張 峰，薛婉茹，陳小明，謝李玲，李 斌，孟 春，郭松斌，謝金棟*，洪 晶*

1. 福建中煙工業(yè)有限責任公司 技術(shù)中心，福建 廈門 361022；2. 福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108

茶葉香氣由各種香氣成分以不同比例組合形成，是決定茶葉品質(zhì)的重要因素之一。茶葉中的香氣成分含量低、組分復雜以及易揮發(fā)等特點，使其不易提取和分離[1]。盡管如此，茶葉中香氣物質(zhì)具有潛在的抗腫瘤和抑菌效果[2]，還可作為香料添加在食品中，因而香氣物質(zhì)的提取與研究具有重要的意義。

鐵觀音是閩南烏龍茶的典型代表，具有獨特的花果香味[3]。有研究表明，不同的茶葉加工工序中，香氣成分的種類和含量也有較大變化，其中殺青葉含有的清香物質(zhì)更多，含水量更低[4-5]，更適宜用作香料研究。不同提取方法也會直接影響香氣成分的定性和定量分析[6]，適宜的鐵觀音殺青葉的提取分離工藝，有利于富集香氣成分，提高得率。相關(guān)研究表明，鐵觀音香氣成分以前體形式存在于茶鮮葉中，其在自身存在的一些關(guān)鍵酶作用下釋放出香氣成分。纖維素酶、果膠酶[7]以及漆酶[8]等可解構(gòu)茶葉細胞壁，大幅度提高有效成分的提取率，多用于速溶茶的加工。因而，外源酶的加入對于香氣物質(zhì)的釋放具有重要的意義。β-半乳糖苷酶[9]和β-櫻草糖苷酶等可將茶葉中的糖苷類前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為香氣成分；同時，有研究表明在茶葉香氣物質(zhì)提取過程中加入外源酶可顯著改善茶葉品質(zhì)[10]。

為了進一步提高鐵觀音殺青葉中香氣物質(zhì)的提取率，降低生產(chǎn)成本，本試驗研究針對鐵觀音殺青葉中香氣成分含量低微及易揮發(fā)等問題，采用先酸解再酶解的方式對鐵觀音殺青葉的增香工藝進行優(yōu)化，通過GC-MS對揮發(fā)性香氣物質(zhì)的成分和含量進行分析和感官評定，為提高鐵觀音殺青葉中揮發(fā)性香氣成分得率提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵觀音春茶茶鮮葉的殺青葉（福建安溪）。檸檬酸、乙醇、氯化鈉，均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；內(nèi)標物：2-辛醇，色譜純（純度99%，阿拉丁試劑有限責任公司）；卷煙（福建中煙工業(yè)有限責任公司七匹狼卷煙）。

Agilent 7890A-5995C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；Supleco固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS），美國Supelco公司；Agilent HP-INNOWAX彈性石英毛細管柱，美國安捷倫公司；SHA-C水浴恒溫震蕩器，國華企業(yè)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 鐵觀音殺青葉加酶酶解

水提法單酶酶解：采用水提法對茶葉進行提取，具體方法為：5.0 g茶樣+100 mL去離子水，調(diào)pH值至5.0 → 加入生物酶 → 放入水浴鍋 50℃水浴震蕩 2 h → 冷卻后過濾 → 濾液定容到100 mL，進行GC-MS檢測。加入的生物酶為α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、漆酶和風味蛋白酶，添加量為0.3%。

水蒸氣蒸餾復合酶酶解：采用水蒸氣蒸餾法對茶葉進行提取，具體方法為：5.0 g茶樣+100 mL去離子水 → 加入檸檬酸調(diào)pH值至3.0→ 放入水浴恒溫震蕩器 50℃水浴 30 min → 冷卻至室溫，將pH值調(diào)至5.0 → 加入復合酶 →放入水浴鍋50℃水浴震蕩2 h →冷卻至室溫，進行水蒸氣蒸餾 → 餾出液定容至100 mL，進行GC-MS檢測，復合酶添加量為0.3%。

1.2.2 GC-MS分析

SPME 萃取頭前處理：取樣前，固相微萃取頭在氣相色譜進樣口于250℃老化30 min。

HS-SPME萃取過程：取提取后樣品6 mL于頂空瓶中，加入 10 μL 2-辛醇（10mg/L）和2.0 g氯化鈉，密封。放入恒溫加熱磁力攪拌器（60℃）平衡15 min，插入已經(jīng)老化的萃取針，頂空吸附45 min，于氣相色譜進樣口處在250℃條件下解析5 min，進行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱，Agilent HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱；進樣口溫度為250℃；升溫程序：初始柱溫40℃，保持5 min，以5℃/min升至240℃，保持 5 min，后運行時間 5 min；載氣，He（純度＞99.999%），柱流量1.0 mL/min；不分流進樣。

MS條件：電離源：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；質(zhì)譜四極桿溫度：150℃；質(zhì)量掃描范圍：35 ～ 450 m/z。

所有試驗均重復三次。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

定性：將GC-MS檢測的物質(zhì)與NIST.11 library 進行相似度匹配、特征峰分析，保留相似度大于70的化合物，并結(jié)合相關(guān)文獻對檢出成分進行定性分析。

定量：以2-辛醇作為內(nèi)標物，利用被測物與內(nèi)標物（2-辛醇）面積比值計算茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量[11]。

統(tǒng)計分析：通過Excel 2016進行統(tǒng)計學分析并使用GraphPad Prism進行顯著性分析和多重比較。

1.2.4 鐵觀音茶香提取物在卷煙中的感官評定

挑選質(zhì)量和吸阻均勻一致的空白參比卷煙樣品，用香精注射儀將鐵觀音殺青物的提取物注入空白卷煙中，每種提取物添加7 μL/支，添加比例為1%，由福建中煙專業(yè)評吸小組進行感官評定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物酶對香氣物質(zhì)提取的影響

為了全面篩選不同的生物酶對鐵觀音殺青葉香氣物質(zhì)提取率的影響，試驗選擇β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、漆酶、風味蛋白酶、纖維素酶和果膠酶對鐵觀音殺青葉進行酶解后水提，并測定不同酶酶解后樣品中香氣物質(zhì)含量變化，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖1可看出，與空白樣品相比，加入β-葡萄糖苷酶后的香氣物質(zhì)含量變化不大；而加入α-半乳糖苷酶后醇類和醛類香氣物質(zhì)有所減少，酯類物質(zhì)增加，總量有所增加，但增量較??；加入風味蛋白酶后香氣物質(zhì)含量反而降低，可能是由于一些香氣物質(zhì)被水解；加入復合酶（纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶）后醇類及酯類物質(zhì)都有所增加，總量也明顯增加（20%）；而加入漆酶后所有種類的揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量都增加，總量也有較大增加（51%）。

圖1 不同生物酶酶解后揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量對比圖Figure 1 Comparison of volatile aroma compounds content after enzymatic hydrolysis by different biological enzymes

苗愛青等用GC-MS與GC/Olfactometry相結(jié)合發(fā)現(xiàn)鐵觀音主要香氣成分是芳樟醇、水楊酸甲酯、己酸-順-3-己烯酯和α-法尼烯[12]；張方舟等分析發(fā)現(xiàn)，鐵觀音的主要香氣成分是橙花叔醇、吲哚、α-法尼烯、苯甲醛、爐紫羅酮、茉莉酮、香葉醇、(Z)-3-己烯酸乙煤、茉莉內(nèi)酯和芳樟醇等[13]； 但在鐵觀音殺青葉中芳樟醇、α-法尼烯、水楊酸甲酯、吲哚、香葉醇、順橙花叔醇、苯乙醛等物質(zhì)含量較高；與鐵觀音茶葉相比，鐵觀音殺青葉的主要香氣物質(zhì)組成類似。

本試驗以鐵觀音殺青葉中的芳樟醇、香葉醇和苯乙醇作為主要香氣物質(zhì)進行增香工藝研究。從圖2可看出，單獨加入α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶以及風味蛋白酶并沒有增加主要香氣物質(zhì)的得率；而加入復合酶（纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶）后，芳樟醇、苯乙醇和香葉醇含量有增加，但增量不大（分別為3%、10%和15%）。加入漆酶后，三種主要的香氣物質(zhì)的得率都有較大幅度的增加（分別為22%、83%和150%）；但漆酶酶解后的樣品較為渾濁，可能是由于所用的漆酶為復合酶，其中所含的氧化酶使樣品發(fā)生氧化而渾濁。

圖2 不同生物酶酶解后主要香氣物質(zhì)含量對比圖Figure 2 Content comparison of main aroma substances after enzymatic hydrolysis by different biological enzymes

2.2 不同生物酶酶解樣品感官品質(zhì)

為了更好地確定不同生物酶酶解樣品中香氣種類及含量的變化對感官品質(zhì)的影響，采用感官評定方法對2.1中的6個樣品進行評吸（表1）。評定結(jié)果認為3#β-葡萄糖苷復合酶和4#α-半乳糖酶各有特點，其酶解后得到的香氣物質(zhì)更適合加入卷煙中。

表1 不同生物酶酶解樣品感官品質(zhì)評定結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of enzymatic hydrolysis samples with different biological enzymes

2.3 復合酶處理對香氣物質(zhì)提取的影響

將不同的生物酶與纖維素酶和果膠酶進行復配，進一步研究復合酶組成對鐵觀音殺青葉香氣物質(zhì)提取的影響。采用水蒸氣蒸餾法提取鐵觀音殺青葉中的香氣成分，結(jié)果如圖3和圖4所示。從揮發(fā)香氣物質(zhì)的種類及含量看，加入α-半乳糖苷酶復合酶后，酯類物質(zhì)增加明顯，其他物質(zhì)略有增加；加入β-葡萄糖苷酶復合酶后，醇類物質(zhì)增加較多；加入漆酶復合酶后，酯類、醛類和酮類物質(zhì)均有增加，醇類物質(zhì)降低，總量增加；加入漆酶和α-半乳糖苷酶復合酶后，兩者相互影響，不能起到效果疊加作用；而加入漆酶和β-葡萄糖苷酶后，所有種類的揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量都有增加，總量也有較大增加，且與單獨加入兩酶相比，復合加入兩酶具有效果增強的作用。

在酸性條件下，茶葉中的前體物質(zhì)更容易釋放出香氣物質(zhì)[14]。為考察加酸加酶工藝對香氣物質(zhì)提取的影響，試驗采用先酸解再加入復合酶酶解以提高鐵觀音殺青葉香氣物質(zhì)的得率。從結(jié)果可看出，先酸解再酶解后，所有類型的香氣物質(zhì)、香氣物質(zhì)總量以及三種主要香氣物質(zhì)（芳樟醇、香葉醇和苯乙醇）含量均有增加（圖3、圖4），香氣總量提升48%，其中醇類物質(zhì)在酸解加酶解復合工藝下增長116%，其中芳樟醇增長61%、香葉醇增長63%、酯類增加59%，還新增了具有強烈甜果仁香氣的α-甲基芐基乙酸酯、有水果香的甲酸己酯和新鮮青草香氣的苯甲酸葉醇酯等物質(zhì)。有研究表明，茶葉中存在著香氣化合物的前體，這些前體在外源酶的作用下釋放出香氣物質(zhì)[14]。在纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶復合酶以及酸解加酶解的作用下，芳樟醇、香葉醇和苯乙醇的含量大幅度增加，說明鐵觀音殺青葉中存在著這些香氣物質(zhì)的前體，經(jīng)過酸解以及酶解的作用，可以釋放出香氣物質(zhì)。試驗處理的香氣物質(zhì)種類和相對含量如表2所示。

表2 復合酶酶解和酸解加復合酶酶解樣品香氣物質(zhì)含量Table 2 Contents of aroma substances in blank samples, complex enzymatic hydrolysis and acid hydrolysis combined with complex enzymatic hydrolysis

圖3 水蒸氣蒸餾法不同生物酶酶解工藝揮發(fā)性香氣成分含量Figure 3 Comparison of volatile aroma components in different enzymatic hydrolysis processes by steam distillation

圖4 水蒸氣蒸餾法不同復合酶解工藝主要香氣物質(zhì)含量Figure 4 Content of main aroma substances in different complex enzymatic hydrolysis processes by steam distillation

2.4 復合酶酶解處理感官品質(zhì)

為了更好地確定不同樣品制備方法中香氣種類及含量變化對感官品質(zhì)的影響，采用感官評定方法對復合酶酶解所得到的7個樣品進行評吸。將2.3中的樣品分為4組分別進行評定。從表3可看出，酸解加復合酶酶解樣品加入卷煙中感官評定效果最好，與GC-MS測定的香氣物質(zhì)含量結(jié)果一致，酸解加復合酶酶解的香氣物質(zhì)含量最高。

表3 空白、復合酶酶解和酸解加復合酶酶解樣品感官評定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of blank, compound enzymatic hydrolysis and acidolysis combined with compound enzymatic hydrolysis samples

續(xù)表

續(xù)表

3 結(jié)論

香氣作為茶葉感官品質(zhì)表現(xiàn)的一個重要指標，其形成、提取以及檢測分析等都成為茶葉品質(zhì)研究的熱點。本文以鐵觀音茶鮮葉的殺青葉為試驗原料，以揮發(fā)性香氣物質(zhì)的相對含量和感官評吸結(jié)果為指標，研究了不同加工工藝對香氣物質(zhì)提取的影響。結(jié)果表明，水蒸氣蒸餾方法得到的餾出物茶香凸顯，有甜感。在外源酶的篩選中，加入纖維素酶、果膠酶和β-葡萄糖苷酶復合酶處理的香氣物質(zhì)總量明顯增加，同時特征香氣物質(zhì)（芳樟醇、苯乙醇和香葉醇）含量也有明顯增加，且加入β-葡萄糖苷復合酶后茶香特征保留較好，煙氣細柔有質(zhì)感，有甜感且味道明亮，表明加入纖維素酶和果膠酶能夠破壞細胞結(jié)構(gòu)，促進茶葉中香氣成分的擴散和浸出。在提取工藝上，酶解之前先進行酸解，能在短時間內(nèi)釋放大量香氣物質(zhì)，增加香氣濃度；與加酶酶解樣品對比，香氣物質(zhì)總量顯著提高，且新增多種具有花果香的酯類物質(zhì)。本試驗研究結(jié)果對于鐵觀音茶鮮葉殺青葉中香氣物質(zhì)的提取具有重要指導意義。