許 浚，張鐵軍*，王文倩，林 娟，李楚源*

·丹紅化瘀研究專(zhuān)欄·

丹紅化瘀口服液的二次開(kāi)發(fā)研究

許 浚1, 2, 3，張鐵軍1, 2, 3*，王文倩1，林 娟4，李楚源4*

1. 天津藥物研究院，天津 300462 2. 天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 3. 天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 4. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515

中藥大品種二次開(kāi)發(fā)研究是中藥創(chuàng)新研究的重要內(nèi)容，是繼承和發(fā)展中醫(yī)藥理論、突破制約中醫(yī)藥理論和中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸的重要路徑。藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究是中藥大品種二次開(kāi)發(fā)的核心內(nèi)容。對(duì)丹紅化瘀口服液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，即通過(guò)對(duì)原料藥材、復(fù)方制劑以及口服后血中移行成分的系統(tǒng)辨識(shí)，闡釋丹紅化瘀口服液的主要化學(xué)物質(zhì)組和潛在有效成分；進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析和相關(guān)受體活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，篩選和明確了其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；通過(guò)與視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥相關(guān)的整體動(dòng)物模型、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析、相關(guān)功能受體結(jié)合及酶學(xué)檢測(cè)研究，闡釋了丹紅化瘀口服液的作用機(jī)制，為該藥的臨床應(yīng)用和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

丹紅化瘀口服液；二次開(kāi)發(fā)；丹酚酸B；丹酚酸D；丹參素；迷迭香酸；原兒茶醛；阿魏酸；洋川芎內(nèi)酯I；柚皮苷；檸檬苦素；羥基紅花黃色素A；柴胡皂苷a

丹紅化瘀口服液為治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞的確有療效的中成藥，由丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、柴胡、枳殼7味藥材組成，具有活血化瘀、行氣通絡(luò)的功效，臨床用于治療氣滯血瘀引起的視物不清、突然不見(jiàn)癥及視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的吸收期見(jiàn)上述證候者，為《中國(guó)藥典》2020年版和《國(guó)家醫(yī)保目錄（2019版）》收載品種。雖然已有藥效及臨床研究證實(shí)丹紅化瘀口服液療效確切[1-5]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)并不十分清楚，現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了丹參中原兒茶醛的定量測(cè)定[6]，不能真正反映制劑質(zhì)量與療效的關(guān)系，使得難以全面有效地控制其內(nèi)在質(zhì)量。

視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞是由于各種原因引起的篩板附近或篩板以上部位的視網(wǎng)膜中央靜脈血流梗阻而導(dǎo)致的急性或亞急性視網(wǎng)膜血管性眼病。視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥分為非缺血型和缺血型[7]。缺血型視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥患者的視網(wǎng)膜發(fā)生大面積的缺血區(qū)，產(chǎn)生血管生長(zhǎng)因子，進(jìn)而形成新生血管，晚期出現(xiàn)黃斑囊樣水腫，新生血管性青光眼和玻璃體出血等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響視功能。本課題組對(duì)丹紅化瘀口服液的原料藥材、復(fù)方制劑、口服入血成分及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)物質(zhì)組進(jìn)行了系統(tǒng)地表征和辨識(shí)，進(jìn)而通過(guò)整體動(dòng)物模型、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及受體結(jié)合及酶學(xué)檢測(cè)等方法，評(píng)價(jià)其有效性，闡釋作用機(jī)制，確定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為丹紅化瘀口服液的臨床推廣應(yīng)用和指導(dǎo)臨床實(shí)踐提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 化學(xué)物質(zhì)組表征和辨識(shí)

中藥化學(xué)成分是中藥發(fā)揮功效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，是反映中藥質(zhì)量的客觀實(shí)質(zhì)。不同于化學(xué)單體藥物，中藥材來(lái)源于生物有機(jī)體，往往需要經(jīng)歷產(chǎn)地采收加工、飲片炮制、提取純化、濃縮干燥以及制劑成型等復(fù)雜的藥物制備過(guò)程，同時(shí)，藥物體內(nèi)過(guò)程也具有多組分交互作用的特點(diǎn)。因此，中藥有效成分研究應(yīng)著眼于中藥形成的全過(guò)程[8]。本課題組對(duì)丹紅化瘀口服液的原料藥材、復(fù)方制劑、口服入血成分及其代謝產(chǎn)物的化學(xué)物質(zhì)組進(jìn)行了系統(tǒng)地表征和辨識(shí)，明確了丹紅化瘀口服液的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其傳遞規(guī)律[9]，為闡釋該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，以及制訂科學(xué)的質(zhì)量控制方法和質(zhì)量控制體系提供了前提和依據(jù)。

1.1 原料藥材物質(zhì)組

丹紅化瘀口服液由7味藥材組成，本課題組采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC/Q-TOF-MS）方法，分別對(duì)丹參Bge.、當(dāng)歸(Oliv.) Diels、川芎Hort.、桃仁(L.) Batsch、紅花L.、柴胡DC.和枳殼L. 7味原料藥材化學(xué)物質(zhì)組進(jìn)行表征和辨識(shí)[9]。從丹參中共檢測(cè)鑒定出31個(gè)化學(xué)成分，包括19個(gè)酚酸類(lèi)、12個(gè)二萜醌類(lèi)成分；從當(dāng)歸中共檢測(cè)鑒定出16個(gè)化學(xué)成分，包括12個(gè)苯酞類(lèi)、4個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分；從川芎中共檢測(cè)鑒定出26個(gè)化學(xué)成分，包括15個(gè)苯酞類(lèi)、7個(gè)有機(jī)酸類(lèi)、4個(gè)其他類(lèi)成分；從桃仁中共檢測(cè)鑒定出3個(gè)氰苷類(lèi)化學(xué)成分；從紅花中共檢測(cè)鑒定出16個(gè)黃酮類(lèi)化學(xué)成分；從枳殼中共檢測(cè)鑒定出18個(gè)化學(xué)成分，包括14個(gè)黃酮類(lèi)、2個(gè)香豆素類(lèi)、1個(gè)檸檬苦素類(lèi)和1個(gè)有機(jī)酸類(lèi)成分；從柴胡中共檢測(cè)鑒定出24個(gè)化學(xué)成分，包括19個(gè)三萜皂苷類(lèi)、3個(gè)有機(jī)酸類(lèi)和2個(gè)黃酮類(lèi)成分。

1.2 復(fù)方制劑物質(zhì)組

運(yùn)用UPLC/Q-TOF-MS方法，對(duì)丹紅化瘀口服液中主要化學(xué)成分進(jìn)行表征和辨識(shí)，在丹紅化瘀口服液樣品中共鑒定得到55個(gè)化學(xué)成分，包括酚酸類(lèi)16個(gè)、二萜醌類(lèi)1個(gè)、有機(jī)酸類(lèi)7個(gè)、苯酞類(lèi)7個(gè)、香豆素類(lèi)3個(gè)、黃酮類(lèi)11個(gè)、三萜皂苷類(lèi)4個(gè)、氰苷類(lèi)2個(gè)、檸檬苦素類(lèi)1個(gè)、其他成分3個(gè)[9]。

1.3 主要入血成分及其代謝產(chǎn)物

中藥復(fù)方制劑口服后，其有效物質(zhì)首先吸收入血，再通過(guò)血液運(yùn)輸?shù)竭_(dá)疾病治療靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用，因此，只有被吸收入血的化學(xué)成分或相關(guān)代謝物，才有機(jī)會(huì)在靶器官維持一定的濃度，才有可能被看作是潛在的生物活性成分。本課題組進(jìn)一步采用血清藥物化學(xué)方法[9]，運(yùn)用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，對(duì)口服丹紅化瘀口服液后大鼠血漿中的吸收原型成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行辨識(shí)研究，通過(guò)建立給藥血漿中移行成分指紋圖譜，比對(duì)丹紅化瘀口服液制劑、大鼠給藥血漿及空白血漿樣品的色譜圖，篩選分析血中移行的原型藥物成分及代謝產(chǎn)物，結(jié)果在大鼠血漿中共鑒定得到37個(gè)丹紅化瘀口服液相關(guān)的外源性化合物，包括26個(gè)吸收原型藥物成分和11個(gè)代謝產(chǎn)物，它們可能是口服丹紅化瘀口服液潛在的活性成分。

1.4 藥材原有成分-制劑原型成分-血中效應(yīng)成分的相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)丹紅化瘀口服液原料藥材、復(fù)方制劑、口服入血成分及其代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)辨識(shí)，并將制劑中的成分與藥材中的成分進(jìn)行比對(duì)歸屬，明確了質(zhì)量屬性的傳遞過(guò)程。丹紅化瘀口服液中辨識(shí)出55個(gè)化學(xué)成分，其中來(lái)源于丹參18個(gè)、當(dāng)歸和川芎16個(gè)、枳殼13個(gè)、桃仁2個(gè)、紅花2個(gè)及柴胡4個(gè)。在大鼠血漿中共鑒定得到37個(gè)與丹紅化瘀口服液相關(guān)的外源性化合物，包括26個(gè)原型藥物成分和11個(gè)代謝產(chǎn)物，主要來(lái)源于丹參、當(dāng)歸、川芎和枳殼。

丹紅化瘀口服液及其入血成分與各味藥材歸屬分析見(jiàn)表1。

表1 丹紅化瘀口服液及其入血成分與各味藥材歸屬分析

Table 1 Analysis of Danhong Huayu Oral Liquid and its blood components and attribution of various herbs

原料藥材物質(zhì)組復(fù)方制劑物質(zhì)組主要入血成分及其代謝產(chǎn)物共有成分 藥材名成分?jǐn)?shù)成分?jǐn)?shù)峰號(hào)成分?jǐn)?shù)峰號(hào) 丹參31185、6、7、10、19、21、23、26、27、29、31、32、36、37、39、41、42、54 66、7、10、23、27、54丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、新隱丹參酮 當(dāng)歸16 711、17、33、35、45、47、55 711、17、33、35、45、47、55綠原酸、隱綠原酸、阿魏酸、3-丁基-3,6,7-三羥基-4,5,6,7-四氫苯酞、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、乙基香蘭素、洋川芎內(nèi)酯F、洋川芎內(nèi)酯G/K、6,7-環(huán)氧藁本內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯 川芎26161、2、3、9、11、13、16、17、20、33、35、38、45、46、47、551111、13、20、38、46、17、33、35、45、47、55 桃仁 3 28、14 114苦杏仁苷 紅花16 212、15 115紅花黃色素A 枳殼18134、18、22、24、25、28、30、34、40、44、48、50、53 725、28、30、34、44、48、50柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、馬爾敏、檸檬苦素、蜜橘黃素 柴胡24 443、49、51、52

2 藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

基于成分-藥效相關(guān)性研究有多種研究模式和方法[10]。從方法論上可劃分為還原論的成分-靶點(diǎn)的“要素-要素”化學(xué)生物學(xué)的篩選方式和系統(tǒng)論的化學(xué)復(fù)雜體系-生命復(fù)雜體系的“系統(tǒng)-系統(tǒng)”的篩選模式[11]。相較于傳統(tǒng)藥物化學(xué)、藥理實(shí)驗(yàn)篩選有效成分研究方法，利用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)與體外活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法研究中藥的藥效成分、潛在作用靶點(diǎn)，突破了傳統(tǒng)研究的不足，更加快速靈活，準(zhǔn)確率更高。丹紅化瘀口服液主要用于視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的治療，本課題組首先利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[12]，選擇丹紅化瘀口服液中入血成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-藥理作用-疾病”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)其可能的活性成分及作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選取與視網(wǎng)膜靜脈中央阻塞癥治療密切相關(guān)的G-蛋白偶聯(lián)受體和酶進(jìn)行體外活性實(shí)驗(yàn)[13]，篩選驗(yàn)證丹紅化瘀口服液的主要活性成分，確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的活性成分及作用機(jī)制預(yù)測(cè)分析

本課題組前期實(shí)驗(yàn)鑒定出丹紅化瘀口服液中55個(gè)化學(xué)成分[9]，并篩選出血中移行的26個(gè)原型藥物成分及11個(gè)代謝物，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)挖掘、整理，選取丹紅化瘀口服液中21個(gè)入血成分（隱丹參酮、丹參酮IIA、丹酚酸D、丹參素、原兒茶醛、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I、川芎嗪、綠原酸、阿魏酸、苦杏仁苷、紅花黃色素A、槲皮素、柴胡皂苷A、丁香酚、柚皮苷、檸檬烯、芳樟醇、辛弗林、馬爾敏、檸檬苦素），通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其生物利用度，進(jìn)一步借助TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，利用MAS 3.0生物分子功能軟件獲取相關(guān)通路，同時(shí)利用FUNRICH軟件對(duì)獲得的靶點(diǎn)通路進(jìn)行基因本體功能富集分析，最后利用Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理圖。實(shí)驗(yàn)表明，21個(gè)化合物可作用于104個(gè)蛋白靶點(diǎn)，涉及45條相關(guān)通路，其主要通過(guò)抗血栓形成、抑制新血管生成、舒張血管、抑制免疫炎癥反應(yīng)等相關(guān)通路起治療視網(wǎng)膜靜脈中央阻塞癥的作用。其中，抗血栓形成的有效成分有槲皮素、丹參酮IIA、丹酚酸D、紅花黃色素A、川芎嗪；抑制新血管生成的有效成分有隱丹參酮、丹參酮IIA、川芎嗪、丹酚酸D、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、綠原酸、阿魏酸、苦杏仁苷；舒張血管的有效成分有隱丹參酮、丹參酮IIA、原兒茶醛、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯、槲皮素、丁香酚、檸檬烯；抑制免疫炎癥反應(yīng)的有效成分有丹參素、丹參酮IIA、阿魏酸、綠原酸、槲皮素、苦杏仁苷、紅花黃色素A。

2.2 基于受體及酶活性檢測(cè)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)驗(yàn)證研究

根據(jù)化學(xué)物質(zhì)組和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，丹紅化瘀口服液可能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）活性，降低視網(wǎng)膜血管通透性，從而抑制新生血管的形成，保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障；通過(guò)抑制磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）的活性阻斷環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的裂解，增高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，從而抑制血小板聚集，同時(shí)通過(guò)抑制凝血過(guò)程的關(guān)鍵酶凝血酶，減少不溶性纖維蛋白的生成，多途徑抑制血栓的形成。丹紅化瘀口服液一方面通過(guò)拮抗α1A腎上腺素受體（adrenergic receptor α1A，ADRA1A）舒張血管，同時(shí)通過(guò)作用于內(nèi)皮素生成的限速酶內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1（endothelin converting enzyme 1，ECE1），抑制由內(nèi)皮素引起的血管強(qiáng)烈收縮，從2個(gè)途徑使血管舒張，從而減少血流阻力促進(jìn)血液循環(huán)，改善病變部位血流動(dòng)力學(xué)。因此，本部分選取與視網(wǎng)膜靜脈中央阻塞癥治療密切相關(guān)的受體和酶（VEGFR2、ADRA1A、PDE3A、凝血酶和ECE1）為研究載體，通過(guò)運(yùn)用胞內(nèi)鈣離子熒光檢測(cè)和酶抑制劑檢測(cè)技術(shù)對(duì)丹紅化瘀口服液中主要單體成分進(jìn)行體外活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，篩選驗(yàn)證丹紅化瘀口服液的主要活性成分。

結(jié)果表明，丹酚酸D、丹酚酸B、丹參素、迷迭香酸、檸檬苦素對(duì)VEGFR2酪氨酸激酶有顯著抑制活性，是抑制新血管生成的主要有效成分；丹酚酸D、丹酚酸B、丹參素、迷迭香酸和柚皮苷對(duì)PDE3A有明顯的抑制活性，是抑制血小板聚集，發(fā)揮活血化瘀作用的主要有效成分；丹酚酸D、丹酚酸B、原兒茶醛、迷迭香酸、羥基紅花黃色素A、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸、柴胡皂苷a、柚皮苷和檸檬苦素對(duì)凝血酶有明顯的抑制活性，是抑制血栓形成的主要有效成分；丹酚酸D、丹酚酸B、丹參素、迷迭香酸、羥基紅花黃色素A對(duì)ECE1也具有顯著抑制活性，柴胡皂苷a對(duì)ADRA1A有顯著的抑制作用，是舒張血管的主要有效成分。

3 藥效作用及作用機(jī)制

丹紅化瘀口服液臨床上主要用于氣滯血瘀引起的視物模糊不清、突然不見(jiàn)癥和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病和糖尿病黃斑水腫亦具有治療作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹紅化瘀口服液對(duì)血栓和多種糖尿病并發(fā)癥具有明顯改善作用，這與其抗炎和抗氧化應(yīng)激等活性密切相關(guān)[14-17]。本部分根據(jù)丹紅化瘀口服液的功能主治，進(jìn)一步從活血化瘀、抗炎、抗VEGF、免疫調(diào)節(jié)等方面研究丹紅化瘀口服液治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的作用機(jī)制。通過(guò)整體動(dòng)物-網(wǎng)絡(luò)藥理-受體實(shí)驗(yàn)，循序漸進(jìn)，逐級(jí)深入地探尋和闡釋丹紅化瘀口服液治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的作用機(jī)制。

3.1 對(duì)大鼠氣滯血瘀模型的影響及作用機(jī)制研究

中醫(yī)認(rèn)為，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥主要因情志不舒、憂(yōu)郁悲傷等致氣機(jī)郁滯、血行不暢、血瘀脈阻而溢于目[18]。血瘀的病理實(shí)質(zhì)以微循環(huán)障礙致使病變組織由于缺血、缺氧產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)代謝障礙等為主。因而，采用氣滯血瘀證大鼠模型，研究丹紅化瘀口服液對(duì)癥候病理狀態(tài)下眼結(jié)膜微循環(huán)的影響，從中醫(yī)藥“整體觀”和“證候理論”角度探索丹紅化瘀口服液“活血化瘀、行氣通絡(luò)”的作用機(jī)制[19]。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組及丹紅化瘀口服液低、中、高劑量（3.25、6.5、13 mL/kg）組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，除對(duì)照組外，其余大鼠采用復(fù)合刺激因素使其達(dá)到氣滯血瘀狀態(tài)，造模同時(shí)給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥3周。

結(jié)果顯示，與模型組比較，丹紅化瘀口服液低劑量組微血管管徑顯著增大，血流速度顯著加快；中劑量組微血管交叉數(shù)顯著增多，血管管徑顯著增大，血流速度顯著加快；高劑量組鏡下血管計(jì)數(shù)顯著增加，血管交叉數(shù)顯著增多，血管管徑顯著增大，血液流速顯著加快。丹紅化瘀口服液中、高劑量組血栓烷B2（thromboxane B2，TXB2）/6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-F1α）值顯著降低，血小板聚集率也明顯降低；高劑量組cAMP/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）值顯著降低；3個(gè)劑量組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活性和一氧化氮（nitric oxide，NO）自由基含量顯著降低；中、高劑量組VEGF含量顯著降低。丹紅化瘀口服液3個(gè)劑量組眼結(jié)膜組織磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein，p-CREB）和iNOS的蛋白表達(dá)水平均有不同程度的降低。

結(jié)果表明，丹紅化瘀口服液具有良好的活血化瘀、行氣通絡(luò)作用，其行氣作用與減少氣滯應(yīng)激產(chǎn)生的血清NO自由基，降低血清iNOS活性有關(guān)；其活血化瘀作用與降低血清TXB2含量、TXB2/6-keto-F1α值和血小板最大聚集率，減少VEGF含量有關(guān)。其抗VEGF作用對(duì)治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥有非常積極的臨床意義，其機(jī)制可能與減少cAMP和p-CREB有關(guān)。

3.2 對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注的保護(hù)作用及機(jī)制研究

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷在視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞癥的病理中起重要作用，常導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡，對(duì)患者視功能造成不可逆損傷[20]。本部分采用視網(wǎng)膜缺血再灌注大鼠模型，闡述丹紅化瘀口服液對(duì)實(shí)驗(yàn)性高眼壓致視網(wǎng)膜缺血再灌注誘發(fā)的視網(wǎng)膜損傷模型的保護(hù)作用及其機(jī)制[21]。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組及丹紅化瘀口服液低、中、高劑量（3.25、6.50、13.00 mL/kg）組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，每天給藥1次，連續(xù)給藥30 d。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，比色法測(cè)定血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；免疫組化檢測(cè)視網(wǎng)膜缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、VEGF和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65蛋白表達(dá)情況；HE染色觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞減少，視網(wǎng)膜萎縮變?。坏ぜt化瘀口服液高、中、低劑量組均可改善視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性程度。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)顯示，與模型組比較，丹紅化瘀口服液低、中、高各劑量組均可明顯提高血清中SOD、GPX、IL-10水平，顯著提高血清中CAT活性，而高劑量組可顯著降低MDA水平，低、中、高劑量組均顯著降低IL-1β水平，中、高劑量組顯著降低IL-6、TNF-α水平。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，丹紅化瘀口服液低、中、高劑量組均可顯著降低HIF-1、Caspase-3、VEGF和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果表明，丹紅化瘀口服液對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷具有防治作用，體現(xiàn)在抗缺血、抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞損傷等方面，其抗炎作用與抑制炎癥通路蛋白NF-κB p65表達(dá)有關(guān)，抗細(xì)胞損傷作用與減少視網(wǎng)膜組織HIF-1、細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

3.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的作用機(jī)制研究

本部分在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法[12]，探究丹紅化瘀口服液治療視網(wǎng)膜靜脈中央阻塞癥的作用機(jī)制。選取丹紅化瘀口服液中的21個(gè)入血成分為研究對(duì)象，借助TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)化合物的作用靶點(diǎn)，利用MAS 3.0生物分子功能軟件獲取相關(guān)通路、通過(guò)FUNRICH軟件對(duì)獲得靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析，最后利用Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)藥理圖。結(jié)果表明，丹紅化瘀口服液中槲皮素等化合物可作用于與血栓形成相關(guān)的蛋白如凝血因子Ⅹa、凝血因子VII（輔助促凝血酶原激酶）、凝血酶、血栓烷A合酶、前列腺素合酶、纖溶酶原激活物抑制劑1、組織型纖溶酶原激活物、尿激酶型纖溶酶原激活物等，抑制凝血過(guò)程和血小板活化及影響纖溶系統(tǒng)，從而減少血瘀發(fā)生。丹紅化瘀口服液中丹酚酸D等成分可作用于與血管生成有關(guān)的蛋白，如VEGFA、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（endothelial growth factor receptor，EGFR），參與調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路等，抑制新生血管生成來(lái)抑制視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥的病情發(fā)展。丹紅化瘀口服液中藁本內(nèi)酯等成分可干預(yù)與血管平滑肌相關(guān)的蛋白，如ADRA1A、α1B腎上腺素受體、β2腎上腺素受體、電壓門(mén)控鉀通道亞族H-2蛋白、內(nèi)皮素-1受體、ECE1、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、M3乙酰膽堿受體等，發(fā)揮舒張血管作用，以達(dá)到行氣以行血目的。丹紅化瘀口服液中丹參素等通過(guò)作用于與免疫、炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白和通路，如花生四烯酸5-脂氧合酶、前列腺素受體、T-淋巴細(xì)胞活化抗原CD86、γ干擾素、白IL-1B、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、白三烯A-4水解酶，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)、花生四烯酸代謝、抗原的處理和表達(dá)等，干預(yù)花生四烯酸代謝等過(guò)程抑制炎癥因子釋放、促進(jìn)免疫應(yīng)答。

綜上，丹紅化瘀口服液通過(guò)作用于與凝血過(guò)程、新血管生成、血管舒張、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等相關(guān)的靶點(diǎn)，起到活血化瘀、行氣通絡(luò)的功效從而發(fā)揮視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥治療作用，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

3.4 基于相關(guān)受體和酶的作用機(jī)制研究

在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇與視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥治療相關(guān)的ADRA1A、VEGFR2、PDE3A、凝血酶以及ECE1為研究對(duì)象，通過(guò)運(yùn)用胞內(nèi)鈣離子熒光檢測(cè)和酶抑制劑檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)丹紅化瘀口服液及主要代表性單體成分給藥后對(duì)ADRA1A的拮抗作用以及對(duì)VEGFR2酪氨酸激酶、PDE3A、凝血酶和ECE1的抑制活性，從細(xì)胞分子水平進(jìn)一步研究丹紅化瘀口服液的治療作用機(jī)制，闡明其作用的靶點(diǎn)。

結(jié)果表明，丹紅化瘀口服液分別稀釋100、1000倍對(duì)VEGFR2酪氨酸激酶都有顯著抑制活性[13]；丹紅化瘀口服液稀釋50、500倍對(duì)PDE3A、凝血酶、ECE1顯示出較強(qiáng)的抑制效果，且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性；丹紅化瘀口服液稀釋50倍對(duì)ADRA1A有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。故推測(cè)丹紅化瘀口服液可能通過(guò)抑制VEGFR2酪氨酸激酶活性，降低視網(wǎng)膜血管通透性，從而抑制新生血管的形成，保護(hù)血-視網(wǎng)膜屏障；另外，通過(guò)抑制PDE3A的活性阻斷cAMP的裂解，增高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，從而抑制血小板聚集，同時(shí)通過(guò)抑制凝血過(guò)程的關(guān)鍵酶凝血酶，減少不溶性纖維蛋白的生成，多途徑抑制血栓的形成；并且丹紅化瘀口服液一方面通過(guò)拮抗ADRA1A舒張血管，同時(shí)通過(guò)作用于內(nèi)皮素生成的限速酶ECE1，抑制由內(nèi)皮素引起的血管強(qiáng)烈收縮，從2個(gè)途徑使血管舒張，從而減少血流阻力促進(jìn)血液循環(huán)，改善病變部位血流動(dòng)力學(xué)。

4 結(jié)語(yǔ)

中藥大品種的二次開(kāi)發(fā)研究是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容，以確有療效的中藥大品種為載體進(jìn)行系統(tǒng)研究，是繼承和發(fā)展中醫(yī)藥理論，突破制約中醫(yī)藥理論和中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸的重要路徑。通過(guò)現(xiàn)代化學(xué)生物學(xué)模型方法，闡釋中醫(yī)藥針對(duì)疾病的治法原理、配伍理論和方劑的配伍規(guī)律，發(fā)展和完善中醫(yī)藥理論；通過(guò)二次開(kāi)發(fā)研究，以現(xiàn)代科學(xué)方法、客觀指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)闡明中藥復(fù)雜體系的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)和提煉中藥大品種的作用特點(diǎn)和比較優(yōu)勢(shì)，挖掘其臨床核心價(jià)值，指導(dǎo)臨床實(shí)踐，提高臨床療效；并建立科學(xué)、有效的質(zhì)量控制方法，保證藥品的質(zhì)量均一、穩(wěn)定、可控。本課題組近年來(lái)對(duì)疏風(fēng)解毒膠囊[22]、元胡止痛滴丸[23]、六經(jīng)頭痛片[24]、海馬補(bǔ)腎丸[25]等多個(gè)中藥大品種進(jìn)行了系統(tǒng)的二次開(kāi)發(fā)研究，建立了中藥大品種二次開(kāi)發(fā)研究的模式和方法[26-28]。

本文對(duì)丹紅化瘀口服液進(jìn)行了系統(tǒng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究，通過(guò)從原料藥材-成方制劑-入血成分-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-體外活性篩選研究，發(fā)現(xiàn)丹紅化瘀口服液發(fā)揮治療作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能為丹參中的酚酸類(lèi)成分（丹酚酸B、丹酚酸D、丹參素、迷迭香酸、原兒茶醛），川芎和當(dāng)歸中的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I，枳殼中的柚皮苷和檸檬苦素，紅花中的羥基紅花黃色素A，柴胡中的柴胡皂苷a。通過(guò)整體動(dòng)物-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-體外受體試驗(yàn)研究，表明丹紅化瘀口服液具有抗血栓作用、抗炎、抗新生血管生成和擴(kuò)張血管等作用，對(duì)視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞癥具有改善作用，其機(jī)制可能與抑制ADRA1A、VEGFR2酪氨酸激酶、PDE3A、凝血酶和ECE1活性有關(guān)，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，為丹紅化瘀口服液的臨床推廣應(yīng)用和指導(dǎo)臨床實(shí)踐提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study of secondary development of Danhong Huayu Oral Liquid

XU Jun1, 2, 3, ZHANG Tie-jun1, 2, 3, WANG Wen-qian1, LIN Juan4, LI Chu-yuan4

1. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 2. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. State Key Laboratory of Drug Delivery and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 4. Guangzhou Baiyun Mountain and Hutchison Whampoa Co., Ltd., Guangzhou 510515, China

To study the secondary development of major Chinese materia medica (CMM) varieties is the important content of CMM innovation research, and it is also the important approach of inheriting and developing traditional Chinese medicine (TCM) theory and breaking the bottleneck restricting the development of TCM theory and CMM industry development. The study of pharmacodynamic material basis and mechanism is the core content of the secondary development of CMM. The study on the material basis and mechanism of Danhong Huayu Oral Liquid (丹紅化瘀口服液) was reviewed in this paper. The chemical components of Danhong Huayu Oral Liquid were elucidated by identification and characterization of herbs, Danhong Huayu Oral Liquid and components ingested into the blood. Through the network pharmacology prediction analysis and related receptor activity test experiment, the main pharmacodynamic material basis was screened and identified. The mechanism of Danhong Huayu Oral Liquid was explained by the studies of animal models, network pharmacology, and functional receptors related with central retinal vein occlusion, in order to provide a scientific basis for the clinical application and quality control of Danhong Huayu Oral Liquid.

Danhong Huayu Oral Liquid; secondary development; salvianolic acid B; salvianolic acid D; salvianic acid; rosmarinic acid; protocatechuic aldehyde; ferulic acid; senkyunolide I; naringin; limonin; hydroxysafflor yellow A; saikosaponin a

R285.5

A

0253 - 2670(2022)06 - 1609 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.001

2021-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81830111）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目（20ZYCGSN00200）

許 浚，研究員，主要從事中藥大品種二次開(kāi)發(fā)及中藥質(zhì)量研究。E-mail: xuj@tjipr.com

李楚源E-mail: 1226976234@qq.com

張鐵軍E-mail: zhangtj@tjipr.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]