李 婷 蔣 朵 盧映菲 楊毅紅

（電子科技大學中山學院，廣東中山 528400）

園林廢棄物包括落葉、枯枝等，是城市園林綠化過程中常見的生物質廢物，其主要成分是纖維素。為提高園林廢棄物利用效率，分離和篩選具有高效纖維素降解能力的降解菌株具有重要意義。目前，國內外關于纖維素降解的研究很多，包括單一高效菌株的篩選、鑒定及改造[1]，菌種的產酶性能、作用機理及應用效果[2-7]，復合菌株的研究等[8-9]。例如，張夢君等[1]從西藏高海拔的植物根際土壤中篩選具有高效降解纖維素能力的低溫真菌，得到可在低溫條件下生長且有較強降解能力的菌株；趙鈺[2]從腐殖土中篩選出具有降解纖維素酶能力的放線菌，測定其酶活及其影響因素；孟建宇等[9]對酶活性高的菌株構建復合系，測定其濾紙降解能力，發(fā)現(xiàn)復合菌的降解能力是單菌株的5～10倍。因此，本研究的主要目的是篩選并獲得高效園林廢棄物降解菌株，并在此基礎上與同類降解菌進行比較分析，可為進一步開展高效園林廢棄物降解菌種制備提供基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本。對園林廢棄物堆積的腐殖土壤（0～20 cm土樣）及腐爛的樹葉進行取樣，作為供試樣本。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑。沙氏培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g、葡萄糖40g、瓊脂15.0g、氯霉素0.1g、蒸餾水1000mL；LB培養(yǎng)基配方為瓊脂20g、胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL；CMC-Na培養(yǎng)基配方為CMC-Na15.0g、酵母粉 5.0 g、KH2PO41.0 g、瓊脂 2.0 g、MgSO40.5g、NaCl5.0g、蛋白胨 10.0g、蒸餾水 1000mL，調節(jié)pH值至7.2；產酶培養(yǎng)基配方為CMC-Na15.0g、酵母粉 5.0 g、KH2PO42.0 g、蒸餾水 1 000 mL，調節(jié)pH值至7.0。培養(yǎng)基均為121℃滅菌25 min后使用。試劑包括二硝基水楊酸（DNS試劑）、剛果紅染色劑等。試驗所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器設備。試驗儀器包括恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造公司）、珠江牌培養(yǎng)箱（韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺（上海智城分析儀器制造公司）、高速冷凍離心機（鉑金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司）、酶標儀（鉑金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司）、旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 園林廢棄物降解菌的分離與篩選。

（1）菌株分離。將采集的土樣、腐爛落葉置于無菌水中，振蕩均勻，稀釋成一系列不同稀釋度，取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液 100 μL， 分別涂布于沙氏培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基，每個梯度重復2次。LB培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24 h，沙氏培養(yǎng)基置于28℃培養(yǎng)72 h。待長出菌落后，挑選單菌落接種于CMC-Na培養(yǎng)基上進行初步分離，CMC-Na培養(yǎng)基上分離得到纖維素降解菌株55株，將細菌編號為1～40號、真菌編號為41～55號。細菌、真菌分別于37℃和28℃培養(yǎng)48 h。

（2）菌株篩選。菌株初篩采用剛果紅染色法，用1 mg/mL剛果紅染液染色1 h，棄去染液，加入1 mol/L NaCl溶液脫色1 h。纖維素降解菌的位置會形成透明圈，選出具有水解圈的菌株共計15株。復篩采用產酶培養(yǎng)菌液，然后分別測定菌液內切型-β-葡聚糖酶活力（CMC酶活）、外切型-β-葡聚糖酶活。

（3）CMC酶活的測定。以1%羧甲基纖維素鈉溶液作為底物，測試組選取1%羧甲基纖維素鈉1 mL加入pH值=4.5的檸檬酸緩沖液0.5 mL、粗酶液0.5 mL，于50℃水浴鍋中反應30 min。中止反應后，加入DNS試劑1.5 mL，將各管搖勻，沸水浴5 min，取出。待冷卻至室溫后，定容至20 mL，加塞，顛倒混勻，并測量其在540 nm下的OD值。空白組不進行50℃水浴，先加DNS以鈍化酶活，其他操作都與測試組相同。以每分鐘生成相當于1 μg的葡萄糖為1個酶活單位。

（4）外切型-β-葡聚糖酶活力的測定。在試管中加入1%微晶纖維素底物溶液和緩沖液0.5 mL，再加入酶液0.5 mL，于50℃水浴鍋中反應30 min。中止反應后，與CMC酶的處理方式相同，在540 nm下測定其OD值?？瞻捉M不進行50℃水浴，先加DNS用于鈍化酶活，其他操作都與對照組相同。以每分鐘生成相當于1 μg的葡萄糖為1個酶活力單位。

1.2.2 纖維素降解菌鑒定。纖維素分解菌14、20、28、29、30、38號等菌株16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析。利用DNA提取試劑盒（Omega Soil DNA Kit）提取菌株基因組DNA，并以此DNA為模板，分別利用16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）、ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行 PCR 擴增。PCR的反應體系為用量50 μL，DNA模板1 μL，10×Tagbuffer5.0μL，上、下游引物各 1μL，dNTP1μL，Taq酶1 μL，無菌去離子水 40 μL。 反應程序為94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延展1 min，72℃再次延展8 min，共30個循環(huán)。

取PCR產物5 μL在1.5%瓊脂凝膠上進行電泳檢測，然后送至賽默飛世爾公司進行測序。將得到的序列在NCBI中進行Blast比對，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取相似性較高的16S rDNA序列，然后利用MEGA 7.0版本軟件進行聚類分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行同源性分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

2.1.1 初篩。從降解菌菌株的剛果紅染色結果（表1）看出：水解圈直徑較大的為52號和4號菌株，形成的水解圈直徑分別達到36.00 mm和48.00 mm；水解圈與菌落大?。ㄖ睆剑┍戎递^大的為20號、39號菌株，比值大小分別為7.00和6.00。對水解圈比值較大的10株菌株進行復篩。

表1 各樣品菌落與水解圈比對

2.1.2 復篩。測定上述10株菌株（4號、14號、20號、28號、29號、30號、31號、38號、39號、51號）的粗酶液酶活，并進行復篩。CMC酶活和外切型-β-葡聚糖酶活測定結果見圖1。由圖1可知，這10株纖維素降解菌株中CMC酶活最大的為51號菌株（48.8 U/mL），其次為 4 號菌株（40.1 U/mL）、39 號菌株（38.2 U/mL）、31 號菌株（37.7U/mL）、14 號菌株（34.5U/mL）。 外切型-β-葡聚糖酶活最大的是51號菌株（6.6 U/mL），其次是 28 號菌株（6.2 U/mL）、4 號菌株（6.0 U/mL）、20號菌株（5.2 U/mL）。

2.2 菌株的鑒定

提取 4號、14號、20號、28號、29號、30號、31號、38號、39號、51號共10株菌株的總DNA，成功提取6株菌株的DNA。利用16S rDNA通用引物擴增后外送測序，最終成功獲得4株菌株拼接序列，即14號、20號、29號和30號菌株。對各菌株及其相近序列進行建樹，結果見圖2。由圖2可知，系統(tǒng)發(fā)育樹的各節(jié)點自展值高于70，該系統(tǒng)發(fā)育樹可信。14號菌、29號菌與假蕈狀芽孢桿菌（ACMV01000212）聚為一支，且可信度達到100%，初步可斷定14號、29號菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）。20號菌株與假單胞菌 （LT718459）、蒙特氏假單胞菌（NR 114224）聚為一支，可信度達到79%，可將20號菌株初步歸為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。30號菌株與 3 株泛菌（NR 118857、KJ427829、MG450362）聚為一大支，與其中的泛菌（MG450362）聚為一小支，可信度達100%，30號菌株可初步判定為泛菌屬（Pantoea sp.）。

3 結論與討論

分離降解纖維素的微生物的方法眾多，本文結合王洪媛等[10]、張夢君等[1]、王 偉等[11]及劉津[12]的研究，先分別在LB培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基上初步分離，隨后進一步進行初篩、復篩，篩選分離出酶活性較高的6株菌株。在進行初篩時發(fā)現(xiàn)，水解圈直徑越大，酶活不一定越大，且水解圈比值與酶活大小也并非成一次函數(shù)的關系，用剛果紅染料染色CMC-Na、產生透明水解圈的方法作為判斷菌株產纖維素酶能力的唯一憑證是不可靠的。這在蔣明星等[13]、候景昊等[14]的研究中也有類似情況出現(xiàn)。在復篩中發(fā)現(xiàn)，CMC酶活高的菌株，其外切型-β-葡聚糖酶活反而低。這是由于外切型-β-葡聚糖酶可以逐步地剪切還原性和非還原性末端纖維素鏈，釋放可溶性纖維二糖或葡萄糖，CMC酶隨機水解較容易進入的纖維素分子內水解β-1，4糖苷鍵產生新的鏈末端[15]，這2種酶相互作用可以形成有效的纖維素降解體系。

隨后對14號、20號、29號和30號等4株菌株進行DNA測序。從創(chuàng)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，4株菌株分屬3個屬，其中14號、29號菌株初步判定為芽孢桿菌屬（Bacillus spp.），20號菌株初步歸為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），30號菌株可初步歸為為泛菌屬（Pantoea sp.）。

王 偉等[11]在長期堆放秸稈牛糞處和玉米水稻秸稈處篩選出2株纖維素分解菌，將菌株發(fā)酵培養(yǎng)96 h后，其CMC酶活分別為26.9、22.9 U/mL；孟建宇等[16]從內蒙古大青山土壤中篩選出13株低溫纖維素降解細菌，其CMC酶活為5.9～10.7 U/mL；路強強等[15]研究了13株常見纖維素降解菌，其CMC酶活為1.4～21.5 U/mL，外切型-β-葡聚糖酶活為1.9～14.3 U/mL；張家齊[17]在園林廢棄物堆制栽培基質過程中分離出8株降解細菌，其CMC酶活為31.0～49.0 U/mL（表2）。本文所篩選到的6株降解菌株，其CMC酶活為22.0～34.5 U/mL，外切型-β-葡聚糖酶活為2.0～6.2 U/mL，處于中上水平。

表2 本研究與其他文獻報道中CMC酶活和外切型-β-葡聚糖酶活