張志華，楊倩，楊富民

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅 蘭州 730010）

2021年中國藜麥種植面積約2萬hm2，其中甘肅省的種植面積1 萬hm2，隴藜1 號是甘肅的主栽品種［1］。多糖是構(gòu)成生物體生命活動所需要的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一，具有抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、緩解疲勞和抗氧化等功效。有關(guān)對藜麥多糖提取、純化和含量測定等方面的研究主要集中在藜麥葉、秸稈及藜麥米方面［2］。如蔣玉蓉等［3］研究結(jié)果表明，藜麥葉片多糖的提取率可達到6.101 3 g/100 g，對DPPH和羥自由基的IC50（半抑制濃度）分別為31.96 μg/mL和157.62 μg/mL。郝曉華等［4］采用微波技術(shù)從藜麥秸稈中萃取多糖，提取率為1.93%，多糖對 DPPH和羥自由基的清除率為71.09%和29.72%。李佳妮等［5］采用酶解-超聲聯(lián)合萃取藜麥多糖，并測定其對羥自由基、 DPPH 和 ABTS+自由基的清除作用，發(fā)現(xiàn)多糖溶液對羥自由基清除率較高，對 DPPH 和ABTS+自由基無明顯清除效果。目前對未脫殼的隴藜1號藜麥籽實多糖的提取及抗氧化研究尚未見報道，未脫殼藜麥籽實直接提取多糖，可省去礱谷工序。

本研究以隴藜1號未脫殼的籽實為試驗材料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計對纖維素酶提取藜麥籽實多糖的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，并對其抗氧化性進行研究，旨在為未脫殼的隴藜1號多糖提取和進一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

隴藜1號購自甘肅省藜美農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 試劑

纖維素酶（晟發(fā)食品科技有限公司，活力105U/g），葡萄糖、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸均為分析純（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；苯酚、濃硫酸、石油醚、考馬斯亮藍-G250 均為分析純（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.3 儀器

DGG9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；JA2003型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；DKS26型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；GT101 型高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； STSJB-1000 型電動攪拌器（上海索廷智能設(shè)備股份有限公司）；Lyo Quest-85 型真空冷凍干燥機（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；1510酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；FTIR920 傅里葉變換紅外光譜儀（天津市拓普儀器有限公司）

1.4 試驗方法

1.4.1 藜麥多糖的提取 流程：藜麥粒→粉碎→過篩→脫脂→風(fēng)干→加去離子水→調(diào)pH值至5→控制溫度、時間、料液比、酶濃度→水浴磁力攪拌→離心→收集上清液→醇沉收集沉淀→計算藜麥多糖提取率。

1.4.2 單因素試驗 參考郭怡等［6］的方法，在溫度為60 ℃、時間為1.5 h，料液比為1∶35、纖維素酶用量為3%的基礎(chǔ)條件下，保持其他因素不變，只改變其中一個因素，設(shè)置料液比分別為1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55；溫度為40、50、60、70、80 ℃；時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h；酶濃度為1%、3%、5%、7%、9%。通過苯酚-硫酸法測多糖濃度，計算提取率，每組試驗重復(fù)3次。

1.4.3 響應(yīng)面試驗 以單因素試驗最佳提取條件作為自變量，以多糖的提取率作為響應(yīng)值，對纖維素酶法提取藜麥多糖進行4因素3水平響應(yīng)面試驗，具體試驗設(shè)計內(nèi)容見表1。

表1 Box-Behnken試驗因子及編碼值Table 1 Box-Behnken test factors and coding values

1.5 標準曲線制備

參考羅春萍等［7］的方法，將200 mg 干燥葡萄糖標品溶解，100 mL容量瓶定容。吸取1、2、3、4、5 mL移入100 mL 容量瓶再次定容，取2 mL 離心管分別添加200 μL 不同濃度的標液、200 μL 6%的苯酚溶液和700 μL 濃硫酸，60 ℃水浴15 min，冷卻至室溫。在485 nm 下測吸光值，測定3 次，取平均值，繪制標準曲線。

1.6 多糖含量測定及提取率計算

采用苯酚-硫酸法，取200 μL 稀釋的多糖待測液，蒸餾水作空白對照，在485 nm處測定吸光值，取3次平均值。

式中：C為多糖濃度；V為樣品定容后的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為藜麥籽實質(zhì)量（mg）。

1.7 分離與純化

將粗多糖液pH值調(diào)至5.0，加入3%的木瓜蛋白酶，60 ℃水浴酶解1 h，然后煮沸滅酶，離心，取上清液在截留量為1 000 U的透析袋中透析24 h，減壓濃縮。配制Sevage 試劑（氯仿-正丁醇=4∶1），加入五倍體積多糖溶液，震蕩20 min，4 000 r/min 離心5 min，取上層水相4次，加乙醇至上層水相含醇量為80%，4 ℃過夜靜置，沉淀離心加蒸餾水復(fù)溶，真空凍干。

1.8 紅外與紫外光譜分析

參考張彩梅等［8］方法，取2 mg 多糖粉末，與150 mg 溴化鉀混合研磨均勻后壓片，在波長500～4 000 cm-1的范圍內(nèi)進行紅外光譜儀掃描。

用2 mL的蒸餾水將20 mg多糖粉末溶解，用紫外線分光光度計在220～700 nm的波長下進行檢測。

1.9 抗氧化性測定

1.9.1 羥自由基清除力 參考Teng 等［9］方法，取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 多糖溶液2 mL，加入6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2 mL，靜置10 min，加入6 mmol/L 水楊酸溶液2mL，靜置30 min，在510 nm測定吸光度。

式中：Ai為樣液吸光值；Aj為蒸餾水替代水楊酸吸光值；A0為蒸餾水替代樣液吸光值。

1.9.2 DPPH 自由基清除率 參考Tan等［9］方法，取4 mL 0.2 mmol/LDPPH-無水乙醇溶液與2 mL濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的多糖溶液分別混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，517 nm波長測定吸光度，計算清除率。

式中：Ax為以乙醇溶液代替DPPH 自由基測得背景對照；Ay為再以蒸餾水代替多糖溶液測得空白對照A0。

1.9.3 ABTS+自由基清除率測定 參考Teng等［9］方法，取25 mL 7 mmol/L ABTS溶液和440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混合，避光靜置12～16 h，用無水乙醇稀釋成工作液，在734 nm所測吸光度記為Ar（0.7±0.02）。取0.1 mL 梯度濃度多糖提取液（1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL），加 入ABTS+工 作 液5 mL，避光反應(yīng)10 min，734 nm 所測吸光度，記為At。以無水乙醇代替ABTS+工作液所測吸光度記為A0。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS、Origin、Expert 8.0.6 對數(shù)據(jù)處理分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

標準曲線見圖1。線性回歸方程為：

圖1 葡萄糖標準曲線Figure 1 Glucose standard curve

由R2=0.999 4，擬合度高。

2.2 單因素試驗

2.2.1 時間對提取率的影響 圖2所示，提取時間在0.5～2 h間，多糖提取率隨提取時間的增加呈上升趨勢，在2 h時多糖提取率最大（4.18%）。之后隨著時間的延長，提取率開始下降。其原因可能是由于加熱時間過長，少量多糖發(fā)生水解或氧化造成含量降低；同時，由于過度熱浸提，導(dǎo)致部分多糖包裹在固態(tài)不溶物或其他物質(zhì)中沉降造成損失的緣故。這與石子林等［11］熱水浸提法提取密花香薷多糖和符洪宇等［12］熱水浸提法提取香椿子多糖結(jié)果一致。因此，適宜的提取時間應(yīng)為2 h。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Figure 2 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

2.2.2 料液比對提取率的影響 圖3 表明，在1∶15～1∶25的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，提取效果呈上升趨勢，1∶25 時達到峰值（3.95%）。隨著料液比的增加，提取率逐步下降。這是因為料液比增大，底物濃度被稀釋，從而影響了酶解的速率和多糖的得率。因此，宜選擇料液比為1∶25進行后續(xù)試驗。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Figure 3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of polysaccharide

2.2.3 提取溫度對多糖提取率的影響 圖4 可以看出，當溫度在40～60 ℃，隨著溫度的提高藜麥多糖的提取率也逐漸增加。60 ℃時達到最大值（4.14%）。隨后，溫度越高，提取率則不斷下降。其原因是高溫影響了纖維素酶的活性。因此，適宜的提取溫度應(yīng)為60 ℃。

圖4 提取溫度對多糖提取率的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

2.2.4 酶濃度對多糖提取率的影響 由圖5可見，在1%～5%的酶濃度范圍內(nèi)，多糖提取率與加酶量成正比，隨纖維素酶的添加量增大而逐漸升高。酶濃度在5%時達到最大，多糖提取率為4.38%。在纖維素酶添加量大于5%之后，酶促反應(yīng)并沒有繼續(xù)加快，反而出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于纖維素酶添加過多，在底物有限的條件下，影響了其作用的發(fā)揮。因此，宜選擇酶濃度為5%作為后續(xù)試驗。

圖5 酶濃度對多糖提取率的影響Figure 5 Effect of enzyme concentration on extraction rate of polysaccharide

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 方差分析 試驗結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Test design and test results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression models

方差分析結(jié)果表明，此模型顯著（P<0.05），復(fù)相關(guān)指數(shù)為R2Adj=96.89%；失擬項P值為0.606 5，不顯著（P>0.05）。說明響應(yīng)值預(yù)測性好，數(shù)值誤差小。

提取時間（A）、提取溫度（B）和酶濃度（D）一次項對提取率的影響為極顯著（P<0.01），交互二次項AB、AC、AD對提取率的影響為顯著（P<0.05）。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析 由圖6～11可見，響應(yīng)面圖形均為山丘型，且等高線呈橢圓形，說明提取溫度、提取時間、酶濃度和料液比的交互作用對提取效果有明顯的影響。提取時間軸的等高線曲線光滑，提取溫度軸的等高線密度較大，表明溫度對藜麥籽實多糖的提取有明顯的促進作用。對藜麥籽實多糖的提取效果的主要影響因子依次為：提取溫度>提取時間>酶濃度>料液比。

圖6 提取時間、溫度對多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 6 Response surface and contour plot of extraction time and temperature to extraction rate of polysaccharides

2.3.3 工藝條件驗證 在提取溫度60.54 ℃、時間2.17 h、料液比1∶20.9、酶濃度5.10%時，藜麥多糖提取率達到最高，為5.20%。為方便操作及提高重復(fù)性，調(diào)整提取時間為2.0 h、溫度60 ℃、料液比1∶20、酶濃度5%，進行3 次驗證試驗。結(jié)果表明，藜麥多糖提取率平均為5.16%，與理論值數(shù)據(jù)接近，說明確定的工藝條件合理。

圖7 提取溫度、料液比對多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 7 Response surface and contour map of extraction temperature and material-liquid ratio to extraction rate of polysaccharide

圖8 提取時間、料液比對多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 8 Response surface map and contour map of extraction time and material-liquid ratio to extraction rate of polysaccharide

圖10 提取溫度、酶濃度對多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 10 Response surface and contour map of extraction temperature and enzyme concentration to polysaccharide extraction rate

圖11 料液比、酶濃度對多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 11 Response surface map and contour map of material-liquid ratio and enzyme concentration to polysaccharide extraction rate

2.4 紅外與紫外光譜分析

與多糖的特征峰相比，3 420.62 cm-1處為一寬的多糖分子間或分子內(nèi)O-H伸縮振動引起的吸收峰，2 930.79 cm-1處為非對稱結(jié)構(gòu)的C-H伸縮振動引起的吸收峰［13］，表明該提取物為多糖類物質(zhì)。1 654.14 cm-1處存在一個C=O 伸縮振動吸收峰，1 402.47～1 085.24 cm-1處有C-H 變角振動吸收峰，1 026.40 cm-1處的吸收峰是由吡喃糖環(huán)的醚鍵C-OC 所產(chǎn)生，618 cm-1處有吸收峰說明具有β-型糖苷鍵，證明提取物符合多糖結(jié)構(gòu)特征和官能團特性［14］。

220～700 nm 藜麥去蛋白粗多糖紫外光譜如圖13 所示。由圖13 可知，提取的粗多糖不含蛋白質(zhì)、核酸，這與江琦［15］等研究表明的200～220 nm為多糖特征峰，260、280 nm 處為核酸蛋白特征峰的結(jié)果一致。

圖12 藜麥多糖紅外圖譜Figure 12 Infrared spectra of quinoa polysaccharide

圖13 藜麥多糖紫外圖譜Figure 13 UV spectrum of quinoa polysaccharide

2.5 抗氧化性測定

2.5.1 羥自由基和DPPH 自由基清除率 圖14可見，在濃度為1～5 mg/mL 的范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增大，羥自由基清除率逐漸提高。在濃度為5 mg/mL時清除率可達60.55%。

圖14 羥自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Figure 14 Changes of scavenging effect of hydroxyl radical with concentration of Quinoa polysaccharide

圖15 表明，隨著溶液濃度的增大，藜麥粗多糖對 DPPH 自由基的清除速度逐漸提高，3.0 mg/mL時DPPH 自由基的清除效率達到44.04%，但低于VC。

圖15 DPPH自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Figure 15 DPPH free radical scavenging activity in relation to the concentration of Quinoa polysaccharide

2.5.2 ABTS+自由基清除率 圖16 所示結(jié)果表明，隨著濃度的增大，藜麥粗多糖對 ABTS+自由基的清除作用逐漸增強，當濃度為3 mg/mL時，其清除率為9.09%。與 DPPH 自由基清除率比較，去除效率相對較低。

圖16 ABTS+自由基清除效果隨藜麥多糖濃度的變化情況Figure 16 ABTS+ radical scavenging effect changes with the concentration of quinoa polysaccharide

3 討論

只有在最佳pH值、提取溫度、提取時間、料液比和酶濃度下，酶才能最大限度地發(fā)揮其作用。藜麥籽實由外部穎殼和內(nèi)部藜谷組成，富含纖維素。纖維素酶促進植物細胞壁溶解的同時，還可促使纖維素和半纖維素分解成寡糖和單糖，加快胞內(nèi)物質(zhì)溶出速度［16］。由于底物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，纖維素酶能夠特異性地吸附在底物纖維素上，并與不同成分協(xié)同作用，使其降解為葡萄糖。

本試驗采用未脫殼的藜麥籽實，在提取時間為2.0 h、溫度為60 ℃、料液比1∶20、酶濃度5%的條件下，其多糖提取率最高，為5.16%。這與郭怡等［6］報道的在料液比1∶32、酶用量2 000 U/g、溫度65 ℃、時間90 min 最優(yōu)條件基本一致。從提取率來看，本研究低于郭怡等［6］報道的提取率8.0%，但高于徐瀾等［17］報道的采用超聲波輔助法提取藜麥種子多糖的結(jié)果（偏關(guān)縣2 094.5 μg/g，靜樂縣1 781.5 μg/g）。分析其原因是因為郭怡等使用的是藜麥米，徐瀾等采用的是超聲波輔助水提法。由此可見，對于未脫殼的藜麥籽實體，采用纖維素酶提取多糖，可顯著增加多糖得率。

傅里葉紅外光譜測定表明，本研究獲得的藜麥多糖具有糖類化合物紅外特征峰。紫外光譜顯示，純化后的藜麥多糖不含核酸和蛋白質(zhì)。多糖類化合物是由糖苷鍵結(jié)合、聚合程度不同的物質(zhì)所混合的高分子碳水化合物，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤和降血糖等生物活性［1］。從抗氧化性來看，隴藜1號藜麥籽實多糖對羥自由基和DPPH 自由基清除效果顯著，對ABTS+自由基清除作用一般。藜麥多糖含量豐富，具有無毒、無害、無殘留、無抗藥性等特點，未來開發(fā)利用前景廣闊。

4 結(jié)論

纖維素酶可促使纖維素和半纖維素分解，提高多糖提取率。影響未脫殼藜麥籽實多糖提取率的主要因素依次為提取溫度>提取時間>酶濃度>料液比，在提取時間為2.0 h、溫度為60 ℃、料液比1∶20、纖維素酶濃度5%的條件下，其多糖提取率可達到5.16%左右。抗氧化性是評價多糖的重要指標之一，隴藜1號藜麥籽實多糖對羥自由基、DPPH 自由基清除率效果好，對ABTS+自由基清除率相對較低。