲酯對甜羅勒揮發(fā)物的生成有促進作用[12]，茉莉酸激素處理使橡膠樹的表達量上調[13]，倍半萜化合物青蒿素的生物合成受茉莉酸類物質的調控。

近年來，已經(jīng)從百合[14]、地黃[15]、花楸[16]等藥用植物中克隆出了茉莉酸途徑的相關基因。而基因在溫郁金中直接參與萜類揮發(fā)物合成調控的研究尚無報道，根據(jù)本課題組前期溫郁金相關實驗，發(fā)現(xiàn)溫郁金根莖中有相關轉錄本序列（JAR5_2075）。本研究以JAR5_2075序列為模板，克隆基因，構建原核表達載體并轉化至大腸桿菌重組純化JAR5蛋白并進行鑒定，為后期開展該基因蛋白功能研究提供依據(jù)。

1 材料

溫郁金樣品采自溫州瑞安陶山鎮(zhèn)種植基地，經(jīng)溫州醫(yī)科大學藥學院吳志剛副教授鑒定為姜科植物溫郁金Y. H. Chen & C. Ling。樣品洗凈、切碎，液氮下研成粉末并于?80 ℃保存?zhèn)溆?。TB Green?Premix Ex Taq?購自于TaKaRa公司；高保真酶購自于NEB公司；切膠回收試劑盒、感受態(tài)細胞BL21（DE3）購自于北京全式金生物技術有限公司；所需引物由安徽環(huán)球基因科技有限公司合成；氨芐霉素、氯霉素購自北京Solarbio公司；蛋白純化的凝膠過濾色譜材料購自北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化試劑公司。PCR Buffer緩沖液、ddH2O、瓊脂糖等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

2 方法

2.1 溫郁金總RNA提取與cDNA的合成

參照CTAB法[10]提取樣品總RNA并按RNA純化試劑盒說明純化，1%的瓊脂糖電泳檢查RNA完整性、濃度和純度，發(fā)現(xiàn)提取所得的RNA質量良好，可進行下一步實驗。依據(jù)反轉錄試劑盒的說明反轉錄合成第一鏈cDNA，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 JAR基因克隆與原核表達載體構建

根據(jù)前期的溫郁金相關實驗，用Primer Premier 5.0 軟件設計基因特異性引物。上游引物：GT1-F：5’-AATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC-ATATGCGCCTGTTTAGCCTGGAAAGTGTT-3’；下游引物：GT1-R：5’-AGCCGGATCTCAGTGG- TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATTACCGTATGCG-GTGCTAAAATA-3’，由安徽環(huán)球基因科技有限公司擴增并測序。以溫郁金的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增采用Phusion High-Fidelity酶（NEB，M0501S），PCR體系為96 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，需23 個循環(huán)；最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。將PCR擴增的得到的目的基因構建到PET-22B（+）載體，提取質粒，用XbaI-XhoI進行雙酶切，轉化至大腸桿菌中，挑菌并進行菌液測序驗證為陽性克隆。

2.3 重組蛋白的誘導表達與純化

將重組質粒轉化至BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂在卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，選取單克隆于5管LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至菌體吸光度（600）為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmoL/L，37 ℃培養(yǎng)4 h后離心，收菌制樣，SDS-PAGE與Western blotting檢測。

選取單克隆于5管LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至菌體600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度分別為0.2 moL/L與1 moL/L，分別在37 ℃和15 ℃ 220 r/min培養(yǎng)4 h和16 h，誘導融合蛋白表達，各條件制樣SDS-PAGE分析；然后將表達最優(yōu)克隆菌株37 ℃擴大培養(yǎng)4 L至600＝0.6，37 ℃誘導4 h收菌；離心收菌，重懸菌體，超聲破碎；離心，沉淀經(jīng)變性緩沖液溶解后離心，上清進行Ni柱親和色譜純化和凝膠過濾色譜（Superdex200）純化（PBS，8 moL/L Urea，pH 7.4），收集目的蛋白進行SDS-PAGE確定純度，復性至Buffer（PBS，500 moL/L L-Arg，2 moL/L GSH，0.2 moL/L GSSG，2 moL/L DTT，pH 7.4）中，過濾除菌，4 ℃保存。

2.4 JAR基因的生物信息學分析

在克隆得到基因完整開放閱讀框的前提下，利用在線軟件ExPASY（https: //web. expasy.org/compute_pi/）對JAR5蛋白進行蛋白相對分子質量及等電點的預測；通過TMHMMOL2.0（http: //www.Cbs.Dtu.dk/services/TMHMMOL/）和ProtScale（https: //web.Expasy.org/protscale/）分別預測蛋白的跨膜結構和疏水性；利用Signal4.1（http: //www.Cbs.Dtu.dk/services /SignalP/）在線預測蛋白的信號肽有無，利用PSORTII（https: //psort.hgc.jp/）對JAR5進行了亞細胞定位分析，SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat. pl? page=npsa_sopma.html）在線預測蛋白質的二級結構，利用SWISS-MOEL（https://www. Swissmodel. expasy.org/）在線軟件預測獲得JAR5蛋白三級結構；利用NCBI-BLAST（https: //blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行基因的同源性比較，利用MEGA 6.06軟件進行多序列比對構建系統(tǒng)進化樹。

3 結果與分析

3.1 JAR5_2075序列PCR擴增

以溫郁金的JAR5_2075序列cDNA為模板，通過RT-PCR進行目的基因擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶約為1800 bp，與目的基因片段大小吻合。重組質粒PET-22B(+)-JAR，提取質粒，用XbaI-XhoI進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得目的基因條帶，約為1800 bp，與預測的片段大小1815 bp（加上保護堿基）相符，部分樣品的擴增結果見圖1。

3.2 生物信息學分析

3.2.1 JAR5蛋白理化性質分析基因序列完整開放閱讀框大小為1749 bp，編碼582個氨基酸。ExPASy在線預測JAR5蛋白相對分子質量大小為66 400，等電點為5.91，化學分子式為C2976H4613N793O885S23，正電荷殘基數(shù)為58，負電荷殘基數(shù)為70，亮氨酸含量最高（占比9.8%），色氨酸含量最低（占比0.8%），不穩(wěn)定系數(shù)為40.47%，為不穩(wěn)定蛋白，體內半衰期超過10 h，預測得到蛋白質的平均親水系數(shù)是?0.215，故此蛋白為疏水蛋白。并且分析此基因蛋白保守結構域，發(fā)現(xiàn)其具有特征性結構域，屬于GH3家族成員。

M-Marker 1-JAR基因全長 2-PET-22B(+)載體 3-經(jīng)XbaI-XhoI酶切的PET-22B (+)-JAR基因

3.2.2 JAR5蛋白二級和三級結構預測分析 利用NPS在線軟件對JAR5蛋白的二級結構進行預測分析。結果顯示（圖2），JAR5蛋白二級結構元件中無規(guī)卷曲（random coil）所占的比例最高，包含250 個氨基酸，占42.37%；α-螺旋包含230個氨基酸，占38.98%；延伸鏈包含87個氨基酸，占14.75%。然后利用SWISS-MODEL Workspace在線軟件對JAR5蛋白進行同源建模，預測獲得的JAR5蛋白三級結構（圖3-A、B）與二級結構結果相符合，主要是由α螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈進一步折疊組裝形成三級結構，且與擬南芥預測得到的其中1個三級結構符合。

3.2.3 JAR5蛋白結構功能域、跨膜結構域以及信號肽分析 利用TMHMMOL 2.0在線工具對JAR5進行跨膜結構區(qū)域預測，結果表明，JAR5蛋白不含跨膜螺旋區(qū)，說明JAR5不屬于跨膜蛋白。利用SinalP4.0 Server預測分析JAR5蛋白的信號肽（圖4），結果顯示存在信號肽的概率為0.17%，故推測JAR5 蛋白不存在信號肽，是非分泌蛋白。

3.2.4 溫郁金JAR基因NCBI-Blast比對 通過NCBI-Blast數(shù)據(jù)比對，發(fā)現(xiàn)對比的6個樣品值均為零，值越小越好，越小表示同源性越高。此外，溫郁金基因與姜科姜黃屬生姜L.同源性最高，序列相似度可達95%，其次是與芭蕉科野蕉L.，同源性為85%與天南星科植物芋L.、棕櫚科海棗L.、檳榔科椰子L.同源性較低，約80%。

藍色代表α-螺旋，紅色代表延伸鏈，紫色代表無規(guī)卷曲

圖3 JAR5蛋白的三級結構模型

圖4 JAR5跨膜結構域(A)與信號肽(B)

3.2.5基因系統(tǒng)進化分析 構建溫郁金基因編碼的氨基酸序列進化樹。結果表明基因形成了單子葉植物與雙子葉植物的不同進化分支，其與姜黃L.形成一個小亞群，親緣關系最近，其次是野蕉，同菠蘿、海棗、油棕等形成大的亞群，這幾種植物的親緣性較遠（圖5）。

3.3 表達鑒定、優(yōu)化及可溶性分析結果

將以上擴增后的重組質粒進行Western blotting表達鑒定，分析該蛋白能識別相應抗體（圖6），說明該質粒表達成功。然后對重組蛋白進行表達優(yōu)化研究，結果顯示，溫度對誘導重組蛋白的表達有較強的影響，在37 ℃誘導后的沉淀樣品中蛋白表達量較高，誘導劑濃度對之幾乎沒有影響（圖7）。重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，大部分存在于B12～B6洗脫液中，且純化效果良好（圖8）。透析后的純化JAR5蛋白SDS-PAGE結果見圖9。不含其他雜帶，說明純化成功。

圖5 溫郁金JAR基因編碼氨基酸的系統(tǒng)進化樹

M-Marker 1-未誘導樣品 2～6-誘導后樣品

M-Marker 1-15 ℃ 0.2 moL·L?1 IPTG誘導后樣品 2-15 ℃ 1.0 moL·L?1 IPTG誘導后樣品 3-37 ℃ 0.2 moL·L?1 IPTG誘導后樣品 4-37 ℃ 1.0 moL·L?1 IPTG誘導后樣品 5-未誘導樣品 6-37 ℃ 1.0 moL·L?1 IPTG誘后沉淀樣 7-37 ℃ 1.0 moL·L?1 IPTG誘后上清樣 8-7 ℃ 0.2 moL·L?1 IPTG誘后沉淀樣 9-37 ℃ 0.2 moL·L?1 IPTG誘后上清樣 10-15 ℃ 1.0 moL·L?1 IPTG誘后沉淀樣 11-15 ℃ 1.0 moL·L?1 IPTG誘后上清樣 12-15 ℃ 0.2 moL·L?1 IPTG誘后沉淀樣 13-15 ℃ 0.2 moL·L?1 IPTG誘后上清樣

4 討論

到目前為止，對于基因的研究多集中于茉莉酸信號途徑響應萜類次生代謝產(chǎn)物合成積累上，對于基因直接參與次生代謝產(chǎn)物調控的研究較少，尤其是溫郁金中尚無深入研究，本研究從溫郁金根莖中成功克隆獲得溫郁金基因，該基因編碼582個氨基酸，通過Clustal X等生物信息學軟件將溫郁金基因與其他物種基因序列進行多重性比對和進化分析，序列同源性較高，部分區(qū)段同源性達 100%，說明其在進化中是十分保守的，也有助于其他物種基因的克隆與分離。這些保守區(qū)基因信息為其他物種中該基因的克隆提供了十分有價值的序列信息，為加快基因克隆及基因的分子調控研究奠定基礎。通過NCBI對該基因的蛋白質進行二級和三級結構預測，也有助于未來該基因在生物體內的調控研究。

圖8 凝膠過濾色譜純化峰圖

M-Marker S-復性樣

植物的香味對于驅避害蟲，傳粉授粉起到了至關重要的作用，同時也是重要的觀賞性狀[17-18]，JA 對許多藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累都具有一定促進作用。JA行使功能通常以和的形式來實現(xiàn)的研究發(fā)現(xiàn)[19]。萜類生物堿長春花堿的合成積累在過表達基因之后顯著提高[20]。陽春砂MeJA誘導之后誘導基因的表達同時萜類合成通路上的合成酶的表達也發(fā)生變化[21]。“西伯利亞”百合相對表達量隨著花朵的逐漸開放至盛開期而逐漸升高，很有可能在萜烯類揮發(fā)物次生代謝產(chǎn)物的生物合成中發(fā)揮著作用[15]。因此，可以推測基因與萜類合成代謝的一些基因有一定的關聯(lián)性。本研究成功克隆獲得了溫郁金基因，該基因有典型的GH3特征結構域，研究結果為后續(xù)利用代謝工程手段調控溫郁金萜類成分提供了重要靶標基因，有益于溫郁金重要價值萜類成分的開發(fā)利用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and protein purification of key geneof jasmonate amino acid synthase in

LI Fan1, XUE Chang2, ZHANG Jin-hua3, REN Xian-ying4, YU Ming-jun5, WU Zhi-gang2, JIANG Cheng-xi1

1. Institute of Life Sciences, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China 2. School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China 3. Dali Pharmaceutical Co.,Ltd., Dali 671000, China 4. Wenzhou Ejin Pharmaceutical Co., Ltd., Yueqing 325600, China 5. Anhui Global Gene Technology Co., Ltd., Chuzhou 239004, China

To clone the full-length cDNA sequence of the key gene(JA-amino acid synthetase) jasmonic acid synthetase from, and construct a recombinant plasmid for purification and bioinformatics and expression analysis.Specific primers were designed according to the transcriptome data ofThecDNA sequence was amplified by RT-PCR from the rhizome ofand the characteristics of the gene encoding protein were predicted by bioinformatics; By cloning the JAR5_2075 sequence from the rhizome cDNA of, using bioinformatics software to predict the characteristics of the gene encoded protein, using ClustalW and MEGA 6.06 software to construct the phylogenetic tree of; It constructed the prokaryotic expression vector PET-22B (+)-, purifying and recombining protein JAR5, and identified it.The amplified gene encoded 582 amino acids, with a total length of 1749 bp, and had a typical GH3 characteristic domain, without transmembrane domain, and no signal peptide. It was an unstable protein; The size of PCR amplification was about 1800 bp, the fragment was purified by gel filtration chromatography, and finally obtained the correct 66 200 recombinant protein based on Western Blot.Thegene ofwas cloned and analyzed for the first time, and the JAR5 protein was purified, which provided a basis for further research on the protein function of thegene of.

Y. H. Chen & C. Ling;gene; gene cloning; JAR5; protein purification

R286.12

A

0253 - 2670(2022)06 - 1838 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.027

2021-10-21

大理藥業(yè)股份有限公司橫向課題（KJHX1603）；溫莪術規(guī)范化生產(chǎn)及基地建設研究（KJHX2008）

李 帆（1994—），女，山東泰安人，碩士，研究方向為中藥次生代謝學。Tel: 13676796304 E-mail:1471750585@qq.com

薛 暢（1997—），男，安徽池州人，在讀碩士研究生，研究方向為生物信息學。Tel: 18156637292

姜程曦，研究員，研究方向為中藥學。Tel: 18969715696 E-mail: jiangchengxi@126.com

吳志剛，副教授，研究方向為中藥次生代謝產(chǎn)物研究。Tel: 15867176058 E-mail: wuzhigang177@126.com

[責任編輯 時圣明]