李星雨，徐筱瑩，雷秋琪，易陽,3，王宏勛,3，王麗梅,3*

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，武漢 430023；2.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023；3.湖北省生鮮食品工程技術研究中心，武漢 430023)

雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines，HAAs)是一種高度致癌、致突變的有害物質[1-2]，易在魚類和家禽類等富含蛋白質的動物組織高溫烹飪過程中生成[3]，是一類由碳、氫和氮3種原子組成，并通過美拉德反應與自由基機制生成的芳香族化合物[4]。最初是在經過明火煎烤或油炸處理后的魚類和家禽類肉制品中被檢測到，之后又在經高溫處理過的高蛋白質食物中逐漸發(fā)現(xiàn)了20多種雜環(huán)胺[5]。人們通過食用這些含有雜環(huán)胺的食物，在體內積累有害物質，從而導致各種疾病的出現(xiàn)[6-7]。

香辛料是天然食用植物香料的統(tǒng)稱，是一種天然的植物源防腐劑，可從植物的果實、花瓣、葉和根莖等組織獲取，具有濃烈的芳香味和辛香味[8]。它是天然植物類的調味品，具有香、辛、甜、麻、苦、辣等多種氣味[9]。天然香辛料在肉制品加工過程中經常被使用，經研究證明其不僅可以使肉制品具有特征風味，還對肉制品加工過程中雜環(huán)胺的生成有重要影響[10]。香辛料的主要功能性組分為酚類、辛辣味物質和精油等。酚類物質具有良好的抗氧化活性；辛辣型香辛料中的辛辣味成分大多為酰胺類物質，如辣椒素和胡椒堿等[11-13]，辣椒素可以促進脂肪的氧化，增加能量的釋放[14]，具有較好的降血脂、降肝脂作用[15]，胡椒堿可降低人體內血液中膽固醇和脂肪含量，還有抗驚厥[16]、抗癌[17]的作用；精油具有良好的抑菌效果[18]；香辛料中還包含脂肪族化合物，如肉桂醛，對于調節(jié)肉制品的風味具有重要影響[19]。丁香酚、肉桂醛、胡椒堿、桉油精分別為丁香、桂皮、黑胡椒和草果中的主效成分[20-21]。根據(jù)實驗室前期研究結果[22]，選取丁香、桂皮、花椒、草果、黑胡椒5種抗氧化活性好的香辛料和其主效成分(肉桂醛、丁香酚、桉油精、胡椒堿)，采用HPLC法對豬肉的煎制條件和雜環(huán)胺的提取條件進行優(yōu)化，并對添加香辛料及其主效成分的煎制豬肉中雜環(huán)胺進行檢測，考察5種香辛料和主效成分對雜環(huán)胺的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

豬肉(長約6 cm、寬約5 cm、厚約5 cm的里脊肉)：購于武商量販超市，肥肉較少；5種香辛料丁香、桂皮、花椒、草果、黑胡椒：均購于武漢舵落口香料市場；5種香辛料主效成分辣椒素、肉桂醛、丁香酚、桉油精、胡椒堿：均購于上海源葉公司；9種雜環(huán)胺標準品9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Norharman)、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚(Harman)、3-氨基-1，4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(Trp-p-1)、2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹啉(IQ)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(MeIQ)、2-氨基-1-甲基-6苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(PhIP)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,8-DiMeIQx)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(MeIQx)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(4,7,8-TriMeIQx)：均購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；Oasis 3cc MCX(60 mg)固相萃取柱：購于廈門艾普銳公司；ZORBAX SB-C18色譜柱：購于上海生析公司；冰醋酸、甲醇、乙腈：均為色譜純；氨水、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、醋酸銨等：購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SB-5200DTN超聲波清洗器、XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；A360紫外可見分光光度計 翱藝儀器(上海)有限公司；AR2140電子分析天平 奧斯特儀器有限公司；TG18M高速離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；Milli-Q Academic去離子純水機 美國Millipore公司；BSA223S分析天平 德國Sartorius公司；MF-06多功能電鍋煲 德國德朗公司；EVA50氮吹儀 北京綠綿巨貿公司；Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC檢測條件的建立

參考姚瑤[23]的方法并稍作修改，配制5種雜環(huán)胺的標準溶液，按照質量濃度由低到高進樣，繪制標準曲線。

HPLC色譜檢測條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL/min；進樣量A：20 μL；柱溫：30 ℃；采用二元流動相體系：流動相為乙腈，流動相B為0.05 mol/L 醋酸-醋酸胺緩沖液(pH 3.6)；4,7,8-DiMeIQx、MeIQx、MeIQ和IQ通過紫外檢測器在263 nm波長激發(fā)下檢測。熒光檢測器根據(jù)所檢測雜環(huán)胺的保留時間進行編程。

流動相梯度及熒光檢測器的波長見表1。

表1 流動相梯度及熒光檢測器的波長Table 1 The mobile phase gradient and fluorescence detector wavelength

1.3.2 煎制豬肉中雜環(huán)胺的提取純化

采用鹽酸法[24-25]分離提取雜環(huán)胺，稍作修改。準確稱取20.00 g里脊肉，使用模具將肉塊制為肉餅，取單恬恬等提取的丁香、桂皮、花椒、草果和黑胡椒水提物，梯度稀釋為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%(W/W)，加入到豬肉餅中進行腌制，每面各1 h，以空白加水腌制的豬肉餅作為對照組。將腌制好的豬肉餅放入煎鍋中，在220 ℃下每面煎制3 min后取出。取煎制豬肉樣品4 g(精確到0.01 g)剪碎后于50 mL離心管中，加入甲醇∶0.1 mol/L鹽酸(1∶4)提取液25 mL，用均質器均質(15 s×4次)之后，室溫下超聲提取15 min。取出離心管，在轉速4000 r/min下離心10 min；取上清液，加入5%三氯乙酸沉淀蛋白質，過濾后離心，取上清液，并用4 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至3.0。

固相萃取柱預先依次用6 mL甲醇、0.1 mol/L鹽酸、超純水活化；再加入樣品，加入上述相同的溶液除雜，棄去流出液；加入甲醇∶氨水為95∶5(體積比)的6 mL溶液洗脫出雜環(huán)胺，用氮吹儀吹干洗脫液，加入0.5 mL甲醇復溶，并用0.22 μm的尼龍針孔濾器過濾，轉入高效液相色譜進樣瓶中，進行高效液相色譜檢測。從檢測結果中選取雜環(huán)胺抑制效果較好的香辛料，將其主效成分以濃度梯度 0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%進行腌制，并按照相同的方法處理后進行雜環(huán)胺的測定。

1.3.3 雜環(huán)胺提取條件優(yōu)化

分別考察25 mL的 0.1 mol/L鹽酸、0.15 mol/L鹽酸、0.2 mol/L鹽酸、甲醇∶0.1 mol/L鹽酸(1∶4，V/V)、甲醇∶0.15 mol/L鹽酸(1∶4，V/V)、甲醇∶0.2 mol/L鹽酸(1∶4，V/V)6種不同的提取液對煎制豬肉樣品中雜環(huán)胺的提取效果，通過比較雜環(huán)胺的檢出種類和檢出總量選取雜環(huán)胺提取效果最好的溶劑。

1.3.4 豬肉煎制條件優(yōu)化

實驗考察在220 ℃下煎制2，4，6，8，10 min(雙面煎制)5個時間，180，200，220，240 ℃ 4個溫度下煎制6 min對雜環(huán)胺生成量的影響，通過比較其失重率、雜環(huán)胺生成量，觀察肉質品表面以及肉質成熟程度來確定豬肉煎制的最佳時間和最佳溫度。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑對雜環(huán)胺檢測的影響

由表2可知，6種提取液的雜環(huán)胺提取效果有顯著差異(P<0.05)。利用0.2 mol/L 鹽酸提取液提取僅檢測出4,8-DiMeIQx 1種雜環(huán)胺，但雜環(huán)胺總量比檢測出3種雜環(huán)胺的0.15 mol/L 鹽酸提取液要高。0.15 mol/L 鹽酸∶甲醇(1∶4)和0.2 mol/L 鹽酸∶甲醇(1∶4)均檢出4種雜環(huán)胺，雜環(huán)胺總量分別為82.74，97.04 ng/g。0.1 mol/L 鹽酸∶甲醇(1∶4)可檢測出MeIQx、4,8-DiMeIQx、PhIP、Norharman和Harman 5種雜環(huán)胺，檢出的雜環(huán)胺總量達到115.71 ng/g。因此，選用0.1 mol/L 鹽酸∶甲醇為1∶4作為雜環(huán)胺的提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對煎制豬肉中雜環(huán)胺檢測的影響 Table 2 The effects of different extraction solvents on the detection of HAAs in fried pork

2.2 煎制條件對煎制豬肉中雜環(huán)胺生成的影響

2.2.1 煎制時間對雜環(huán)胺生成的影響

由表3可知，隨著煎制時間的增加，煎制豬肉中雜環(huán)胺的種類及含量有顯著變化(P<0.05)。在溫度相同的條件下，雜環(huán)胺總量在逐漸增加，從8.79 ng/g增加至122.82 ng/g，失重率也逐漸變高，從18.34%增加至61.23%。煎制時間為2 min時，肉品表面還有紅色血水，雜環(huán)胺總量小于10.00 ng/g；煎制時間為6 min時，豬肉已煎熟，表面略有焦黃色，肉質較為柔軟，失重率為42.43%，符合平時家中食用豬肉的質感，雜環(huán)胺總量為118.35 ng/g；煎制時間為10 min時，失重率高達61.23%，肉質很硬，肉品表面干澀，且有大量焦黑物質，雜環(huán)胺生成量最高，為122.82 ng/g。根據(jù)綜合評價，選擇煎制6 min(雙面煎制)為最佳時間，既滿足豬肉餅日常煎制感官、食用要求，又使得雜環(huán)胺總量不至于過高。

表3 煎制時間對煎制豬肉的失重率和雜環(huán)胺總量的影響Table 3 The effects of frying time on weight loss rate and total amount of HAAs in fried pork

續(xù) 表

2.2.2 煎制溫度對雜環(huán)胺生成的影響

由表4可知，在煎制時間相同的條件下，均檢測出MeIQx、4,8-DiMeIQx、Norharman、MeIQ和PhIP 5種雜環(huán)胺。且隨著溫度的升高，雜環(huán)胺的總量有顯著的增加(P<0.05)，從78.00 ng/g增加至103.03 ng/g。在4個溫度下煎制6 min，豬肉樣品均已煎熟，200 ℃與180 ℃相比較，表面略多些焦黃物質，雜環(huán)胺總量相差不大；當溫度升至220 ℃時肉品表面略有焦黑，肉質柔軟，MeIQ、MeIQx 和 PhIP均有顯著增加(P<0.05)，分別為67.17，24.52，2.64 ng/g，檢出的雜環(huán)胺總量為 97.80 ng/g；溫度為240 ℃時，肉品表面存在大量焦黑物質，且雜環(huán)胺總量最高，達到103.03 ng/g。但家庭日常使用煎制溫度并未達到240 ℃，因此煎制溫度選用220 ℃，肉品感官較好。夏新武[26]研究發(fā)現(xiàn)烘烤溫度、烘烤時間和牛肉尺寸等加工條件都會顯著影響烘烤的牛肉制品中雜環(huán)胺的含量和種類，并且隨著烘烤時間的增加、烘烤溫度的升高，雜環(huán)胺的含量及種類也會隨之增加，與本實驗結論一致。

表4 煎制溫度對煎制豬肉中雜環(huán)胺總量的影響Table 4 The effects of frying temperature on total amount of HAAs in fried pork

2.3 5種香辛料水提物對煎制豬肉中雜環(huán)胺生成的影響

2.3.1 丁香水提物對雜環(huán)胺生成的影響

由圖1可知，丁香水提物對煎制豬肉中MeIQx無抑制作用，當濃度從0.05%增加至0.15% 時，MeIQx含量從40.21 ng/g升至46.78 ng/g，增加8.74%。隨著濃度的增加，其他4種雜環(huán)胺的抑制率隨之升高。其中對4,8-DiMeIQx和PhIP的抑制作用最為顯著(P<0.05)，抑制率最高可達51.58%和89.35%；對于Harman和Norharman，0.20%濃度的丁香水提物才有顯著的抑制效果。

圖1 丁香水提物對雜環(huán)胺生成的影響Fig.1 The effect of clove water extracts on the production of HAAs

2.3.2 桂皮水提物對雜環(huán)胺生成的影響

由圖2可知，桂皮水提物對煎制豬肉中MeIQx的生成無明顯抑制作用，雜環(huán)胺含量有明顯波動，與濃度無對應關系。對其他4種雜環(huán)胺均具有顯著的抑制效果(P<0.05)，且隨著濃度的增加，抑制率大多也隨之升高。其中桂皮水提物對PhIP和4,8-DiMeIQx的抑制效果最為顯著(P<0.05)，抑制率最高可達100%和72.68%。

圖2 桂皮水提物對雜環(huán)胺生成的影響Fig.2 The effect of cinnamon water extracts on the production of HAAs

2.3.3 花椒水提物對雜環(huán)胺生成的影響

由圖3可知，花椒水提物對Harman、Norharman、PhIP均無明顯抑制效果，曲線平緩，雜環(huán)胺含量無明顯變化。對4,8-DiMeIQx的生成具有顯著的促進作用(P<0.05)，當濃度為0.15%時，相比于空白組，4,8-DiMeIQx含量從48.43 ng/g增加至77.09 ng/g，增加59.18%；對MeIQx的生成有顯著的抑制效果(P<0.05)。當濃度為0.30%時，MeIQx含量從43.02 ng/g降至28.46 ng/g，抑制率為33.85%。

圖3 花椒水提物對雜環(huán)胺生成的影響Fig.3 The effect of Chinese prickly ash water extracts on the production of HAAs

2.3.4 黑胡椒水提物對雜環(huán)胺生成的影響

由圖4可知，黑胡椒水提物僅檢測出煎制豬肉中4種雜環(huán)胺。黑胡椒水提物對MeIQx的生成無明顯抑制作用，且對4,8-DiMeIQx、Harman的抑制效果較弱；對Norharman有顯著的抑制作用(P<0.05)，且隨著濃度的增加，抑制效果越好，當濃度為0.30%時，抑制率高達74.55%。

圖4 黑胡椒水提物對雜環(huán)胺生成的影響Fig.4 The effect of black pepper water extracts on the production of HAAs

2.3.5 草果水提物對雜環(huán)胺生成的影響

由圖5可知，草果水提物僅檢測出煎制豬肉中4種雜環(huán)胺。草果水提物對Norharman有不同程度的促進作用，促進作用最高，為34.29%；對 MeIQx無明顯的抑制作用，僅MeIQx 在濃度為0.30%時有較好的抑制作用，抑制率為22.94%；對4,8-DiMeIQx和Harman的生成有顯著的抑制作用，抑制率最高可達22.94%和53.98%。

圖5 草果水提物對雜環(huán)胺生成的影響Fig.5 The effect of Amomum tsaoko water extracts on the production of HAAs

不同種類的香辛料對雜環(huán)胺有不同的抑制效果。姚瑤等[27]發(fā)現(xiàn)丁香、桂皮、良姜、紅花椒和香葉對醬牛肉中雜環(huán)胺生成的影響具有特異性。邵斌[28]發(fā)現(xiàn)丁香對雞肉中PhIP具有較強的抑制效果，與本實驗結論相似。另外，其他香辛料對雜環(huán)胺也有一定的抑制作用。萬可慧[29]發(fā)現(xiàn)經過八角和花椒處理后的肉制品中檢測出的雜環(huán)胺含量較多，經良姜和桂皮處理后檢測出的雜環(huán)胺相對較少，加入良姜后AαC、Norharman和PhIP的生成量明顯減少。呂美[30]研究香辛料添加濃度為3%時對煎制牛肉餅中雜環(huán)胺生成的影響，發(fā)現(xiàn)對PhIP抑制作用最強的是高良姜，抑制率可達到100%，對Norharman和AαC的抑制率均超過77%，但加入桂皮和陳皮卻促進了PhIP的生成。

2.4 香辛料主效成分對煎制豬肉中雜環(huán)胺生成的影響

2.4.1 丁香酚對雜環(huán)胺生成的影響

由圖6可知，丁香酚對煎制豬肉中的4種雜環(huán)胺均有顯著的抑制效果(P<0.05)，且隨著濃度的升高，雜環(huán)胺的抑制效果越明顯。當濃度從0.01%增加至0.05%時，MeIQx和MeIQ的曲線有顯著的下降趨勢(P<0.05)，抑制效果極佳，升至0.06%時，下降趨于平緩，抑制率分別為64.28%、67.39%。對4,8-DiMeIQx、Norharman均有顯著的抑制效果(P<0.05)，當濃度為0.03%時，下降趨勢明顯，隨著濃度的增加，抑制效果逐漸穩(wěn)定，當濃度為0.05%時，抑制效果最好，對4,8-DiMeIQx和Norharman的抑制率分別為76.96%、89.58%。

圖6 丁香酚對雜環(huán)胺生成的影響Fig.6 The effect of eugenol on the production of HAAs

2.4.2 肉桂醛對雜環(huán)胺生成的影響

由圖7可知，肉桂醛在濃度為0.01%時，對煎制豬肉中MeIQx有顯著抑制效果(P<0.05)，抑制率達到32.11%，在濃度為0.06%時也有一定的抑制效果，抑制率為14.34%，其他濃度抑制效果不明顯。對MeIQ亦有顯著的抑制效果(P<0.05)，當濃度為0.05%時，抑制效果最佳，抑制率為24.40%。檢測出4,8-DiMeIQx、Norharman含量較低，隨著濃度的增加，肉桂醛對其均有促進作用。當濃度為0.06%時，4,8-DiMeIQx、Norharman的含量分別增加50.32%、80.35%，Norharman含量增加了接近1.5倍。

圖7 肉桂醛對雜環(huán)胺生成的影響Fig.7 The effect of cinnamaldehyde on the production of HAAs

2.4.3 胡椒堿對雜環(huán)胺生成的影響

由圖8可知，胡椒堿對4,8-DiMeIQx、Norharman均有顯著的抑制效果(P<0.05)，在濃度為0.05%時，雜環(huán)胺抑制率分別為60.48%、70.15%；對MeIQ也有顯著的抑制效果(P>0.05)，其含量有一定的波動，但有下降的趨勢，當濃度為0.06%時，含量從39.03 ng/g降至31.01 ng/g，抑制率達到20.52%，且每個濃度間有顯著性差異(P<0.05)；在濃度為0.01%時，對煎制豬肉中MeIQx有顯著的抑制效果，含量從12.13 ng/g 降至7.16 ng/g，其他濃度相對于空白組無明顯抑制作用。張夢茹[31]選用了3種辛辣型香辛料(胡椒、花椒和辣椒)及其所含酰胺類特征成分(胡椒堿、花椒麻素和辣椒素)，研究它們對烤牛肉餅中雜環(huán)胺生成的影響，結果顯示胡椒堿在濃度較低時，能有效抑制4,8-DiMeIQx和IQx的生成，但隨著胡椒堿濃度的增加，對雜環(huán)胺的抑制效果會逐漸變弱，與本實驗結論相似。

圖8 胡椒堿對雜環(huán)胺生成的影響Fig.8 The effect of piperine on the production of HAAs

2.4.4 桉油精對雜環(huán)胺生成的影響

由圖9可知，桉油精對煎制豬肉中4種雜環(huán)胺均有顯著的抑制效果(P<0.05)，且大部分濃度越高，對雜環(huán)胺的抑制效果越好，雜環(huán)胺含量有顯著的下降趨勢(P<0.05)。對MeIQx、MeIQ均有顯著的抑制效果，在濃度為0.05%時，抑制效果最佳，含量分別從17.06 ng/g降至11.46 ng/g，從30.44 ng/g降至19.58 ng/g，抑制率分別為32.78%、35.69%。對4,8-DiMeIQx、Norharman均有較好的抑制效果，且在濃度為0.05%時效果最佳，抑制率分別為46.31%、44.10%。

圖9 桉油精對雜環(huán)胺生成的影響Fig.9 The effect of eucalyptol on the production of HAAs

3 結論

實驗優(yōu)化出豬肉煎制的最佳條件為：煎制時間6 min(雙面煎制)、煎制溫度220 ℃，最符合日常生活中的肉制品烹飪條件；雜環(huán)胺提取溶劑為甲醇∶0.1 mol/L鹽酸25 mL(1∶4，V/V)，檢出的雜環(huán)胺總量最高。本實驗的5種香辛料中，丁香水提物及其主效成分的抑制效果最為顯著，丁香水提物對Norharman、4,8-DiMeIQx、Harman、PhIP均有顯著抑制作用，最佳抑制率分別為56.41%、51.58%、50.11%、89.35%；主效成分丁香酚對MeIQx、MeIQ、4,8-DiMeIQx、Norharman的抑制率分別為64.28%、67.39%、76.96%、89.58%，具有良好的開發(fā)前景。香辛料的水提物和其主效成分對煎制豬肉中雜環(huán)胺的形成均有影響，說明香辛料抑制雜環(huán)胺形成的作用與其主效成分有關；但其影響程度不同，說明不完全是主效成分起作用，可能是香辛料中還含有其他可抑制雜環(huán)胺形成的物質或者是眾多組分之間協(xié)同作用，抑制了雜環(huán)胺的生成，同時可以探究多種香辛料同時添加對雜環(huán)胺生成的影響。從研究結果可以得出，在煎制豬肉過程中可考慮添加含有丁香或丁香酚的香辛料。雜環(huán)胺的生成是一個復雜的過程，本文中香辛料的抑制效果與其抗氧化活性基本一致，但雜環(huán)胺的生成不全是由于自由基起作用，為進一步闡明雜環(huán)胺生成的抑制機理，后續(xù)可通過利用化學模型體系，探究香辛料對雜環(huán)胺生成的影響和抑制機制。