張 濤，于 翔，龔 元

(遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 遼陽 111000)

目前，國內(nèi)外關(guān)于菲牛蛭素的報道較多。在抗凝血方面，黃愛民等[1]從廣西菲牛蛭消化液中分離、提取出兩種特異性凝血酶抑制劑——菲牛蛭素A和菲牛蛭素B，對凝血因子具有抑制作用。汪文茉等[2]在研究中也發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭干品(全體)、頭部(活體)及活體(全體)的抗凝血酶的比活均高于日本醫(yī)蛭，且其頭部抗凝血酶比活最高。抗血栓方面，吳軍志和于立華[3]采用大鼠靜脈血栓模型，研究菲牛蛭制品的抗血栓與溶栓作用，結(jié)果表明，寬體金線蛭凍干粉<歐洲醫(yī)蛭凍干粉<日本醫(yī)蛭凍干粉<菲牛蛭凍干粉，菲牛蛭頭部凍干粉的溶栓效果更好。黎淵弘等[4]用廣西菲牛蛭提取物對家兔動脈血栓、大鼠靜脈及體外血栓進行抗血栓研究，結(jié)果表明，家兔注射菲牛蛭提取物后抗血栓效果較好，與注射前相比有顯著差異。而關(guān)于菲牛蛭素結(jié)構(gòu)方面，Steiner[5]從菲牛蛭中提取、分離出具有抗凝活性的水蛭素，并闡述了其一級結(jié)構(gòu)，命名為Hm1和Hm2。Scacheri[6]從菲牛蛭中分離出水蛭素的變異體，與水蛭素HV-1的基本結(jié)構(gòu)有大約70%的系列同源性，并且具有較強的抗凝活性[7]。譚恩光和劉秀平[8]報道了廣東菲牛蛭素的基因序列特征，其多肽鏈上的半胱氨酸將形成3對二硫鍵對分子構(gòu)型起到穩(wěn)定作用，其多肽鏈上的酸性谷氨酸和天冬氨酸末端片段與凝血酶識別部位結(jié)合是發(fā)揮抗凝活性的關(guān)鍵，這與張彬[9]報道的水蛭素結(jié)構(gòu)相類似。上述報道表明，菲牛蛭素是一種多肽類蛋白物質(zhì)，具有較好的抗凝血、抗血栓等作用，而如何保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和抗凝活性是菲牛蛭素提取工藝的重要一環(huán)。筆者通過冷凍干燥方法，設(shè)計不同保護劑配方的正交試驗，從而篩選出對菲牛蛭粗提物保存較好的試驗配方，為后期菲牛蛭素的進一步分離純化和制劑學(xué)研究提供了一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菲牛蛭健康無病，由湖北省荊州市民康生物技術(shù)公司提供。

海藻糖、PEG2000和甘露醇來源、性狀等見表1。

表1 試驗藥物

1.2 方法

1.2.1 菲牛蛭粗提物的提取

通過鹽浸提法[10]提取菲牛蛭粗提物。將菲牛蛭活體分別稱重、剪碎、勻漿，獲得勻漿液；再分別用菲牛蛭體質(zhì)量4倍的生理鹽水稀釋勻漿液，室溫(23±2) ℃下不斷攪拌20 min，攪拌后用質(zhì)量濃度10%的三氯乙酸溶液調(diào)整pH值至2.5，65 ℃水浴15 min，其間適當(dāng)攪拌；水浴后4 ℃10000r/min離心10 min，收集上清液，上清液用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH值至7.0，而后4 ℃10000r/min離心10 min，收集上清液即為菲牛蛭粗提物。

1.2.2 菲牛蛭粗提物凍干試驗分組

試驗設(shè)置海藻糖、PEG2000和甘露醇3個變量因素，采用3因素3水平，即L9(34)正交試驗法優(yōu)選菲牛蛭粗提物凍干保護劑最佳配比濃度，每組試驗設(shè)定3個平行組。

取菲牛蛭粗提物水溶液415 mL，分裝到50 mL燒杯中，每個燒杯分裝45 mL粗提物水溶液，共9個燒杯。9個燒杯標(biāo)記為1～9組，根據(jù)表2和表3加入不同質(zhì)量的海藻糖、PEG2000和甘露醇，玻璃棒攪拌均勻。然后將每組攪拌好的菲牛蛭粗提物水溶液分裝到對應(yīng)標(biāo)記的西林瓶中，每個西林瓶裝5 mL粗提物水溶液， 9組共計81個西林瓶。再將全部的西林瓶放到-20 ℃冰箱，24 h后移到-80 ℃冰箱，再過24 h后用FD5505冷凍干燥機凍干至水分基本消失。

表2 因素水平的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 單位：%

表3 正交試驗表

1.2.3 不同條件下試驗組菲牛蛭粗提物抗凝活性測定

菲牛蛭粗提物抗凝活性采用凝血酶直接滴定法測定[11-12]，分別測定粗提物凍干粉24 h內(nèi)抗凝活性，(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后抗凝活性和(27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后抗凝活性；西林瓶中凍干粉用5 mL蒸餾水復(fù)溶，每個條件下每組設(shè)置3個平行。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析

根據(jù)試驗結(jié)果記錄菲牛蛭粗提物凍干粉抗凝活性，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并進行單因素和多因素的方差分析，顯著水平為P<0.05；并采用層次分析法統(tǒng)計正交試驗結(jié)果[13]。

2 結(jié)果和分析

菲牛蛭粗提物凍干粉各條件下的正交試驗、方差分析及權(quán)重分析結(jié)果見表4～表8。從表4可知，粗提物凍干粉的保存活性總體趨勢：粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性>(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性>(27±3)℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性。其中，第1、4、7組粗提物凍干粉保存活性在不同條件下沒有顯著性差異(P>0.05)，其余各組保存活性在不同條件下都有顯著性差異(P<0.05)。

由正交試驗結(jié)果(見表4)可知，以不同條件下粗提物凍干粉的保存活性為指標(biāo)，極差R值大小顯示各因素對粗提物凍干粉的保存活性作用均為B>C>A，A因素R值<空列組R值，由此可知A因素并不是影響凍干粉活性的主要因素；由權(quán)重分析結(jié)果(見表8)可知，各因素對粗提物凍干粉的保存活性作用為B>C>A；因此由正交試驗和權(quán)重分析綜合結(jié)果分析，3種賦形劑對粗提物凍干粉活性影響大小依次為PEG2000>甘露醇>海藻糖。方差分析結(jié)果(見表5～表7)顯示各因素對粗提物凍干粉的保存活性無顯著差異(P>0.05)；由正交試驗結(jié)果(見表4)和權(quán)重分析結(jié)果(見表8)可知，以粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性為考察指標(biāo)，3種賦形劑最佳配方為A3B3C1；以(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性和(27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性為考察指標(biāo)，3種賦形劑最佳配方為A2B3C1。

表4 菲牛蛭粗提物凍干粉保存試驗測定結(jié)果

表5 粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性方差分析結(jié)果

表6 (-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性方差分析結(jié)果

表7 (27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性方差分析結(jié)果

3 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于菲牛蛭素如何在提取純化后較好地保持其抗凝活性的報道很少，而本試驗采用冷凍干燥的方法保存菲牛蛭素，主要有以下幾方面原因[14]。1)菲牛蛭素是一種多肽類蛋白物質(zhì)，對溫度比較敏感，一旦發(fā)生蛋白降解，則易失去抗凝活性；而在低溫干燥條件下，菲牛蛭素受熱易變性成分損失很少。2)菲牛蛭素多肽鏈上二硫鍵易被氧化而失去抗凝活性；但在真空干燥條件下，環(huán)境的氧氣極少，菲牛蛭素上易被氧化的物質(zhì)可以得到保護。3)冷凍干燥法可以除去菲牛蛭粗提物水溶液中95%～99%的水分，并保持菲牛蛭素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而便于其運輸和長期保存。

同時，為防止凍干過程中菲牛蛭素的變性或結(jié)構(gòu)的破壞，本試驗選取了海藻糖、PEG2000和甘露醇作為菲牛蛭素凍干賦形劑，其主要依據(jù)有以下幾點[13]。1)菲牛蛭素多肽鏈上二硫鍵易被還原而失去抗凝活性，而海藻糖屬于非還原二糖，不會與凍干品發(fā)生還原性Mailard反應(yīng)；同時，海藻糖作為二糖能在凍結(jié)過程中起到低溫保護劑的作用，又能在干燥脫水過程中起到脫水保護劑的作用。2)PEG2000是一種聚合物保護劑，在冷凍干燥過程中，其優(yōu)先析出，具有一定的表面活性，并在蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生“位阻”作用，防止菲牛蛭素蛋白降解變性；同時，PEG2000能提高菲牛蛭粗提物水溶液黏度，提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，抑制小分子賦形劑海藻糖的結(jié)晶和pH值的降低。在生物制品冷凍干燥過程中，PEG2000既起著低溫保護劑作用，又起著脫水保護劑作用。3)菲牛蛭素作為多肽類蛋白物質(zhì)，慢速凍結(jié)是有利的，而甘露醇作為填充劑，在慢速凍結(jié)過程中會結(jié)晶，從而為菲牛蛭素活性組分提供結(jié)構(gòu)支撐，并且不會與活性組分發(fā)生反應(yīng)。

綜合上述試驗結(jié)果和幾方面因素分析可知，菲牛蛭粗提物凍干粉抗凝活性總體趨勢變化與時間和溫度有一定關(guān)系，時間越長，溫度越高，抗凝活性越低，這說明3種賦形劑對粗提物凍干粉活性影響隨著時間的增長和溫度的升高會逐漸降低，從而影響到菲牛蛭素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由表4～表8可知， 3種賦形劑對粗提物凍干粉活性影響大小依次為PEG2000>甘露醇>海藻糖，各賦形劑差異雖不顯著，但海藻糖并不是起主要作用的賦形劑，這說明聚合物類的賦形劑保護功能強于低聚糖及無醇類賦形劑。上述3種賦形劑的正交試驗結(jié)果表明，當(dāng)以粗提物凍干粉24 h內(nèi)平均抗凝活性為考察指標(biāo)時，3種賦形劑最佳配方為A3B3C1；以(-18±2) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性和(27±3) ℃條件下粗提物凍干粉15 d后平均抗凝活性為考察指標(biāo)時，3種賦形劑最佳配方為A2B3C1。