楊學(xué)珍，孔維三，芮仕立，栗孟飛

（1. 平?jīng)鍪修r(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000；2. 永靖縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅 臨夏 731600；3. 定西市農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)技術(shù)推廣站，甘肅 定西 743000；4. 干旱生境作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070）

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花，性味甘寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能［1-2］?；瘜W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，金銀花富含多種類型的化合物，主要包括有機(jī)酸類（如綠原酸、異綠原酸和阿魏酸等）、揮發(fā)油類（如芳樟醇、棕櫚酸和香樹烯等）、黃酮類（如木犀草苷、忍冬苷和蘆丁等）、環(huán)烯醚萜類（如有裂環(huán)馬錢酸、銀花螺苷和馬錢苷酸等）、以及三萜和三萜皂苷類（如川續(xù)斷皂苷乙、灰氈毛忍冬皂苷甲和木通皂苷D等）［3-5］。藥理學(xué)研究表明，以上化合物具有抗菌、降血糖和增強(qiáng)免疫等功效［5-6］。

研究表明，金銀花質(zhì)量受環(huán)境和遺傳因素的影響，比如，綠原酸、木犀草苷、多糖和總黃酮含量不同產(chǎn)地存在較大差異，同一產(chǎn)地不同品種對(duì)有機(jī)酸和苷類成分也具有顯著影響［7-9］。金銀花具有較強(qiáng)的生長適應(yīng)性，在我國北方地區(qū)廣泛種植［10-11］。近年來，基于國家扶貧開發(fā)和生態(tài)建設(shè)項(xiàng)目實(shí)施，甘肅省較多市縣已開展規(guī)?；慕疸y花種植栽培和品種引進(jìn)，種植規(guī)模逐漸擴(kuò)大［12-13］。為了提高質(zhì)量，很多學(xué)者就不同產(chǎn)地主要活性物質(zhì)含量進(jìn)行了測定與分析，比如，甘肅省產(chǎn)區(qū)金銀花中綠原酸和木犀草苷含量與山東和河南省無顯著差異，而6個(gè)不同產(chǎn)地（蘭州市、金昌市、隴西市、靖遠(yuǎn)縣、皋蘭縣和徽縣）存在較大差異。盡管甘肅省在金銀花品種引進(jìn)、種植技術(shù)以及活性物質(zhì)測定等方面做了一定的研究［12-14］，但對(duì)于不同產(chǎn)地和品種間的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，還鮮見系統(tǒng)研究。

因此，本研究針對(duì)甘肅省5個(gè)金銀花種植主產(chǎn)區(qū)的8個(gè)品種主要活性物質(zhì)含量以及抗氧化能力進(jìn)行測定與分析，根據(jù)《中華人民共和國藥典（2015）》中金銀花中綠原酸和木犀草苷含量標(biāo)準(zhǔn)［1］，并采用模糊綜合評(píng)價(jià)法（fuzzy comprehensive appraisal method，F(xiàn)CAM）進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，旨在為甘肅省乃至西北地區(qū)金銀花高效大規(guī)模種植栽培提供科學(xué)依據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金銀花（花蕾）于2021年7月至8月采自甘肅省5個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)的8個(gè)栽培品種（5年生扦插植株，表1）。花蕾于陰涼通風(fēng)處干燥，室溫保存。

表1 甘肅省5個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)金銀花來源Table 1 Sources of Lonicera japonica from 5 different ecological sites in Gansu Province

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取液的制備 干燥金銀花經(jīng)研缽粉碎后，稱取1.0 g，置于20 mL 無水乙醇具塞三角瓶中，黑暗、25 ℃、120 r/min條件下?lián)u床振蕩提取72 h；懸浮液于4 ℃、6 000 r/min 離心10 min；上清液用無水乙醇定容至25 mL，用于綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量以及體外抗氧化能力的測定。

1.2.2 測定方法 綠原酸和木犀草苷含量測定采用HPLC 法［15］?？扇苄蕴呛繙y定采用硫酸-苯酚法［16］?？傸S酮類化合物含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法［17］?？偡宇惢衔锖繙y定采用福林酚試劑法［18］。體外抗氧化能力測定采用DPPH和鐵離子還原/氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）2種方法［19-20］。5種活性物質(zhì)綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表2 五種活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of five bioactive compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS 26.0 軟件中ANOVA Duncan 法；金銀花綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)采用模糊綜合評(píng)價(jià)法［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸和木犀草苷含量的比較

不同主產(chǎn)區(qū)和品種金銀花中綠原酸和木犀草苷含量如表3所示，代表性HPLC色譜圖見圖1。由表3 可知，5 個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)8 個(gè)品種之間綠原酸和木犀草苷含量存在較大差異，變化幅度分別為9.05（No.7）～20.59 mg/g （No.9） 和0.75 （No.3）～2.19 mg/g （No.5） 。同一品種不同主產(chǎn)區(qū)而言，如北花一號(hào)，綠原酸和木犀草苷含量變化幅度分別為11.76 （No. 11）～19.19 mg/g （No. 10） 和0.81（No.10）～1.54 mg/g （No.1）。同一主產(chǎn)區(qū)不同品種而言，如永靖縣，綠原酸和木犀草苷含量變化幅度分別 為9.05 （No.7）～16.79 mg/g （No.1） 和0.75（No.3）～2.19 mg/g （No.5）。

表3 不同主產(chǎn)區(qū)和品種金銀花主要活性物質(zhì)含量和抗氧化能力Table 3 Contents of main bioactive compounds and antioxidant capacities in different varieties of L.japonica from different ecological sites

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的代表性HPLC圖譜Figure 1 Representative HPLC chromatograms of standard references and samples

2.2 可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量的比較

由表3 可知，5 個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)8 個(gè)品種之間可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量也存在較大差異，變化幅度分別為36.27（No.8）～83.16 mg/g（No.1）、5.20（No.7）～21.51 mg/g（No.11）和5.27（No.7）～15.53 mg/g（No.8）。同一品種不同主產(chǎn)區(qū)而言，如北花一號(hào)，可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量變化幅度分別為36.27（No.8）～83.16 mg/g（No.1）、11.69（No.1）～21.51 mg/g（No.11）和10.72（No.12）～15.53 mg/g（No.8）。同一主產(chǎn)區(qū)不同品種而言，如永靖縣，可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量變化幅度分別為36.72（No.7）～83.16 mg/g（No.1）、5.20（No. 7）～12.85 mg/g（No. 5）和5.27（No. 7）～12.81 mg/g（No.1）。

2.3 體外抗氧化能力的比較

由表3可知，由于不同主產(chǎn)區(qū)和品種之間5種主要活性物質(zhì)綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量存在較大差距，使得體外抗氧化能力差異較為顯著，DPPH抑制率和FRAP值變化幅度 分 別 為26.74%（No. 7）～68.86%（No. 11）和1 905.23（No.7）～5 274.51 μmol/L（No.8）。同一品種不同主產(chǎn)區(qū)而言，如北花一號(hào)，DPPH抑制率和FRAP值變化幅度分別為41.31%（No.1）～68.86%（No.11）和2 565.36（No.11）～5 274.51 μmol/L（No.8）。同一主產(chǎn)區(qū)不同品種而言，如永靖縣，DPPH 抑制率和FRAP 值變化幅度分別為26.74%（No. 7）～50.28%（No. 4）和1 905.23（No. 7）～4 127.45 μmol/L （No.1） 。

2.4 主要活性物質(zhì)含量和體外抗氧化能力的綜合評(píng)價(jià)

通過利用FCAM 法對(duì)5個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)和8個(gè)品種中主要活性物質(zhì)含量（綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類化合物）和體外抗氧化能力（DPPH抑制率和FRAP值）進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。12 個(gè)樣品的綜合評(píng)價(jià)值（D值）范圍為0.08～0.71，其中，北花一號(hào)品種在定西市通渭縣位點(diǎn)（No.8）的D值最高（0.71），北花一號(hào)在永靖縣位點(diǎn)（No.1）次之（D=0.64），而紅色花和中科一號(hào)2個(gè)品種在永靖縣位點(diǎn)（No.3 和No.7）較低，D值分別為0.22和0.08。

表4 不同主產(chǎn)區(qū)和品種金銀花綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)Table 4 Comprehensive appraisal of quality in different varieties of L.japonica from different ecological sites

2.5 活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的相關(guān)性分析

通過對(duì)5 個(gè)主產(chǎn)區(qū)和8 個(gè)品種金銀花主要活性物質(zhì)含量和抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。5種活性物質(zhì)綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量與FRAP值均呈正相關(guān)性，其中綠原酸和總酚類化合物達(dá)到顯著水平（P<0.05）；綠原酸、總黃酮和酚類化合物含量與DPPH抑制率呈正相關(guān)性，其中總黃酮和酚類達(dá)到極顯著水平（P<0.01），而木犀草苷和可溶性糖含量與DPPH抑制率呈負(fù)相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平，另外，DPPH抑制率和FRAP值呈正相關(guān)性。

表5 不同主產(chǎn)區(qū)和品種金銀花主要活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 5 Correlation between contents of main bioactive compounds and antioxidant capacities in different varieties of L.japonica from different ecological sites

3 討論

研究證實(shí)，藥用植物代謝產(chǎn)物（包括初級(jí)和次級(jí)代謝）的生物合成和積累不僅受環(huán)境因子（如光照、溫度、水分、土壤養(yǎng)分及其微生物等）的調(diào)控，而且受自身遺傳因素的影響［22-23］。前人在對(duì)金銀花的研究中也發(fā)現(xiàn)，我國不同產(chǎn)區(qū)和品種間主要活性物質(zhì)含量也存在較大差異［9-11，14］。本研究通過對(duì)甘肅省5個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)8個(gè)不同栽培品種金銀花主要活性物質(zhì)（綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類）含量和抗氧化能力進(jìn)行測定與綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)同一主產(chǎn)區(qū)不同品種、以及同一品種不同主產(chǎn)區(qū)之間均存在較大差異，也即金銀花綜合質(zhì)量形成是生長環(huán)境和遺傳因素的作用的結(jié)果。

在環(huán)境因素影響金銀花質(zhì)量形成方面。研究發(fā)現(xiàn)，合理施肥可顯著提高綠原酸和木犀草苷的含量［24］；微量元素Cu2+、Zn2+和Fe可促進(jìn)綠原酸、木犀草苷和可溶性糖等活性物質(zhì)的積累［25-26］；過度干旱和高濃度鹽脅迫不利于植物生長和綠原酸的生物合成［27-28］；充足的光照和適宜的UV-B 輻射有利于綠原酸、木犀草苷和環(huán)烯醚萜類等活性物質(zhì)的積累［29-30］；以及高溫可顯著促進(jìn)綠原酸生物合成［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，北花一號(hào)在甘肅省5個(gè)不同主產(chǎn)區(qū)（永靖縣、通渭縣、華池縣、寧縣和景泰縣），5種主要活性物質(zhì)（綠原酸、木犀草苷、可溶性糖、總黃酮和酚類）含量以及抗氧化能力存在較大差異，表明金銀花質(zhì)量的形成是多環(huán)境因素共同影響的結(jié)果。

在遺傳因素影響金銀花質(zhì)量形成方面，研究發(fā)現(xiàn)，不同品種在同一產(chǎn)區(qū)質(zhì)量也存在較大差異［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，臨夏回族自治州永靖縣7個(gè)金銀花品種中，5種主要活性物質(zhì)含量以及抗氧化能力也存在較大差異，其中，綠原酸、可溶性糖、總酚類含量及FRAP值在北花一號(hào)中最高，而木犀草苷和總黃酮類含量在九豐二號(hào)中最高。以上結(jié)果顯示，金銀花具體活性物質(zhì)含量因品種而異。分子生物學(xué)研究表明，不同金銀花品種中功能基因的變異（如羥基肉桂酰輔酶A 奎尼羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶 hydroxycinnamoyl CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT）可能導(dǎo)致活性成分（如綠原酸）的積累差異［33-34］。

抗氧化能力是評(píng)價(jià)藥用植物綜合質(zhì)量的重要指標(biāo)［35］。很多研究發(fā)現(xiàn)，植物代謝產(chǎn)物（如總黃酮類、總酚類和可溶性糖等）與抗氧化能力具有顯著的正相關(guān)性［36-37］。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，綠原酸、總黃酮和酚類化合物含量與DPPH抑制率呈正相關(guān)性，其中總黃酮和酚類達(dá)到極顯著水平。既然金銀花的藥理學(xué)功效因其具體活性物質(zhì)而異［3-6］，因此，有必要對(duì)金銀花質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［1，10］。本研究通過采用FCAM 法對(duì)甘肅省5個(gè)主產(chǎn)區(qū)的8個(gè)品種進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)北花一號(hào)品種在通渭縣和永靖縣綜合評(píng)價(jià)值較高。

4 結(jié)論

甘肅省5 個(gè)主產(chǎn)區(qū)的8 個(gè)品種金銀花主要活性成分和抗氧化能力存在較大差異，其中，北花一號(hào)綜合質(zhì)量較高，較適宜于甘肅省種植栽培。盡管本研究針對(duì)甘肅省不同主產(chǎn)區(qū)和不同品種金銀花進(jìn)行了綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，為種植區(qū)域和品種選擇提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但對(duì)于環(huán)境因子如何調(diào)控質(zhì)量形成等還需要深入地研究。