唐氏綜合征（DS）又名21三體綜合征，是最常見的出生缺陷疾病之一，其在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率約為1/1000～1/1100，臨床表現(xiàn)為特殊面容和輕度至中度的智力障礙，部分患者合并先天性心臟病、兒童白血病、胃腸道畸形等。此外，幾乎所有的DS患者在30多歲時其神經(jīng)系統(tǒng)還會出現(xiàn)阿爾茲海默樣病變，并最終發(fā)展為早發(fā)性老年癡呆。

羊水是指羊膜腔內(nèi)包圍胎兒的液體，為胎兒提供物理保護和營養(yǎng)來源。在不同胎齡時，羊水的組成是動態(tài)的，內(nèi)含許多重要的生物分子，如胎兒脫落細胞、DNA、RNA和代謝產(chǎn)物，可反映胎兒自身的發(fā)育情況。臨床上正是通過遺傳學分析羊水中的胎兒脫落細胞，以此判斷胎兒是否罹患DS。然而，羊水中miRNA在DS胎兒發(fā)育中的作用卻很少受到關(guān)注。

外泌體是由多種細胞分泌的40～100 nm的膜性小囊泡，由細胞內(nèi)多泡體出芽形成，再與細胞膜融合后釋放至細胞外基質(zhì)中。羊水中游離的miRNA可選擇性組裝到外泌體中，外泌體通過未角化的胎兒皮膚從羊水傳遞到胎兒，在細胞通訊中發(fā)揮重要作用。Sun等采用芯片技術(shù)檢測妊娠13、15、17 d的小鼠羊水中miRNA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與妊娠13、15 d小鼠相比，妊娠17 d小鼠羊水中有162個miRNA表達上調(diào)、71個miRNA表達下調(diào)，對差異表達的miRNA進行靶基因預(yù)測以及靶基因GO分析和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)最富集的生物學過程和信號通路都與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。提示羊水外泌體miRNA參與調(diào)控胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。孕中期正是胎兒神經(jīng)元發(fā)育的活躍階段，而DS最主要的表型就是先天智力低下，但羊水外泌體miRNA在DS胎兒發(fā)育中的變化和作用，目前為止國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。由此我們推測：在DS胎兒發(fā)育中期，羊水外泌體miRNA表達譜異常，miRNA通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，在DS胎兒神經(jīng)系統(tǒng)異常發(fā)育中起重要作用。

參考文獻[3-6]的配方和工藝略加修改，最終確定麻辣牛肉丁的配方(見表1)：精鹽2.5%，雞精1.4%，白糖1.5%，花椒1.5%，醬油1%，料酒1%，復(fù)合磷酸鹽0.4%，五香粉0.5%，味精1%，辣椒粉3.5%。

為此，本研究擬首先觀察DS胎兒和正常胎兒羊水外泌體中miRNA表達譜變化并對差異表達miRNA進行生物信息學分析，然后采用實時定量PCR技術(shù)驗證miRNA，最后采用雙熒光素酶實驗驗證miRNA和靶基因的調(diào)控關(guān)系，為進一步研究DS的發(fā)病機制提供新思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2021年3月～2021年5月于貴州省產(chǎn)前診斷分中心進行產(chǎn)前診斷的孕婦。納入標準：單胎妊娠，首次妊娠，無創(chuàng)高危，孕周（18～23），無其他身體疾病，本研究經(jīng)貴陽市婦幼保健院倫理委員會批準且所有參與者均已簽署知情同意書。排除標準：通過輔助生殖手段受孕者；不良孕產(chǎn)史；合并惡性腫瘤、重度高血壓、糖尿病及慢性心腦血管病。經(jīng)羊水穿刺、羊水細胞培養(yǎng)-染色體顯帶技術(shù)證實胎兒為正常整倍體的20例、為DS的20例，兩組孕婦基本情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 羊水外泌體的分離 于超凈臺中將留取的DS胎兒羊水及對照組羊水25 mL分別加入到50 mL的離心管中，300 g，4 ℃離心10 min，取上清，2000，4 ℃離心10 min，留上清，10 000，4 ℃離心30 min，取上清，100 000，4 ℃離心70 min，取透明沉淀，并用200 μL的PBS重懸，所得即為外泌體溶液。

1.2.3 外泌體miRNA測序 使用miRNeasy Micro Kit（Qiagen）提取外泌體總RNA。小RNA測序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina）試劑盒。文庫制備工作完成后，對構(gòu)建好的文庫使用Illumina Hiseq2000/2500進行測序，測序讀長為單端1×50 bp。對測序原始數(shù)據(jù)產(chǎn)出進行過濾得到Valid數(shù)據(jù)，并對Valid數(shù)據(jù)進行進一步的miRNA比對鑒定。

通過TargetScan、miRanda兩種軟件，對差異表達的miRNA進行靶基因預(yù)測，兩種軟件同時預(yù)測到的靶基因有9477個。經(jīng)過對靶基因篩選，發(fā)現(xiàn)這些miRNA都能靶向DS關(guān)鍵區(qū)段上的基因（表3）。GO分析發(fā)現(xiàn)富集的靶基因主要定位在膜、細胞核、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體、高爾基體、胞內(nèi)囊泡，主要功能與蛋白結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、突觸等有關(guān)（圖2A）；Pathway通路分析發(fā)現(xiàn)富集相對顯著的功能通路主要為癌癥、軸突導(dǎo)向、鞘脂信號通路、Ras信號通路、p53信號通路、自噬等（圖2B）。

BACH1 3'UTR-NC+let-7d-5p、BACH1 3'UTR-WT+let-7d-5p-NC、BACH1 3′UTR-WT+let-7d-5p、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）+let-7d-5p-NC、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）+let-7d-5p，各轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量分別為：3'UTR 熒光素酶質(zhì)粒0.2 μg、miRNA 質(zhì)粒終濃度100 nmol/L，具體操作按lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。細胞轉(zhuǎn)染48 h 后按Dual-Luciferase Reporter Assay System說明書進行熒光素酶活性檢測。

1.2.2.2 ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體濃度粒徑 去離子水清洗樣本池，聚苯乙烯微球（110 nm）校準儀器，用1×PBS buffer 清洗樣本池后上機（Particle Metrix，ZetaView PMX 110）檢測。

測序結(jié)果顯示，DS組與對照組存在15個差異表達的miRNA。其中7個miRNA上調(diào)，包括：miR-329-3p、PC-3p-58054、miR-30a-5p、miR-877-5p、miR-361-5p、miR-323a-3p、miR-363-3p；8 個miRNA 表達下調(diào)，包括：miR-140-3p、let-7d-5p、PC-5p-15468、PC-5p-155238、PC-3p-119358、PC-5p-93415、PC-3p-22218、mir-4512-p3（表2）。

前幾天，我和幾個同學聚會，十多年未見面了，大家都異常興奮，在茶香氤氳的包間里，彼此親切地詢問著對方的近況。多年不見，昔日青澀懵懂的學友，如今都已成熟睿智，我們談起了各自的生活，都想從別人那里尋找一些幸福感。

3.口腔內(nèi)的創(chuàng)面沒有愈合，飲酒是會出現(xiàn)疼痛的，這是常人不愿意忍受的。因此，咬傷后每天喝酒不一定是符合事實的。

1.2.4 生物信息學分析靶基因 使用TargetScan、miRanda兩款軟件對顯著性差異的miRNA分別進行靶基因預(yù)測。使用R包clusterProfiler對靶基因進行功能分析（GO）和信號通路分析，通過統(tǒng)計分析計算其中最為顯著的靶基因?！?.05作為顯著靶基因的閾值。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，兩組樣本均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的檢驗，以＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。所有的實驗都是獨立重復(fù)3次。

1.2.6 通過雙熒光報告基因系統(tǒng)檢測let-7d-5p 對BACH1的抑制作用 采用生物信息學軟件預(yù)測let-7d-5p可能調(diào)控的靶基因，篩選并評估let-7d-5p 靶向調(diào)控BACH1 的可能性。從Pubmed 基因庫中獲取人BACH1基因3'UTR序列（NM_001186.4），設(shè)計并化學合成涵蓋let-7d-5p作用位點的BACH1基因3'UTR野生型與突變型片段，BACH1-3'UTR-WT 與let-7d-5p結(jié)合位點進行點突變處理即為BACH1-3'UTR（MUT1+MUT2）基因片段。用 于BACH1-3'UTR-WT 與BACH1-3'UTR（MUT1+MUT2）基因片段PCR擴增的引物為BACH1-Fp：5'-GAGGAGTTGTGTTTGTGG AC-3'；BACH1-Rp：5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'，PCR 產(chǎn)物兩端分別為MluI 及HindIII 酶切位點。BACH1基因3'UTR 野生型與突變型片段擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定，與H306 雙熒光素酶報告載體進行酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，挑選陽性克隆菌落進行雙酶切鑒定及測序。鑒定正確的BACH1基因3'UTR野生型與突變型重組雙熒光素酶基因報告載體命名為BACH1 3'UTR（WT）及BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2）。制備對數(shù)生長期293T細胞懸液，將細胞按70%的匯合度接種到96孔板，將3'UTR雙熒光素酶質(zhì)粒（BACH1 3'UTR-NC、BACH1 3'UTRWT、BACH1 3'UTR（MUT1+MUT2））與miRNA質(zhì)粒（let-7d-5p、let-7d-5p-NC）兩兩組合共轉(zhuǎn)染293T細胞，形成6個共轉(zhuǎn)染組：BACH1 3'UTR-NC+let-7d-5p-NC、

1.2.2.1 醋酸雙氧鈾負染透射電鏡觀察外泌體形態(tài) 將提取的外泌體樣本從-80 ℃冰箱取出后置放于冰盒中，溶解后稍離心，使用移液槍吸取15 μL的外泌體樣本于銅網(wǎng)上靜置1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，然后使用移液槍吸取15 μL的2%醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min。使用濾紙將銅網(wǎng)上的外泌體樣本吸干，將染色完成的樣本放于燈下烤10 min，于透射電鏡（FEI，G2 spititi）觀察拍照，保存圖片。

1.2.5 qPCR驗證測序結(jié)果 挑選3個靶向DS關(guān)鍵區(qū)域基因最多的miRNA 進行qPCR 驗證。分離羊水外泌體、提取RNA，對目的miRNA設(shè)計引物、探針，以rRNAU6 為內(nèi)參，序列如下:miR-140-3p-F：ACGACCACA GGGTAGAACC，miR-140-3p-R：TTCGCACTGGAT ACGACGTCCGT；let-7d-5p-F：AAGGCGGAGAGGT AGTAGG，let-7d-5p-R：TTCGCACTGGATACGAC AACTATGCA；mir-4512-p3-F：CCGCCTCACTGTGT CG，mir-4512-p3-R：TTCGCACTGGATACGACGCC TG；U6-S：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6-A：AACG CTTCACGAATTTGCGT。上樣體系：cDNA3 μL，qPCR Buffer 10 μL，Primer Mix（2 μmol/L）2 μL，ddHO 5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃、5 s；58 ℃，30 s；50 個循環(huán)。采用ΔΔCt 方法對miR-140-3p、let-7d-5p、miR-4512 表達水平定量分析。

2 結(jié)果

2.1 羊水外泌體鑒定

透射電鏡下可見兩組羊水外泌體直徑在30～200 nm之間，呈圓形或橢圓形的囊泡狀結(jié)構(gòu)（圖1A），ZetaView納米顆粒跟蹤分析儀顯示羊水外泌體粒徑分布峰值為143.1 nm（圖1B），符合外泌體形態(tài)特征。Western blotting檢測兩組羊水外泌體標志蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組羊水外泌體均表達CD9、CD63、HSP70、TSG101，且表達水平一致（圖1C）。

隧洞混凝土由混凝土拌和系統(tǒng)拌制混凝土，混凝土由混凝土罐車運輸，混凝土泵輸送混凝土入倉，分層鋪料。側(cè)墻頂拱采用邊掛模板邊澆筑。底板混凝土澆筑直接入倉，軟軸振搗器振搗，人工找平收面。

2.2 兩組羊水外泌體miRNA差異表達情況

1.2.2.3 外泌體標志蛋白的檢測 按照BCA蛋白測定試劑盒（Pierce BCA Protein assay Kit，Thermo）說明書提取外泌體總蛋白。取80μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE（12%），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入Anti-CD9（abcam，1∶1000）抗體、Anti-HSP70（SANTA，SC-24，1∶500）抗體、Anti-CD63（abcam，1∶1000）抗體、Anti-TSG101（abcam，Ab125011，1∶1000）抗體，4 ℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（碧云天1∶4 000），室溫孵育90 min，TBST 洗膜3 次，ECL（Share-bio，SB-WB011）發(fā)光成像。用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶灰度值進行定量分析。

2.3 生物信息學分析靶基因

1.2.2 羊水外泌體的鑒定

2.4 qPCR驗證測序結(jié)果

DS 組miR-140-3p、let-7d-5p 較對照組顯著降低（＜0.05），與測序結(jié)果一致。miR-4512較對照組顯著增加（＜0.05），與測序結(jié)果相反（圖3）。

范冰冰的出道，源于參演一部叫《女強人》的電視劇。當年只有15歲的她，只參與拍攝了三天的戲。放在今天，也就是跑龍?zhí)椎?。但范冰冰的演藝?jīng)歷赫然寫著：1996年，范冰冰參與拍攝劉雪華與邵兵主演的電視劇《女強人》。這就像在北京的打工仔，稱自己參與首都建設(shè)差不多。不出名時可以理解，出了名還這樣做，說明這三天短暫的拍攝對她之后的演藝事業(yè)足夠重要。

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后，熒光素酶活性檢測結(jié)果如圖4顯示：let-7d-5p對空載體幾乎沒有作用；和空載組相比，let-7d-5p可以調(diào)控BACH1 帶有3'UTR的luciferase的表達（＜0.001），下降62.08%；而在結(jié)合位點突變后，這種調(diào)控關(guān)系明顯減弱（＜0.001），回升33.75%。

3 討論

本研究首次分析DS胎兒和正常胎兒羊水外泌體中miRNA表達譜，探索在DS胎兒發(fā)育過程中可能起調(diào)控作用的外泌體miRNA。測序結(jié)果顯示，與正常胎兒相比，DS 胎兒羊水外泌體miRNA 表達譜發(fā)生改變。Xie等應(yīng)用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，先天性梗阻性腎病胎兒的羊水外泌體中miR-300和miR-299-5p表達降低，且這兩個miRNA的靶基因主要參與Wnt信號通路，而Wnt信號通路已證實與腎纖維化有關(guān)，提示miR-300和miR-299-5p可能是先天性梗阻性腎病產(chǎn)前診斷的生物標志物。由于外泌體源性的miRNA比細胞中普遍存在的miRNA更為穩(wěn)定，提示本研究中觀察到的差異表達的羊水外泌體miRNA可能是DS產(chǎn)前診斷新的標記物。

大部分農(nóng)村目前都已經(jīng)修建了村村通的公路，加之當下種類多樣的交通工具，交通十分快速便捷。以平原地區(qū)來說，在5平方公里左右的范圍內(nèi)設(shè)立一個村鎮(zhèn)是可以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求的。而在山區(qū)當中的這個范圍可以縮至1.5平方公里的范圍左右。當前我國鄉(xiāng)村當中，大部分新鄉(xiāng)鎮(zhèn)的人口都不低于千人，甚至人口較多的，會在1萬人或萬人往上。在這樣的人口密度的情況下，村鎮(zhèn)居民進行集中居住，有利于擴大村鎮(zhèn)居民的活動范圍，增加村鎮(zhèn)居民的信息量，促進居民間的來往，這正是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)逐漸趨向于集約化以及專業(yè)化所需要的。而集中居住的另一個好處是能夠是農(nóng)業(yè)發(fā)展往市場農(nóng)業(yè)和產(chǎn)業(yè)農(nóng)業(yè)的方向轉(zhuǎn)變，是農(nóng)業(yè)發(fā)展多元化，促進新農(nóng)村的生產(chǎn)力。

我們對差異表達的miRNA進行靶基因篩選，發(fā)現(xiàn)差異表達的miRNA或多或少都能靶向DS關(guān)鍵區(qū)段上的基因，與DS表型息息相關(guān)。進一步對靶基因進行GO分析，發(fā)現(xiàn)主要定位在膜、細胞核、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體、高爾基體、胞內(nèi)囊泡，主要功能與蛋白結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、突觸等有關(guān)。從靶基因在各種細胞器膜和胞內(nèi)囊泡定位的情況看，這些miRNA可能與羊水外泌體的形成和釋放有關(guān)。此外，還有一個不能忽略的功能類別——突觸，“突觸”是一個神經(jīng)元的沖動傳到另一個神經(jīng)元或傳到另一細胞間的相互接觸的結(jié)構(gòu)，而DS患者的突觸數(shù)量明顯減少，由此推測DS 患者在胎兒期，其突觸發(fā)育可能異常。Pathway分析發(fā)現(xiàn)富集相對顯著的通路主要為癌癥、軸突導(dǎo)向、鞘脂信號通路、Ras信號通路、p53信號通路、自噬等。值得注意的是，其中部分通路已證實與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著密切的聯(lián)系，例如：軸突導(dǎo)向和Ras 信號通路。軸突導(dǎo)向是指在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，神經(jīng)元的軸突只有精確的抵達其目標位置才能形成具有正常生理功能的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在神經(jīng)發(fā)育過程中，軸突生長導(dǎo)向分子可與受體形成復(fù)合物，引導(dǎo)神經(jīng)突起生長的方向，但當缺乏軸突生長導(dǎo)向分子時，位于DS關(guān)鍵區(qū)段的唐氏綜合征細胞粘附分子可和受體形成受體復(fù)合物，該復(fù)合物通過激活Ras信號通路引起細胞骨架蛋白系統(tǒng)的重組，從而介導(dǎo)軸突生長錐生長，但在DS患者中，由于多了1條21號染色體，導(dǎo)致DS關(guān)鍵區(qū)段上的唐氏綜合征細胞粘附分子的過度表達，從而擾亂軸突導(dǎo)向，最終導(dǎo)致DS患者神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常。

測序技術(shù)的引入促使miRNA研究領(lǐng)域進入快速發(fā)展階段，但該技術(shù)只適合初篩，后續(xù)還需可靠性更好的qPCR技術(shù)驗證。我們采用qPCR對靶向DS關(guān)鍵區(qū)段最多的3 個miRNA 進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DS 組中miR-140-3p、let-7d-5p表達較對照組降低，與測序結(jié)果一致，而miR-4512表達較對照組增加，與測序結(jié)果相反。分析原因可能是沒有用同一批樣品進行兩種實驗，同類型樣本進行的驗證差異原因主要是個體之間的差異，特別是異質(zhì)性非常高的疾病。

康復(fù)護理通過全程的心理干預(yù)，扭轉(zhuǎn)患者的消極、負面情緒，提高患者的康復(fù)能動性及自我效能感，為康復(fù)訓(xùn)練奠定了堅固的思想基礎(chǔ)；通過飲食干預(yù)與血糖監(jiān)測，在積極控制血糖水平的同時促進患者搭建科學、合理的糖尿病飲食結(jié)構(gòu)，為患者血糖的長期控制提供了方法與指導(dǎo)，促使患者以“五架馬車”并行模式進行糖尿病的有效控制；通過專業(yè)的按摩手法，刺激患者患肢肢體感覺，加速局部血液循環(huán)，改善神經(jīng)功能，根據(jù)患者具體病情及自理能力進行科學有效、循序漸進的康復(fù)運動，最大程度上恢復(fù)患者的肢體功能。

本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)let-7d-5p 與BACH1 mRNA 3′UTR有兩個結(jié)合位點，且預(yù)測評分較高，表明let-7d-5p對BACH1可能存在靶向調(diào)控作用。BACH1位于21號染色體，是堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）和CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。作為一種負轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，BACH1能與DNA的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，從而抑制包括血紅素加氧酶-1（HO-1）在內(nèi)的參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)BACH1在DS患者腦皮質(zhì)中的表達上調(diào)，抑制抗氧化基因HO-1的表達，使其無法發(fā)揮神經(jīng)保護功能，從而增強氧化應(yīng)激，加重腦組織損傷。此外，F(xiàn)errando等在DS胎兒大腦皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，由21 號染色體編碼的4 種蛋白質(zhì)（BACH1、ERG、RUNX1、SIM2）中只有BACH1顯著表達，但此時的抗氧化基因HO-1的表達也是增加的，它還沒有受到BACH1的抑制，表明DS患者在胎兒期其大腦就已發(fā)生氧化應(yīng)激事件。本研究通過雙熒光素酶報告基因法證實let-7d-5p可靶向作用于BACH1。結(jié)合let-7d-5p在DS胎兒羊水中的表達情況，我們推測DS胎兒腦組織中BACH1表達上調(diào)，可能與羊水外泌體中攜帶的let-7d-5p有關(guān)，但具體機制如何，尚需進一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)DS胎兒與正常胎兒羊水外泌體miRNA表達譜存在差異。羊水外泌體let-7d-5p可能通過調(diào)控BACH1的表達促進DS胎兒大腦氧化應(yīng)激，這對進一步闡明該疾病的發(fā)病機制具有重要的參考意義。