李 素，臧明伍，趙 冰，張順亮，王守偉，朱 寧，潘曉倩，劉 夢，吳倩蓉，劉博文

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

生物化學(xué)或微生物因素引起的產(chǎn)品變質(zhì)是肉品行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)問題，由生物化學(xué)變化引起的肉類變質(zhì)最常見的形式是脂質(zhì)和含血紅素蛋白質(zhì)的氧化。氧化反應(yīng)會導(dǎo)致肉類產(chǎn)品風(fēng)味、質(zhì)地和顏色發(fā)生變化，而色澤是影響消費(fèi)者接受度的最直觀指標(biāo)。在充分放血的肌肉中，肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是影響肉色的重要因素，因此，維持Mb的穩(wěn)定性有助于提升肉類產(chǎn)品的色澤品質(zhì)。Mb穩(wěn)定性與溫度、pH值、氧分壓、鹽離子等有重要關(guān)系，脂肪氧化的中間產(chǎn)物也可以促進(jìn)Mb的氧化。為抑制肉品發(fā)生氧化反應(yīng)，通常在加工過程中使用抗氧化劑。近年來，消費(fèi)者對綠色健康食品的需求日益增加，許多消費(fèi)者對化學(xué)合成食品添加劑持有一定排斥態(tài)度，認(rèn)為它們不健康或不安全，這一發(fā)展趨勢促使替代或減少傳統(tǒng)化學(xué)合成食品添加劑使用的技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。植物提取物具有一定的抑菌和抗氧化能力，可抑制不良微生物的生長，減少脂肪氧化，延緩肉制品品質(zhì)劣變。目前，植物提取物的應(yīng)用方式主要為將其加入產(chǎn)品中、涂在產(chǎn)品表面，或加入到包裝材料中。羊肉是我國重要的畜產(chǎn)品，目前對冷鮮羊肉外觀色澤穩(wěn)定性的研究較多，辛建增等研究3-磷酸甘油醛對羊肉色澤穩(wěn)定性和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）還原的影響，但仍缺少對羊肉中Mb穩(wěn)定性機(jī)理研究的報(bào)道，尤其是植物提取物對Mb穩(wěn)定性的研究。

氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）可使動物肌肉保持鮮紅的色澤，但易發(fā)生氧化反應(yīng)生成MetMb，從而影響肌肉色澤。為研究羊肉Mb變化引起的色澤劣變機(jī)理，本研究從羊肉中提取Mb，并制備OxyMb，通過氧化模型分析NaCl、pH值、溫度和牛至、留蘭香、竹葉提取物對OxyMb穩(wěn)定性的影響，為實(shí)際羊肉產(chǎn)品生產(chǎn)加工時(shí)色澤劣變控制機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊后腿肉購于市場。

連二亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；留蘭香提取物、牛至提取物 建明工業(yè)（珠海）有限公司；竹葉提取物浙江圣世生物科技有限公司；NaCl（食品級） 美添前景科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA822-CW天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；05P-22離心機(jī) 日本日立公司；M2e多功能酶標(biāo)儀 德國MD公司。

1.3 方法

1.3.1 Mb提取和OxyMb制備

參考孫沖等的方法提取Mb并制備OxyMb，對方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。取適量絞碎的瘦肉，加入3 倍體積預(yù)冷的緩沖液（10 mmol /L Tris-HCl，pH 8.5），于13 000 r/min下勻漿2 min，離心（4 ℃、10 000×、15 min）后取清液，置于飽和度65%的硫酸銨溶液中鹽析1 h；上清液再次離心（4 ℃、10 000×、15 min），取濾液，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)量濃度。調(diào)整Mb溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL，取5 mL Mb溶液與50 mg連二亞硫酸鈉反應(yīng)得OxyMb。用10 倍體積預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）透析20 次，除去多余的連二亞硫酸鈉。將透析后的OxyMb質(zhì)量濃度調(diào)至0.2 mg/mL，以緩沖溶液作空白，根據(jù)Krzywicki的方法測定透析后的OxyMb溶液在572、565、545、525 nm波長處的吸光度，總Mb含量和OxyMb、MetMb相對含量分別按式（1）～（3）計(jì)算。

式中：、和分別為/、/和/。

1.3.2 NaCl質(zhì)量濃度對OxyMb穩(wěn)定性的影響

取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別加入0～6 g/100 mL的等差質(zhì)量濃度（0.5 g/100 mL）梯度NaCl溶液，于室溫靜置15 min，取樣測定其525、545、565、572 nm波長處吸光度，分別根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算OxyMb和MetMb相對含量，平行測定3 次，取平均值。

1.3.3 pH值對OxyMb穩(wěn)定性的影響

取0.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于10 mL離心管中，加入pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液7.5 mL，于4 ℃條件下孵育6 h，取樣測定其525、545、565、572 nm波長處吸光度，分別根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算OxyMb和MetMb相對含量，平行測定3 次，取平均值。

1.3.4 溫度對OxyMb穩(wěn)定性的影響

取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別于4 ℃冰箱和10～100 ℃的等差溫度（5 ℃）梯度水浴中靜置15 min，然后將樣品取出，迅速冰水浴冷卻，取樣測定525、545、565、572 nm波長處吸光度，分別根據(jù)式（2）、（3）計(jì)算OxyMb和MetMb相對含量，平行測定3 次，取平均值。

1.3.5 牛至、留蘭香、竹葉提取物對OxyMb穩(wěn)定性的影響

取1.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別加入0.5 mL質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 mg/100 mL的竹葉提取物、留蘭香提取物、牛至提取物作為抗氧化物，于4 ℃靜置0、2、4、6、8、10、12、14、16 d后取出測定吸光度，計(jì)算OxyMb和MetMb相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS Statistics 21.0軟件進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl質(zhì)量濃度對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增大，OxyMb相對含量呈先上升后下降的趨勢，在1.5 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大，為67.07%，說明1.5 g/100 mL質(zhì)量濃度的NaCl溶液中OxyMb的穩(wěn)定性較好。而MetMb相對含量沒有明顯變化，說明MetMb受NaCl的影響不大。向丹在不同NaCl質(zhì)量濃度對豬Mb穩(wěn)定性影響研究中發(fā)現(xiàn)，MetMb含量也較為穩(wěn)定，與本研究結(jié)果一致，但在3 g/100 mL的NaCl溶液中OxyMb含量最高。NaCl可以通過降低Mb對氧的親和性，促進(jìn)OxyMb自動氧化為MetMb，研究結(jié)果的差異可能是由于Mb來源不同，對氧的親和度也不同，從而使得OxyMb在鹽溶液中的穩(wěn)定性有差異。

圖1 NaCl質(zhì)量濃度對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effect of NaCl concentration on the stability of mutton OxyMb

2.2 pH值對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，隨著pH值從酸性至堿性變化，OxyMb相對含量呈逐漸上升趨勢，MetMb相對含量呈逐漸降低趨勢。在低pH值（4.2～5.0）時(shí)OxyMb相對含量上升緩慢，pH 5.0～7.0時(shí)，OxyMb相對含量明顯上升，pH 7.0～8.5時(shí)，OxyMb相對含量變化不明顯。MetMb在pH 4.5環(huán)境中生成量最高，但隨pH值升高其相對含量大幅降低，說明在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較差，當(dāng)pH值升至7.0時(shí)逐漸穩(wěn)定，pH＞7.0時(shí)MetMb相對含量緩慢降低，說明其穩(wěn)定性在堿性環(huán)境中高于酸性環(huán)境中。陳景宜等研究發(fā)現(xiàn)，低pH值會增加牛Mb自動氧化的速率，該變化規(guī)律與本研究趨勢一致，即低pH值環(huán)境不利于色澤的穩(wěn)定，這可能是由于低pH值可降低Mb中血紅素與珠蛋白的結(jié)合能力，進(jìn)而加速氧化。

圖2 pH值對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Effect of pH value on the stability of mutton OxyMb

2.3 溫度對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，OxyMb相對含量呈逐漸降低的趨勢。在4～30 ℃范圍內(nèi)，OxyMb相對含量變化不明顯；當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，OxyMb相對含量明顯下降，表明OxyMb的結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，蛋白變性加劇；當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，OxyMb相對含量幾乎為零。而MetMb相對含量隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，在4～30 ℃范圍內(nèi)，MetMb相對含量上升緩慢；當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，MetMb相對含量顯著增加（＜0.05），表明OxyMb氧化劇烈；當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，MetMb相對含量急劇下降，與OxyMb的變化一致，說明Mb完全變性。Sen等研究羊排中Mb穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，隨溫度升高（51、65、71、79 ℃）可溶性Mb相對含量降低，而Mb變性比率相應(yīng)增加。在牛肉Mb的穩(wěn)定性研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。但也有研究表明，Mb在肌肉中的熱穩(wěn)定性比在與肌肉相同pH值和離子強(qiáng)度的溶液中的熱穩(wěn)定性低得多，因此，在實(shí)際生產(chǎn)加工過程中需要從多方面綜合考慮，以提升Mb的穩(wěn)定性。

圖3 溫度對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Effect of temperature on the stability of mutton OxyMb

2.4 牛至、留蘭香、竹葉提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響

2.4.1 牛至提取物對OxyMb穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，隨著牛至提取物質(zhì)量濃度的增加，OxyMb相對含量呈先升高后降低的趨勢，在2 mg/100 mL時(shí)達(dá)到最大。但1～3 mg/100 mL組的OxyMb相對含量與對照組無明顯差異，而4～5 mg/100mL組的OxyMb相對含量明顯低于對照組。在貯藏15 d時(shí)，各組的OxyMb相對含量為6.7%～11.6%，MetMb相對含量的變化規(guī)律與OxyMb的變化負(fù)相關(guān)，說明牛至提取物對OxyMb穩(wěn)定性的保護(hù)作用不穩(wěn)定，不適宜的添加量甚至?xí)龠M(jìn)羊肉OxyMb的氧化。有研究表明，香芹酚、對傘花烴、-松油烯和百里香酚是牛至提取物中發(fā)揮抗氧化作用的主要化合物，可通過向自由基提供電子，或阻斷氧化過程中的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等途徑起到延緩肉制品中脂肪氧化的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛至提取物在單一模擬體系下對維持羊肉OxyMb穩(wěn)定性方面無明顯效果。

圖4 牛至提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of oregano extract on the stability of mutton OxyMb

2.4.2 留蘭香提取物對OxyMb穩(wěn)定性的影響

留蘭香提取物中含有一定含量的酚類和黃酮類物質(zhì)，使其具有抗菌和抗氧化作用。由圖5可知，隨著留蘭香提取物質(zhì)量濃度的增加，OxyMb相對含量呈先升高后降低的趨勢，在4 mg/100 mL時(shí)達(dá)到最大，且添加留蘭香提取物的樣品中OxyMb相對含量均高于對照組。在前6 d的貯藏過程中，不同組之間OxyMb和MetMb相對含量的差異不明顯，貯藏后期，4 mg/100 mL組的樣品中OxyMb相對含量明顯高于其他組，在貯藏15 d時(shí)仍保持在23.8%左右。MetMb相對含量的變化規(guī)律與OxyMb的變化負(fù)相關(guān)，充分說明留蘭香提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的保護(hù)作用較好。留蘭香提取物在肉制品中的應(yīng)用機(jī)理研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，留蘭香提取物可提升羊肉OxyMb在模擬體系中的穩(wěn)定性。

圖5 留蘭香提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of magnolia extract on the stability of mutton OxyMb

2.4.3 竹葉提取物對OxyMb穩(wěn)定性的影響

竹葉提取物是從竹葉中提取的天然食品抗氧化劑，在食品中應(yīng)用較為廣泛，大量研究表明，竹葉提取物具有較好的抗氧化和抑菌作用，其有效成分主要為黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物。由圖6可知，隨著竹葉提取物質(zhì)量濃度的增加，OxyMb相對含量呈逐漸增大的趨勢，在5 mg/100 mL時(shí)達(dá)到最大，且在整個(gè)貯藏過程中，1～5 mg/100 mL組的OxyMb相對含量均明顯高于對照組。在貯藏8 d時(shí)，1 mg/100 mL組OxyMb相對含量明顯降低，與對照組無明顯差異，貯藏至15 d時(shí)，2～5 mg/100 mL組的OxyMb相對含量為19.3%～22.5%，均高于1 mg/100 mL組和對照組貯藏13 d時(shí)的OxyMb相對含量。MetMb相對含量的變化規(guī)律與OxyMb的變化負(fù)相關(guān)，在貯藏終點(diǎn)，對照組MetMb相對含量最高。說明在該模擬體系中，竹葉提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性具有較好的提升作用。

圖6 竹葉提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of bamboo leaf extract on the stability of mutton OxyMb

選用的植物提取物均含有抑菌、抗氧化活性物質(zhì)，對肉類的脂肪和蛋白質(zhì)具有一定的抗氧化作用，不同活性物質(zhì)對脂肪或蛋白質(zhì)氧化抑制作用機(jī)理不同。目前，比較認(rèn)可的植物活性物質(zhì)抗氧化作用機(jī)理主要有直接清除自由基、螯合金屬離子，或本身被氧化成自由基中間體，抑制自由基對脂肪或蛋白質(zhì)的氧化等。本研究OxyMb氧化模擬體系中，不同植物提取物對OxyMb抗氧化效果不同，可能是由于抗氧化活性物質(zhì)所含有的如酚羥基等極性基團(tuán)與模擬體系中的氧氣相結(jié)合，減少了OxyMb與氧氣的接觸量，從而延緩了蛋白的氧化速率，提升了OxyMb穩(wěn)定性。不同植物提取物對OxyMb穩(wěn)定性影響差異性可能與所含有效活性物質(zhì)種類不同有關(guān)。

3 結(jié) 論

通過采用羊肉Mb制備OxyMb，并對其理化穩(wěn)定性條件進(jìn)行分析，結(jié)果表明：1.5 g/100 mL的NaCl溶液可以提高OxyMb穩(wěn)定性，而不同質(zhì)量濃度NaCl溶液對MetMb相對含量影響較??；pH值對OxyMb穩(wěn)定性具有明顯影響，堿性環(huán)境下OxyMb穩(wěn)定性較好，酸性環(huán)境不利于OxyMb的穩(wěn)定性；高溫可促使OxyMb發(fā)生氧化變性反應(yīng)，當(dāng)加熱溫度低于30 ℃時(shí)Mb穩(wěn)定性較好，隨加熱溫度繼續(xù)升高，OxyMb相對含量明顯降低，MetMb開始大量形成。選用牛至提取物、留蘭香提取物和竹葉提取物，分析其對OxyMb穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的延長，OxyMb相對含量呈逐漸降低趨勢，MetMb相對含量呈逐漸增大的趨勢，說明Mb在貯藏過程中不斷地發(fā)生氧化反應(yīng)。所選用的3 種植物提取物對羊肉OxyMb穩(wěn)定性具有一定保護(hù)作用，其中，留蘭香提取物和竹葉提取物對OxyMb穩(wěn)定性保護(hù)效果較好，而牛至提取物對OxyMb穩(wěn)定性無明顯提升作用，不適宜的添加量甚至?xí)龠M(jìn)OxyMb的氧化。肉及肉制品組成基質(zhì)較為復(fù)雜，由羊肉Mb引起的色澤品質(zhì)變化也受多方面因素影響，因此，在后續(xù)工作中對各理化因素和植物提取物對羊肉色澤品質(zhì)影響機(jī)理研究將引入更多模擬條件。