李艷情，翟煥趁，薛曉雯，覃雨良，張帥兵，呂揚(yáng)勇，魏 閃，馬平安，乙江嵐，胡元森

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

【研究意義】禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是小麥赤霉病的主要病原菌，該菌不僅使小麥產(chǎn)量減少，還會(huì)產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）等真菌毒素。近年來(lái)，受全球氣候及農(nóng)業(yè)秸稈處理方式變化的影響，小麥赤霉病在世界各地頻發(fā)，毒素污染日趨頻繁，嚴(yán)重影響了農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和食品安全（Zhang et al.，2014）。盡管種植抗病品種小麥?zhǔn)欠乐纬嗝共〉睦硐氪胧?，但農(nóng)作物的抗性改良難度大、進(jìn)展緩慢，目前最常用的防治方法依然是使用化學(xué)殺菌劑，其長(zhǎng)期使用必然會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染等問(wèn)題（Wegulo et al.，2015）。因此，篩選禾谷鐮刀菌拮抗菌，開(kāi)發(fā)生防菌劑是一條不可忽視的重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，真菌、放線菌和細(xì)菌等多種微生物對(duì)禾谷鐮刀菌均具有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌在室內(nèi)和田野中均可使禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)受到抑制，降低赤霉病的發(fā)生率（Schisler et al.，2011）；土壤中分離的木霉（Trichoderma gamsii）6085能減少水稻和小麥中赤霉病的發(fā)生（Matarese et al.，2012）；Palazzini等（2017）發(fā)現(xiàn)放線菌中的鏈霉菌（Streptomycessp.）RC87B能防控小麥赤霉病及減少DON的產(chǎn)生。能拮抗禾谷鐮刀菌的細(xì)菌研究報(bào)道較多，這些拮抗菌包括從不同材料中分離的不同種屬的菌種，不同拮抗細(xì)菌具有各自的特性，以不同的機(jī)制抑制禾谷鐮刀菌菌體生長(zhǎng)或阻控DON毒素的產(chǎn)生，具有潛在的生防應(yīng)用價(jià)值。一種分離于小麥根際土壤的銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）可通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)吩嗪-1-甲酰胺（PCN）而抑制禾谷鐮刀菌在小麥穗和籽粒上產(chǎn)生DON毒素（Sun et al.，2021）；從小麥種子內(nèi)分離的多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）可通過(guò)形成生物膜、合成嗜鐵素、吲哚乙酸等抗菌物質(zhì)防控赤霉病的發(fā)生（Herrera et al.，2016）；從田間土壤中分離的奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）等對(duì)小麥禾谷鐮刀菌的侵染有重要的防控效果（徐劍宏等，2013；冉軍艦等，2016；周清等，2019；馬東方等，2021）。也有研究表明，禾谷鐮刀菌拮抗菌的存在并不限于在與小麥種植相關(guān)的土壤或植株中，在其他環(huán)境中分離到的一些拮抗菌可表現(xiàn)出某些獨(dú)特的化學(xué)特性和生物學(xué)功能。Zhao等（2015）從絲瓜花粉囊中分離到一株枯草芽孢桿菌，其抗菌活性與菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和抗菌肽有關(guān)；從普通花生殼、高寒草甸牦牛牛糞中分離的解淀粉芽孢桿菌可通過(guò)產(chǎn)生伊枯草素等胞外脂肽類物質(zhì)抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)和毒素產(chǎn)生（Shi et al.，2014；陳亮等，2017）。【本研究切入點(diǎn)】在不同地域、環(huán)境及廣泛的基質(zhì)中繼續(xù)開(kāi)展禾谷鐮刀菌拮抗菌的分離、篩選，深入研究其生物學(xué)特性，是探索對(duì)日益嚴(yán)重的小麥赤霉病發(fā)生和DON污染的重要解決方案，是對(duì)現(xiàn)有防控手段研發(fā)的重要補(bǔ)充?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)禾谷鐮刀菌具有抑制作用的菌株，根據(jù)菌落形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)拮抗菌進(jìn)行種類鑒定；通過(guò)PCR擴(kuò)增抗菌脂肽基因、發(fā)酵條件試驗(yàn)、抑菌物質(zhì)的抑菌特性分析進(jìn)行拮抗菌的拮抗特性研究；通過(guò)接種小麥穗和小麥籽粒試驗(yàn)驗(yàn)證拮抗菌對(duì)小麥赤霉病的防治效果及對(duì)DON毒素的抑制作用，以期從小麥根際土壤中分離對(duì)小麥赤霉病菌具有拮抗作用的生防菌株，為防控小麥赤霉病和DON毒素污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥根際土壤分別采自河南省鄭州市西郊（東經(jīng)113°27＇53.2″，北緯34°49＇18.0″）、濮陽(yáng)市南樂(lè)縣（東經(jīng)115°5＇41.8″，北緯36°8＇9.0″）和商丘市柘城縣（東經(jīng)115°19＇58.8″，北緯34°7＇25.9″）等地，鄭州的土壤為褐土，濮陽(yáng)和商丘的土壤為潮土，連續(xù)多年種植小麥，赤霉病害偶有發(fā)生。禾谷鐮刀菌野生型菌株P(guān)H-1由福建農(nóng)林大學(xué)病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大腸桿菌菌株DH5α由河南工業(yè)大學(xué)糧油食品微生物危害防控創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室保存；小麥購(gòu)買(mǎi)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌的分離鑒定

1.2.1.1 禾谷鐮刀菌菌絲及其孢子培養(yǎng) 將保存在-80 ℃冰箱中的菌株P(guān)H-1活化，取菌落邊緣的菌絲塊接種到CM固體培養(yǎng)基（蔗糖10.0 g/L、酸水解干酪素6.0 g/L、酵母粉6.0 g/L、瓊脂粉20.0 g/L）中，28 ℃培養(yǎng)3 d，用于抑菌試驗(yàn)；菌絲接種到CMC培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉16.0 g/L、硝酸銨1.0 g/L、磷酸二氫鉀1.0 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、酵母粉1.0 g/L）中，28 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)3 d，過(guò)濾收集孢子，將孢子濃度調(diào)節(jié)為1×106CFU/mL，用于拮抗菌篩選及對(duì)孢子萌發(fā)、DON毒素合成的影響等試驗(yàn)。

1.2.1.2 拮抗菌的分離與篩選 將采集的小麥根際土壤采用梯度稀釋法依次制備10-3、10-4和10-5稀釋度的懸液，將不同稀釋度的懸液100 μL涂布在LB培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，挑取顏色、形態(tài)不同的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化、保存。進(jìn)一步對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行抑制試驗(yàn)：在距離CM培養(yǎng)基平板中心2 cm處接種待測(cè)細(xì)菌的菌液，28 ℃培養(yǎng)1 d后，將菌株P(guān)H-1的菌絲塊接種在培養(yǎng)皿中心，28 ℃培養(yǎng)4 d后觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，有抑菌圈出現(xiàn)的為拮抗菌，測(cè)量其抑菌圈直徑（周清等，2019）。

1.2.1.3 拮抗菌鑒定 將拮抗菌在LB培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)1 d，觀察其菌落特征；對(duì)拮抗菌進(jìn)行革蘭染色，觀察其個(gè)體細(xì)胞形態(tài)和顏色；對(duì)拮抗菌進(jìn)行生理生化特性分析（東秀珠和蔡妙英，2001）。為明確拮抗菌株的屬種，以DNA為模板，擴(kuò)增菌株的16S rDNA 序列并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)出的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用MEGA 7.0基于16S rDNA構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)；同時(shí)擴(kuò)增脂肽合成基因以鑒定拮抗物質(zhì)的特性，所需引物序列參考陳亮等（2017）的方法。16S rDNA和抗菌脂肽基因的PCR擴(kuò)增體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，2×RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：（1）擴(kuò)增16S rDNA序列的程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。（2）擴(kuò)增抗菌脂肽相關(guān)基因的程序：表面活性素基因（sfp）、豐原素基因（fenB）和伊枯草菌素基因（ituD）擴(kuò)增的退火溫度分別為47、57和46 ℃，其他擴(kuò)增條件與16S rDNA序列擴(kuò)增的程序相同。

1.2.2 拮抗菌的拮抗特性測(cè)定

1.2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)拮抗菌生長(zhǎng)的影響 將過(guò)夜培養(yǎng)的拮抗菌發(fā)酵液按5%的接種量分別接種到含有100 mL CM、LB和PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)，0～24 h內(nèi)每2 h取樣，此后每12 h取樣，測(cè)定拮抗菌的OD600，觀察不同培養(yǎng)基中拮抗菌的生長(zhǎng)情況，找出最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.2.2 拮抗菌中抑菌物質(zhì)的定位 將過(guò)夜培養(yǎng)的拮抗菌發(fā)酵液接種于100 mL CM液體培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵10 h，收集發(fā)酵液進(jìn)行離心，上清液用0.22 μm濾膜抽濾后獲得無(wú)菌上清液；離心后的沉淀通過(guò)無(wú)菌PBS洗滌2次，超聲破碎30 min，12000 r/min離心25 min，取上清即為菌體破碎液。將菌株P(guān)H-1菌落最邊緣的菌絲塊接種在CM培養(yǎng)基中心，在距離平板中心2 cm處用打孔器打孔并棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，在孔內(nèi)分別加入150 μL不同濃度的無(wú)菌上清液或菌體破碎液，以無(wú)菌水為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)箱中靜置3 d，觀察拮抗效果（何露，2019）。

1.2.2.3 拮抗菌無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 向融化并晾至55 ℃左右的100 mL CM固體培養(yǎng)基中分別加入4、8和16 mL無(wú)菌上清液，不加無(wú)菌上清液的CM培養(yǎng)基作對(duì)照，充分混勻后倒平板。在培養(yǎng)皿中央接種菌株P(guān)H-1的菌絲，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)和生長(zhǎng)變化。分別將0.8、1.6和8.0 mL拮抗菌的無(wú)菌上清液加入到CM液體培養(yǎng)基（蔗糖10.0 g/L、酸水解干酪素6.0 g/L、酵母粉6.0 g/L）至總體積為16 mL，以不加無(wú)菌上清液的CM液體培養(yǎng)基為對(duì)照，于25 ℃下180 r/min 搖床培養(yǎng)，24 h時(shí)觀察并記錄菌株P(guān)H-1孢子的萌發(fā)情況。

1.2.2.4 拮抗菌無(wú)菌上清液及其粗提蛋白的穩(wěn)定性分析 無(wú)菌上清液的穩(wěn)定性用溫度、酸、堿處理進(jìn)行分析，參考朱明杰（2013）的方法，略有改動(dòng)。將無(wú)菌上清液分別在40、50、60、70、80、90和100 ℃條件下處理30 min，以25 ℃下的無(wú)菌上清液為對(duì)照；取無(wú)菌上清液分別調(diào)節(jié)pH為3、4、5、6、7、8、9、10和11，處理24 h后再調(diào)節(jié)pH至中性條件；測(cè)定各種處理后的無(wú)菌上清液對(duì)菌株P(guān)H-1菌絲生長(zhǎng)的抑制率。無(wú)菌上清液中的蛋白粗提液通過(guò)硫酸銨沉淀法制備，操作流程參考何露（2019）的方法，將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K分別加入蛋白粗提液中，使其終濃度為1 mg/mL，37 ℃處理2 h，然后通過(guò)平板對(duì)峙抑菌試驗(yàn)分析粗提蛋白對(duì)3種酶的敏感特性。

1.2.2.5 拮抗菌無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌DON毒素的影響 滅菌后的50 g小麥中分別加入不同濃度無(wú)菌上清液，加無(wú)菌水為對(duì)照，然后接種菌株P(guān)H-1孢子液，28 ℃靜置培養(yǎng)，21 d時(shí)測(cè)定小麥中的DON毒素，每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，分析無(wú)菌上清液對(duì)DON毒素的影響，具體操作參考孟瑤等（2019）的方法。

1.2.3 拮抗菌對(duì)小麥赤霉病的防治效果及對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響

1.2.3.1 拮抗菌無(wú)菌上清液對(duì)小麥赤霉病的防治效果 用菌株P(guān)H-1孢子液（濃度為1×105CFU/mL）和拮抗菌發(fā)酵后的無(wú)菌上清液制備接種液，調(diào)節(jié)無(wú)菌上清液的濃度分別為25%、50%和100%，以無(wú)菌水為對(duì)照，向揚(yáng)花初期的小麥穗中接種，具體操作和結(jié)果分析參考武愛(ài)波（2005）的方法，分析拮抗菌的無(wú)菌上清液對(duì)小麥赤霉病的防控效果。

1.2.3.2 拮抗菌無(wú)菌上清液對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響用2%次氯酸鈉對(duì)小麥進(jìn)行表面消毒，再使用無(wú)菌水洗滌3次后轉(zhuǎn)移至玻璃杯中，濕紗布進(jìn)行保溫培養(yǎng)至小麥種子露白，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的種子用拮抗菌發(fā)酵液的無(wú)菌上清液處理24 h，無(wú)菌水、無(wú)菌CM培養(yǎng)基處理為對(duì)照，將處理過(guò)的小麥種子栽種于花盆中，22 ℃溫室中培養(yǎng)21 d，觀察小麥生長(zhǎng)情況，測(cè)定小麥莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)和濕重。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 20進(jìn)行單因素方差分析和配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，使用Prism 8制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離與篩選結(jié)果

經(jīng)稀釋分離和平板培養(yǎng)分離從采集的多個(gè)小麥根際土壤樣本中分離得到800多株細(xì)菌，經(jīng)對(duì)峙法抗菌檢測(cè)獲得5株禾谷鐮刀菌的拮抗菌；通過(guò)進(jìn)一步的抗菌比較，發(fā)現(xiàn)5株菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果存在差異（表1），其中以菌株XW-10的抑菌圈直徑最大，拮抗效果最好（圖1）。后續(xù)試驗(yàn)選擇菌株XW-10進(jìn)行拮抗特性研究。

圖1 菌株XW-10對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effect of strain XW-10 on F.graminearum

表1 拮抗菌對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗活力Table 1 Antagonistic activity of antagonistic bacterial strains against F.graminearum

2.2 拮抗菌XW-10鑒定結(jié)果

拮抗菌XW-10在LB培養(yǎng)基上菌落呈白色，不透明，表面較干糙，為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，能產(chǎn)生芽孢（圖2）。對(duì)拮抗菌進(jìn)行細(xì)菌學(xué)生理生化特性分析顯示，接觸酶、甘露醇、木糖、檸檬酸鹽、淀粉水解、VP試驗(yàn)、葡萄糖、L-阿拉伯糖、酪蛋白水解和明膠液化等試驗(yàn)均為陽(yáng)性，50 ℃生長(zhǎng)、pH 5.7生長(zhǎng)、7%氯化鈉生長(zhǎng)等為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陰性，生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌相符。進(jìn)一步對(duì)拮抗菌進(jìn)行分子生物學(xué)分析，16S rDNA克隆測(cè)序表明，其片段長(zhǎng)度為1449 bp（GenBank序列號(hào)：ON326557.1），經(jīng)NCBI比對(duì)獲得與其同源性較高的菌株，利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）顯示，拮抗菌XW-10的16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）位于同一分支，相似性達(dá)100%，其他各分支的相似性均較低?；谵卓咕男螒B(tài)特征、生化特性和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定拮抗菌XW-10為解淀粉芽孢桿菌。在該菌中擴(kuò)增抗菌脂肽合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，結(jié)果（圖4）顯示，可在菌株中擴(kuò)增出1400 bp的fenB基因、1100 bp的sfp基因和1203 bp的ituD基因片段，表明拮抗菌XW-10具有合成抗菌脂肽的能力。

圖2 菌株XW-10的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain XW-10

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株XW-10系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain XW-10 based on 16S rDNA sequences

圖4 抗菌脂肽合成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of genes related to antagonistic lipopeptide synthesis

2.3 拮抗菌XW-10在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

分析拮抗菌在CM、LB和PDA等不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果（圖5）顯示，拮抗菌在CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h時(shí)，菌液的OD600達(dá)最大，為1.91，細(xì)胞數(shù)目達(dá)最多，此后至48 h無(wú)明顯變化；在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時(shí)雖然也能達(dá)到與CM培養(yǎng)基中同樣的OD600，但時(shí)間較長(zhǎng)；在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h時(shí)OD600達(dá)最高，但仍低于其他培養(yǎng)基，因此，在CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～48 h為拮抗菌發(fā)酵的最佳時(shí)期。

圖5 拮抗菌XW-10在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth of antagonistic bacterium XW-10 in different media

2.4 拮抗菌XW-10發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響

分析拮抗菌XW-10的不同濃度發(fā)酵液對(duì)菌株P(guān)H-1生長(zhǎng)的抑制情況，結(jié)果（圖6）顯示，菌株XW-10的發(fā)酵液濃度越高，菌株P(guān)H-1菌絲生長(zhǎng)越慢，加入16%菌株XW-10發(fā)酵液時(shí)抑制率達(dá)45.00%。

圖6 拮抗菌XW-10發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌PH-1菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of antagonistic bacterium XW-10 fermentation broth on mycelium growth of F.graminearum PH-1

2.5 拮抗菌XW-10拮抗物質(zhì)的定位與拮抗作用測(cè)定結(jié)果

為進(jìn)一步明確拮抗菌的拮抗物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外存在的情況，將拮抗菌XW-10發(fā)酵后的無(wú)菌上清液和菌體破碎液進(jìn)行抑菌分析，結(jié)果（圖7）顯示，拮抗菌的無(wú)菌上清液可顯著抑制禾谷鐮刀菌PH-1菌絲的生長(zhǎng)，而菌體破碎液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯的抑制作用，表明拮抗菌的拮抗物質(zhì)主要分泌在細(xì)胞外，即在發(fā)酵上清液中。顯微鏡下觀察拮抗菌對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響，結(jié)果（圖8）顯示，培養(yǎng)基中不加拮抗菌的無(wú)菌上清液時(shí)，禾谷鐮刀菌的菌絲呈現(xiàn)長(zhǎng)而直的形態(tài)，生長(zhǎng)方向有序，分支均勻；但培養(yǎng)基中加有拮抗菌的無(wú)菌上清液時(shí)，禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)出現(xiàn)畸形，菌絲分支增多，菌絲中間出現(xiàn)“蓮藕狀”的節(jié)點(diǎn)，顯示拮抗菌的無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和菌絲形態(tài)均有顯著影響。分析不同濃度的拮抗菌無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果（圖9、圖10）顯示，在培養(yǎng)24 h時(shí)，未用拮抗菌的無(wú)菌上清液處理禾谷鐮刀菌的孢子全部萌發(fā)；用不同濃度的拮抗菌無(wú)菌上清液處理禾谷鐮刀菌的孢子時(shí)，孢子萌發(fā)受到影響，隨無(wú)菌上清液濃度的增加，孢子萌發(fā)率下降，在無(wú)菌上清液濃度為100%時(shí)，禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)被完全抑制。

圖8 拮抗菌XW-10的無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響Fig.8 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on F.graminearum mycelial morphology

圖9 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.9 Inhibition effect of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on F.graminearum spore germination

圖10 拮抗菌XW-10的無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響Fig.10 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on F.graminearum spore germination

2.6 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

為明確拮抗菌XW-10發(fā)酵無(wú)菌上清液的穩(wěn)定性，進(jìn)一步分析不同溫度和pH處理對(duì)拮抗菌的無(wú)菌上清液拮抗活性的影響，結(jié)果（圖11）顯示，在低于90 ℃處理時(shí)，拮抗菌的無(wú)菌上清液對(duì)菌株P(guān)H-1菌絲生長(zhǎng)的抑制效果未受溫度的影響，經(jīng)100 ℃處理后則完全喪失抑菌活性。將拮抗菌的無(wú)菌上清液經(jīng)過(guò)酸或堿處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果（圖12）顯示，在pH為7時(shí)，拮抗菌的無(wú)菌上清液對(duì)菌株P(guān)H-1菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高，達(dá)48.38%，pH＜4或pH＞8時(shí)抑菌活性明顯下降。穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明，拮抗菌的無(wú)菌上清液在100 ℃時(shí)失活，拮抗物質(zhì)適合在pH為中性條件下發(fā)揮抑菌作用。

圖11 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)溫度的敏感性Fig.11 Sensitivity of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant to temperature

圖12 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)pH的敏感性Fig.12 Sensitivity of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant to pH

2.7 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液的粗提蛋白對(duì)蛋白酶的敏感特性

通過(guò)硫酸銨沉淀法提取拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液中的粗蛋白并經(jīng)過(guò)不同酶處理，分析粗蛋白對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用。與對(duì)照相比，拮抗菌XW-10蛋白粗提液對(duì)禾谷鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用；粗提蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K處理后對(duì)禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)的抑制效果與未處理的粗蛋白基本一致，說(shuō)明拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液中的粗蛋白對(duì)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K均不敏感（圖13）。

圖13 拮抗菌XW-10粗提蛋白對(duì)3種酶的敏感性Fig.13 Sensitivity of crude antagonistic bacterium XW-10 protein to three enzymes

2.8 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌DON毒素積累的影響

為解析拮抗菌對(duì)禾谷鐮刀菌DON毒素積累的影響，將禾谷鐮刀菌的孢子液和不同濃度的拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液同時(shí)加入到小麥基質(zhì)培養(yǎng)基中，21 d時(shí)測(cè)定小麥基質(zhì)中DON毒素含量，結(jié)果（圖14）顯示，不加拮抗菌無(wú)菌上清液的小麥中DON毒素含量達(dá)2316.5 μg/kg，而添加拮抗菌無(wú)菌上清液比例分別為30%和50%時(shí)，小麥中DON毒素濃度分別為540.9和96.0 μg/kg，比對(duì)照組分別下降92%和94%；全部為拮抗菌無(wú)菌上清液時(shí)，產(chǎn)生的毒素僅為50.2 μg/kg，表明拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液顯著降低了DON毒素在小麥基質(zhì)中的含量。

圖14 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)小麥基質(zhì)中DON毒素合成的影響Fig.14 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on DON toxin synthesis in wheat matrix

2.9 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)小麥的促生長(zhǎng)特性和對(duì)小麥赤霉病的防控效果

進(jìn)一步通過(guò)盆栽試驗(yàn)分析菌株XW-10對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照組相比，用拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液處理的小麥生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)較好，小麥的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、濕重均顯著增加（P＜0.05）（圖15和表2），表明拮抗菌XW-10具有促進(jìn)小麥苗生長(zhǎng)的作用。將菌株P(guān)H-1孢子液接種到揚(yáng)花期的小麥穗上，測(cè)驗(yàn)拮抗菌對(duì)小麥赤霉病的防病效果，結(jié)果（圖16）顯示，對(duì)照組小麥籽粒染病粒率超過(guò)95%，將麥穗分別用25%、50%和100%濃度的菌株XW-10發(fā)酵無(wú)菌上清液噴霧處理后再接種病菌，可觀察到發(fā)病籽粒數(shù)目明顯減少，噴霧100%發(fā)酵上清液的相對(duì)防效達(dá)51%，說(shuō)明菌株XW-10發(fā)酵上清液對(duì)小麥赤霉病具有明顯的防治效果。

圖16 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)小麥赤霉病的防控效果Fig.16 Prevention and control effect of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on wheat scrab

表2 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)小麥幼苗基本生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on basic growth of wheat seedlings

圖15 拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響Fig.15 Effects of antagonistic bacterium XW-10 cell-free supernatant on wheat growth

3 討論

生物防治具有次生危害小、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，可減少化學(xué)農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生耐藥性等當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的突出問(wèn)題（Zhou et al.，2021），已成為農(nóng)作物病蟲(chóng)害防控發(fā)展的方向。國(guó)內(nèi)外有許多學(xué)者投入了農(nóng)業(yè)病害拮抗微生物的研究，在菌株篩選、拮抗物質(zhì)分離及作用機(jī)理解析等方面有許多新發(fā)現(xiàn)，并在不斷豐富農(nóng)業(yè)病害生物防治的知識(shí)庫(kù)。本研究分離的菌株XW-10經(jīng)16S rDNA和細(xì)菌學(xué)生理生化分析鑒定，確定為解淀粉芽孢桿菌，這是一類作物栽培土壤中常見(jiàn)的細(xì)菌。盡管該菌與已報(bào)道的拮抗菌在生物分類上隸屬于同一種群，但從不同環(huán)境分離的菌株可能具有不同的抑菌活性。王軍華等（2006）報(bào)道的解淀粉芽孢桿菌Q-12也分離自土壤，研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可抑制鐮刀菌、曲霉、青霉等多種能引起食品腐敗的病原菌生長(zhǎng)，有很好的作為食品防腐劑的潛力；Fan等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌FZB42除次生代謝產(chǎn)物外，揮發(fā)性有機(jī)化合物在生物和非生物脅迫下均對(duì)作物病害有防控效果，并且具有廣譜抗性，對(duì)小麥、草莓、生菜和馬鈴薯等多種植物病害均具有明顯的防治效果。因此，在已有研究的基礎(chǔ)上開(kāi)展新分離的解淀粉芽孢桿菌的生物學(xué)特性分析及作物病害防控研究可進(jìn)一步挖掘其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究分離的拮抗菌XW-10經(jīng)PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)含有fenB、sfp和ituD等與抗菌脂肽合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，因而具有合成抗菌脂肽的潛在能力。研究發(fā)現(xiàn)，菌株XW-10在胞外產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，因而有效成分主要在發(fā)酵上清液中，這一結(jié)果與張寶（2014）、葉景文（2017）等多數(shù)研究解淀粉芽孢桿菌拮抗作用的報(bào)道相同。本研究利用拮抗菌XW-10無(wú)菌上清液對(duì)禾谷鐮刀菌進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)拮抗菌無(wú)菌上清液可使鐮刀菌的菌絲形態(tài)發(fā)生明顯畸變，孢子萌發(fā)率下降，與胡元森等（2013）報(bào)道的拮抗菌株Jc-07發(fā)酵濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用相同。本研究也發(fā)現(xiàn)拮抗菌的無(wú)菌上清液中具有抑菌作用的可能是某種蛋白，對(duì)該抑菌物質(zhì)的分離純化及抑制機(jī)理研究有待進(jìn)一步開(kāi)展。

作物病害防控最終的目標(biāo)是在田間開(kāi)展應(yīng)用，這對(duì)生防菌劑提出了較高要求，不僅需要保證菌劑對(duì)種植作物生長(zhǎng)不產(chǎn)生有害影響（Huang et al.，2016；周清等，2019），還要求菌劑具有良好的穩(wěn)定性和對(duì)不良環(huán)境的較強(qiáng)抗性（周鵬，2014；Palazzini et al.，2016；Awla et al.，2017）。通過(guò)小麥苗種植試驗(yàn)表明，菌株XW-10及其代謝產(chǎn)物對(duì)小麥苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，呈現(xiàn)了該菌的良好應(yīng)用潛質(zhì)。拮抗菌對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用與很多因素有關(guān)，如產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)吲哚乙酸、解磷作用、固氮作用、拮抗作用等。周清等（2019）從小麥根際土壤分離出一株奇異變形桿菌DY05，馬莉敏（2021）從芳香植物百里香根部分離出內(nèi)生菌銅綠假單胞菌XBLGC3，這2種不同的菌株不但對(duì)禾谷鐮刀菌有顯著的拮抗作用，而且均能產(chǎn)生鐵載體和吲哚乙酸，對(duì)小麥的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。本研究分離獲得的拮抗菌XW-10對(duì)小麥促生長(zhǎng)的機(jī)制有待深入研究，但拮抗菌在控制病原菌的同時(shí)可促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性為拮抗菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

在有效成分的穩(wěn)定性方面，解淀粉芽孢桿菌具有芽孢桿菌本身固有的抗熱特性，菌株XW-10無(wú)菌上清液對(duì)90 ℃以下的高溫均有良好的穩(wěn)定性，這些特性對(duì)于實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。我國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)赤霉病主要發(fā)生在5月份前后的小麥揚(yáng)花期或乳熟期，該時(shí)期氣溫已逐漸升高，在強(qiáng)烈的陽(yáng)光輻射下田間的溫度更高，如果將發(fā)酵液直接在田間噴灑進(jìn)行生防處理，則有效成分的耐熱性成為直接影響作用效果的關(guān)鍵因素。如果需要將生防物質(zhì)商品化，為了便于儲(chǔ)藏、運(yùn)輸，通常可通過(guò)濃縮、添加載體等處理制成粉劑，在這些后處理環(huán)節(jié)，發(fā)酵液的加工工藝過(guò)程均對(duì)菌體及其有效成分的抗熱性和穩(wěn)定性提出較高要求。

4 結(jié)論

本研究從小麥根際土壤中分離獲得的菌株XW-10經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，在發(fā)酵無(wú)菌上清液中具有可抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)和DON毒素產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)；拮抗菌XW-10發(fā)酵無(wú)菌上清液對(duì)小麥苗生長(zhǎng)有益，可明顯減少麥穗中的赤霉病粒比例；產(chǎn)生的拮抗有效物質(zhì)屬于蛋白類化合物，其活性不被常規(guī)蛋白酶鈍化，穩(wěn)定性和耐熱性良好，具有作為小麥赤霉病生防菌劑的潛質(zhì)。