王 鑫，趙海濤，萬玉美，孫桂清，崔兆進(jìn)，吳 彥，陳秀玲

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院，河北 秦皇島 066000；3.秦皇島北戴河新區(qū)海洋和漁業(yè)局，河北 秦皇島 066000)

隨著海水集約化養(yǎng)殖的飛速發(fā)展，工廠化全封閉循環(huán)水養(yǎng)殖過程中的鉻等重金屬污染問題開始引起關(guān)注。鉻的主要存在形式為Cr(Ⅵ)，其毒性是Cr(Ⅲ)毒性的100倍。工廠化養(yǎng)殖中，Cr(Ⅵ)的主要來源為排放的工業(yè)廢水、空氣沉降以及集約化養(yǎng)殖設(shè)備和飼料中的Cr(Ⅵ)污染，其可通過皮膚、消化道、呼吸道進(jìn)入養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)，引起機(jī)體中毒。近年來，有很多關(guān)于Cr(Ⅵ)脅迫對(duì)水生生物影響的研究。雷忻等的研究表明，金魚在Cr(Ⅵ)脅迫下的LC大于草魚、鯽和泥鰍；梁峰等的研究表明，在鉻中毒后黃顙魚仔魚和稚魚的活動(dòng)能力變?nèi)?，游?dòng)變慢，反應(yīng)變遲鈍，后相繼出現(xiàn)死亡情況；考慶君等、楊燕等的研究表明，鉻毒性作用的器官主要是肝腺和腎腺；張彩明等的研究表明，重金屬誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體組織抗氧化酶活性發(fā)生改變。

大菱鲆()是我國(guó)主要海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一，因其肉質(zhì)鮮美，受到人們喜愛，2020年其產(chǎn)量達(dá)110 984 t。工廠化集約化養(yǎng)殖是大菱鲆主要養(yǎng)殖模式，Cr(Ⅵ)污染對(duì)大菱鲆養(yǎng)殖的危害不容忽視。但到目前為止還沒有Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚急性毒性的研究。為此，本實(shí)驗(yàn)以大菱鲆幼魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用靜水實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行Cr(Ⅵ)脅迫下的急性毒性實(shí)驗(yàn)，研究在其脅迫下大菱鲆幼魚肝胰腺內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性的變化；觀察大菱鲆幼魚在Cr(Ⅵ)脅迫下的行為，通過急性毒性實(shí)驗(yàn)得出半致死濃度和安全濃度，以期為大菱鲆養(yǎng)殖中的水質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)，為其他重金屬離子和Cr(Ⅵ)的復(fù)合污染物的毒性研究提供借鑒，并為制定海洋漁業(yè)和水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用大菱鲆幼魚均采自河北省秦皇島市昌黎縣半滑舌鰨良種場(chǎng)，外形完好、無疾病，平均體長(zhǎng)為(6.00±0.40)cm，平均體質(zhì)量為(8.19±1.47)g。實(shí)驗(yàn)前將大菱鲆幼魚置室內(nèi)養(yǎng)殖池暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間保持24 h充氧，日換水一次，換水量為50%，及時(shí)清理池底糞便及殘餌。早8:30和下午5:30準(zhǔn)時(shí)少量喂食高能顆粒飼料兩次，暫養(yǎng)期間死亡率小于2%，實(shí)驗(yàn)前一天停止投喂。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)條件 本實(shí)驗(yàn)采取靜水實(shí)驗(yàn)法，實(shí)驗(yàn)期間不投飼不換水。實(shí)驗(yàn)容器為聚乙烯桶，實(shí)驗(yàn)期間水溫恒定，持續(xù)充氧。實(shí)驗(yàn)用水為深井鹵水和淡水混合配制而成，然后經(jīng)砂濾池過濾，水溫為(15.0±2.0)℃。符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607-1989)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第7部分 近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)》(GB 17378.7-2007)進(jìn)行，成體每克魚體質(zhì)量1 L用水量。預(yù)實(shí)驗(yàn)采取靜水實(shí)驗(yàn)法，實(shí)驗(yàn)期間不投飼不換水，及時(shí)撈出死亡個(gè)體并記錄。死亡標(biāo)準(zhǔn)為用玻璃棒觸碰魚的尾部，多次刺激，魚沒有反應(yīng)則判定為死亡。預(yù)實(shí)驗(yàn)Cr(Ⅵ)濃度梯度設(shè)置為20、40、80、160、320 mg/L，每組設(shè)置3組平行。每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶暫養(yǎng)10條大菱鲆幼魚，持續(xù)充氧。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)找出大菱鲆幼魚在不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下的最大全存活濃度和最小全致死濃度。

1.2.2 正實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果，在最大全存活濃度和最小全致死濃度之間選取7個(gè)等對(duì)數(shù)比濃度組作為正實(shí)驗(yàn)的濃度組，濃度分別為22.91、30.20、40.00、52.48、69.18、91.20、120.22 mg/L，同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每組設(shè)置3組平行，每個(gè)處理組12條大菱鲆幼魚，水體積100 L，持續(xù)充氧。實(shí)驗(yàn)期間每6 h觀察一次，觀察大菱鲆幼魚的行為表現(xiàn)及體表變化，實(shí)驗(yàn)過程中及時(shí)撈出死亡個(gè)體并記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

急性毒性所有數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行整理，運(yùn)用概率單位法制作散點(diǎn)圖，畫出趨勢(shì)線。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr(Ⅵ)脅迫下的大菱鲆幼魚的中毒癥狀和行為變化

Cr(Ⅵ)脅迫下的大菱鲆幼魚的中毒癥狀和行為變化見表1。在急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中，空白組及平行組大菱鲆幼魚均未出現(xiàn)死亡情況，幼魚表現(xiàn)平靜，多數(shù)時(shí)間伏于水底。低濃度組(22.91、30.20、40.00、52.48 mg/L濃度組)大菱鲆幼魚較為安靜，大部分幼魚伏于水底，個(gè)別會(huì)游到水面上沿桶壁正常游動(dòng)，未見明顯異常狀況。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，幼魚的鰓、口及體表有少量的Cr(Ⅵ)與體液的橙黃色復(fù)合物附著。在高濃度組(69.18、91.20、120.22 mg/L濃度組)，剛放入高濃度Cr(Ⅵ)母液時(shí)，大菱鲆幼魚顯得焦躁不安，在桶內(nèi)游動(dòng)迅速，翻滾打轉(zhuǎn)，擺尾迅速，呼吸加快，出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象；再過一段時(shí)間后，幼魚變得安靜下來，伏于水底不動(dòng)，在受到外界刺激后，反應(yīng)變得遲鈍，明顯看到幼魚的鰓、口及體表有較多的Cr(Ⅵ)與體液的橙黃色復(fù)合物附著；到后期大菱鲆幼魚有的鰓和口充分張開，有的鰓沒有明顯變化但是處于翻背狀態(tài)，用玻璃棒多次觸碰這些魚的尾部，魚無反應(yīng)，判定為死亡。

表1 不同濃度Cr(Ⅵ)暴露下的大菱鲆幼魚的中毒表現(xiàn)及行為

2.2 Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚的急性毒性

不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下大菱鲆幼魚的死亡情況見表2。研究表明，到48 h時(shí)，22.91、30.20、40.00、52.48 mg/L等低濃度組均未出現(xiàn)死亡情況；69.18 mg/L濃度組出現(xiàn)較少的死亡情況，死亡率8.33%；69.18 mg/L到120.22 mg/L濃度組死亡數(shù)量迅速增多，死亡率由8.33%增長(zhǎng)到95.8%。到72 h時(shí)，2個(gè)低濃度組(22.91 mg/L和30.20 mg/L)仍未出現(xiàn)死亡情況；40.00 mg/L到69.18 mg/L濃度組死亡數(shù)量逐漸增加，死亡率由37.5%逐步增長(zhǎng)到87.5%；2個(gè)高濃度組(91.20 mg/L和120.22 mg/L)死亡率達(dá)到100%。到96 h時(shí)，各濃度組均出現(xiàn)死亡情況，22.91 mg/L到40.00 mg/L濃度組死亡率由29.2%增長(zhǎng)到83.3%；52.48 mg/L及以上濃度組死亡率均達(dá)到100%。空白對(duì)照組在96 h內(nèi)未出現(xiàn)死亡情況，故排除水質(zhì)等外界因素對(duì)死亡情況的影響。

表2 不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下大菱鲆幼魚的死亡率 %

不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下，大菱鲆幼魚48、72、96 h 的死亡趨勢(shì)見圖1，由圖1可知，大菱鲆幼魚死亡率的概率單位與Cr(Ⅵ)的濃度對(duì)數(shù)的48 h、72 h和96 h回歸方程分別為=13.167-20.76，=6.208 3-5.278 3，=6.25-4.006 7；相關(guān)系數(shù)分別為0.982、0.993 4、0.990 1，均大于0.98，表現(xiàn)為很好的正相關(guān)性。

圖1 不同濃度Cr(Ⅵ)脅迫下大菱鲆幼魚的死亡趨勢(shì)

Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚的急性毒性實(shí)驗(yàn)分析見表3。大菱鲆幼魚48、72、96 h的Cr(Ⅵ)半數(shù)致死濃度LC50分別為90.449、45.248、27.606 mg/L，其95%置信區(qū)間分別為78.632～104.016、24.110～84.918、19.643～38.797 mg/L。Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚的安全質(zhì)量濃度為2.760 6 mg/L。48 h的95%置信區(qū)間范圍小于72 h的95%置信區(qū)間范圍，說明Cr(Ⅵ)在48 h到72 h之間致毒能力減弱。但72 h的95%置信區(qū)間范圍明顯大于96 h的95%置信區(qū)間范圍，說明Cr(Ⅵ)在72 h到96 h之間致毒能力明顯增強(qiáng)。

表3 Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚急性毒性實(shí)驗(yàn)分析

3 討論

在魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)中，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，重金屬離子的級(jí)別根據(jù)96 h LC可分為低毒、中毒、高毒和劇毒，范圍分別為>10、1～10、0.1～1、<0.1 mg/L。本實(shí)驗(yàn)求得Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚的96 h LC為27.606 mg/L，證明Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚的毒性級(jí)別屬于低毒。安全質(zhì)量濃度(SC)為0.1倍96 h LC，即為2.760 6 mg/L，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)規(guī)定：養(yǎng)殖水體鉻含量≤0.1 mg/L。實(shí)驗(yàn)測(cè)得安全質(zhì)量濃度為標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)的27.6倍，可見大菱鲆幼魚在Cr(Ⅵ)超標(biāo)的水中仍能存活，證明大菱鲆幼魚對(duì)Cr(Ⅵ)的耐受性較強(qiáng)。在大菱鲆養(yǎng)殖過程中應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)水質(zhì)的控制，防止養(yǎng)殖水體Cr(Ⅵ)超標(biāo)，以避免對(duì)人類健康產(chǎn)生影響。

Cr(Ⅵ)易被吸收并具有強(qiáng)氧化性，花日茂的研究表明Cr(Ⅵ)能氧化生物大分子，與蛋白質(zhì)分子上的羥基結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子變性。研究表明，低濃度的Cr(Ⅵ)可導(dǎo)致機(jī)體的SOD、CAT的酶活性降低，但是對(duì)生物沒有明顯的毒性作用，并能促進(jìn)生長(zhǎng)。高濃度的Cr(Ⅵ)可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞DNA鏈斷裂。Cr(Ⅵ)可通過魚體表、鰓進(jìn)入魚體，從而在魚體內(nèi)殘留，刺激并腐蝕黏膜，導(dǎo)致組織損壞。在實(shí)驗(yàn)過程中通過解剖高濃度Cr(Ⅵ)脅迫下的大菱鲆幼魚，發(fā)現(xiàn)其肝胰腺變黑，也印證了這一點(diǎn)。Cr(Ⅵ)還與黏液一起附著在魚的體表或者鰓上。研究表明，重金屬離子對(duì)水生生物體的作用機(jī)理大多是重金屬離子與黏液一起附著在鰓上，導(dǎo)致機(jī)體缺氧。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，大菱鲆的死亡率也逐漸增加，兩者呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)。在同一時(shí)間段內(nèi)，大菱鲆幼魚死亡率隨Cr(Ⅵ)濃度的增加而增加，兩者也呈正相關(guān)趨勢(shì)。在高濃度的Cr(Ⅵ)脅迫下，明顯觀察到大菱鲆幼魚的體表有Cr(Ⅵ)與黏液的復(fù)合物附著在上面。大菱鲆幼魚在高濃度的Cr(Ⅵ)實(shí)驗(yàn)桶中明顯呼吸速率加快，行動(dòng)變得遲緩，逐漸喪失活動(dòng)能力，最終死亡。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，大菱鲆幼魚隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，表現(xiàn)出呼吸加快，行動(dòng)逐漸遲緩，體表充血等癥狀，最終死亡。大菱鲆幼魚的鰓和體表有Cr(Ⅵ)與黏液結(jié)合物附著，Cr(Ⅵ)進(jìn)入大菱鲆體內(nèi)引起組織病變，導(dǎo)致肝胰腺變黑。Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚的 96 h LC為27.606 mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.760 6 mg/L。Cr(Ⅵ)對(duì)大菱鲆幼魚具有毒性作用，毒性級(jí)別為低毒，同時(shí)大菱鲆幼魚對(duì)Cr(Ⅵ)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性。