王惠玲，張 瑞，吳慕慈，楊 寧，葉樹(shù)芯，帥曉艷，江思佳，李玉保，何靜仁,

（1.武漢輕工大學(xué)硒科學(xué)與現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，湖北武漢 430023；2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；3.運(yùn)鴻集團(tuán)股份有限公司，湖北武穴 435406）

苦瓜（Momordica charantiaL.），葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬植物，為一年生或多年生藤本植物，不僅有良好的食用價(jià)值，而且有很高的藥用價(jià)值?？喙献丫哂锌狗逝諿1]、抗癌[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]等多種藥理作用?？喙献延妥鳛榭喙献训母碑a(chǎn)物，是自然界中為數(shù)不多富含α-桐酸的可食用來(lái)源之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)α-桐酸具有降血脂[6]和抗癌[7]等多種生理活性，因此苦瓜籽油具有潛在的藥用和保健價(jià)值。然而由于苦瓜籽油具有強(qiáng)烈的不良風(fēng)味和口感，且其極易被氧化、在光和微量金屬的催化下極易發(fā)生異構(gòu)化，這些特性限制了苦瓜籽油的應(yīng)用[8]。因此，基于苦瓜籽油的上述缺點(diǎn)，可選擇水包油乳液作為苦瓜籽油的遞送體系并對(duì)其進(jìn)行研究。

靜電層層自組裝技術(shù)（Electrostatic Layer by Layer Self-assembly Technique）是指利用表面帶有相反電荷的不同電解質(zhì)間的吸附作用，在經(jīng)過(guò)活化帶電荷的基材表面逐層沉積，從而形成特定厚度的多層復(fù)合膜[9]，具有制備簡(jiǎn)單、成膜物質(zhì)豐富、厚度可控、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。利用該技術(shù)制備得的多層乳液由于具有較厚及較致密的界面層，較高的界面電荷密度及良好的界面特性，因而具有較高的乳液穩(wěn)定性，較長(zhǎng)的貨架期[10-11]。通過(guò)靜電層層自組裝技術(shù)在油滴周圍形成更厚的界面層，可作為保護(hù)脂溶性功能因子的策略，防止其降解，提高其生物可及性[12]。目前已成功研究了包封ω-3脂肪酸[13]、β-胡蘿卜素[14]和維生素E[15]等的多層乳液。

在多層乳液的制備中，常用的帶電荷的生物聚合物是大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等[11]。乳清分離蛋白是奶酪工業(yè)的副產(chǎn)物，具有人體所需的全部必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。因此，乳清分離蛋白被廣泛應(yīng)用于食品與藥品中，在食品中主要是用作表面活性劑[15]。果膠是一種帶負(fù)電的聚合電解質(zhì)，可以同殼聚糖等帶正電的聚合電解質(zhì)相互作用，在油滴表面形成多層界面膜，可以更好的保護(hù)油滴[16]。殼寡糖屬于陽(yáng)離子多糖，是一種理想的高分子生物材料，具有較好的生物相容性、可降解性和生物活性[17]。利用靜電層層自組裝技術(shù)將苦瓜籽油進(jìn)行包埋，既可以掩蓋苦瓜籽油不良風(fēng)味和口感，避免多不飽和脂肪酸被氧化，還具有乳液粒徑和天然高分子聚合電解質(zhì)性質(zhì)可控制的特點(diǎn)[18]。

本文以乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）作為乳化劑制備單層乳液，結(jié)合蘋(píng)果果膠（apple pectin，AP）、殼寡糖（chitosan oligosaccharide，CTS），采用靜電層層自組裝技術(shù)制備雙層和三層乳液，通過(guò)粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PdI）和ζ-電位表征方法，確定乳化劑的用量以及各層乳液制備最佳pH；并對(duì)在最優(yōu)條件下制備的三種乳液進(jìn)行理化性質(zhì)表征，以期為苦瓜籽油的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

超臨界提取苦瓜籽油 江蘇高科制藥設(shè)備有限公司；乳清分離蛋白WPI9410 食品級(jí)，蛋白含量89%（濕基）脂肪含量1%（濕基），美國(guó)Hilmar公司；蘋(píng)果果膠APA185 酯化度60.9%，半乳糖醛酸含量＞65%，煙臺(tái)安得利果膠股份有限公司；殼寡糖（分子量≤2000 Da）、14%三氟化硼-甲醇 阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Ultra-turrax T18型高速分散器 德國(guó)IKA公司；ZEN3600納米激光粒度及電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；IX83全電動(dòng)倒置顯微鏡 日本奧林巴斯株式會(huì)社；Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀 法國(guó)Formulaction公司；STARTER 3100 pH計(jì) 奧豪斯儀器（上海）有限公司；AH-2010型高壓均質(zhì)機(jī)ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；PF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；Discovery DHR-2流變儀 美國(guó)TA儀器公司；R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；7890A+5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜籽油基本指標(biāo)測(cè)定 相對(duì)密度：參照GB/T 5518-2008進(jìn)行測(cè)定；折光指數(shù)：參照GB/T 5527-2010進(jìn)行測(cè)定；酸值：參照GB/T 5510-2011進(jìn)行測(cè)定；碘值：參照GB/T 5532-2008進(jìn)行測(cè)定；過(guò)氧化值：參照GB 5009.227-2016進(jìn)行測(cè)定；皂化值：參照GB/T 5534-2008進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 水相的制備 參考Ali等[19]的方法略有修改，制備濃度為 1%（w/v）的 WPI磷酸鹽緩沖液（pH7.0），制備不同濃度的AP磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH4.0）（1.5%～4.5%，w/v），制備不同濃度的CTS溶液（1%～6%，w/v），制備的溶液均在室溫下經(jīng)磁力攪拌4 h，4 ℃冰箱過(guò)夜放置待用。

1.2.3 苦瓜籽油單層乳液制備 參考Javier等[20]的方法并稍作修改，制備苦瓜籽油含量為5%（w/w）的苦瓜籽油乳液，將苦瓜籽油加入WPI溶液，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳液pH，10000 r/min高速剪切5 min，在一定均質(zhì)壓力下均質(zhì)一定次數(shù)制備得苦瓜籽油單層乳液。以乳液平均粒徑、PDI與ζ-電位值為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析均質(zhì)壓力（500、600、700 bar）、均質(zhì)次數(shù)（3、5、7、9 次）與pH（3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.6、5.0、5.6、6.2、7.0）對(duì)乳液質(zhì)量的影響。

1.2.4 苦瓜籽油雙層乳液制備 參考Javier等[20]的方法并稍作修改，在磁力攪拌器上，以3 mL/min的滴速將10 mL不同濃度的AP溶液（1.5%～4.5%，w/v）滴入90 mL苦瓜籽油單層乳中，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳液pH，再經(jīng)過(guò)8000 r/min，1 min高速剪切制備得苦瓜籽油雙層乳液。所得的乳液含有 4.5%（w/w）苦瓜籽油，0.15% （w/v）到 0.45%（w/v）AP。以乳液平均粒徑、PDI與ζ-電位為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析 AP濃度（1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，w/v）與 pH（3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4）對(duì)乳液質(zhì)量的影響。

1.2.5 苦瓜籽油三層乳液制備 參考Javier等[20]的方法并稍作修改，在磁力攪拌器上，以3 mL/min的滴速將12 mL不同濃度的CTS溶液（1%～6%，w/v）滴入 96 mL雙層乳中，用3 mol/L HCl和 3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳液pH，再經(jīng)過(guò)8000 r/min，1 min高速剪切制備得苦瓜籽油三層乳液。所得的乳液含有4.0% （w/w）苦瓜籽油，0.11%（w/v）到 0.67%（w/v）CTS。以乳液平均粒徑、PDI與ζ-電位為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析CTS濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%，w/v）與 pH（2、2.2、2.6、3.2）對(duì)乳液質(zhì)量的影響。

1.2.6 乳液平均粒徑、PDI及ζ-電位的測(cè)定 參考Shi等[21]的方法并略作修改，乳狀液粒度通過(guò)ZEN3600納米激光粒度及電位分析儀測(cè)定，分散相的折射率和吸收率分別設(shè)定為1.475和0.001，連續(xù)相的折射率為1.33，測(cè)試溫度25 ℃。乳狀液以1:10的比例用去離子水稀釋，測(cè)量其電位值。乳狀液以1:600的比例用去離子水稀釋，測(cè)量其平均粒徑和PDI。

1.2.7 乳液的微觀形態(tài) 使用奧林巴斯全電動(dòng)倒置顯微鏡IX83，以100放大倍率對(duì)乳液進(jìn)行觀察。

1.2.8 乳液靜態(tài)流變性能測(cè)定 參考Niu等[22]的方法并略作修改，采用Discovery DHR-2流變儀對(duì)多層乳液靜態(tài)流變性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。采用直徑為60 mm的平行板，間距設(shè)置為1 mm，剪切速率1～100 s-1，應(yīng)變?yōu)?.1%，溫度25 ℃。

1.2.9 脂肪酸含量測(cè)定

1.2.9.1 乳液破乳 參考武西岳[23]的方法并稍作修改，取乳液10 mL，加入1.0 g無(wú)水硫酸鈉，適當(dāng)?shù)恼袷幓靹?，?0 ℃的水浴中超聲20 min，6000 r/min離心20 min，分液，可分離得到水相和油相。破乳后，參照1.2.9.1的方法進(jìn)行甲酯化。

1.2.9.2 脂肪酸甲酯化 參考GB5009.168-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》采用14%三氟化硼-甲醇溶液催化油脂甲酯化。

1.2.9.3 GC-MS條件 參考帥曉艷等[24]的方法，氣相色譜分析條件：色譜柱為HP-88，100 m× 0.25 mm×0.20 μm；載氣為99.999%高純氮?dú)猓懔髂Ｊ?，柱流速? mL/min；進(jìn)樣量 1 μL，不分流；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；程序升溫：150 ℃ 保持 0 min，再以 4 ℃/min升溫至 190 ℃，保持 5 min，再以 2 ℃/min升溫至230 ℃，保持 10 min。

質(zhì)譜條件：離子化方式EI+，發(fā)射電流200 VA；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；檢測(cè)電壓350 V。

質(zhì)譜庫(kù)：NIST11.L。

1.2.10 乳液物理穩(wěn)定性測(cè)定 用Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀，分析新鮮制備的乳液在1 h內(nèi)的穩(wěn)定性情況。量取大約20 mL乳液置于Turbiscan專用樣品瓶中，在25 ℃條件下先每1 min掃描一次，持續(xù)10 min后，每5 min掃描一次，持續(xù)掃描50 min，觀察在此期間乳液的背散射光（ΔBS）變化。用 Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀，分析各層乳液在14 d內(nèi)穩(wěn)定性指數(shù)（TSI）的變化，將制備好的乳液取大約20 mL置于Turbiscan專用樣品瓶中，與25 ℃溫度下存放，每天測(cè)量一次TSI值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次測(cè)定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（means±SD）表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析，用LSD和Duncan極差分析結(jié)果差異顯著性水平（P＜0.05）和（P＜0.01）；用 OriginPro 9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜籽油理化指標(biāo)及脂肪酸組成

按照國(guó)標(biāo)相關(guān)方法對(duì)超臨界提取的苦瓜籽油理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，得到結(jié)果如表1所示。碘值用于判斷食用油的不飽和程度，油脂的碘值越大，說(shuō)明其不飽和程度越高，脂肪酸的不飽和鍵也越多，油脂的氧化穩(wěn)定性就越差，越容易被氧化，而導(dǎo)致油脂腐敗變質(zhì)[25]。由表1所示，苦瓜籽油的碘值為137.646±0.626 g/100 g，表明利用超臨界CO2萃取制備的苦瓜籽油中脂肪不飽和度較高?？喙献训倪^(guò)氧化值較高為1.317±0.006 mmol/kg，這可能是因?yàn)椴伙柡椭舅針O易發(fā)生氧化反應(yīng)而導(dǎo)致的。所得結(jié)果與張飛等[5]的測(cè)量結(jié)果不一致，可能與苦瓜種類、提取方法和放置時(shí)間有關(guān)[26]。

表1 苦瓜籽油的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of BGSO

2.2 苦瓜籽油單層乳液制備的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 均質(zhì)條件對(duì)苦瓜籽油單層乳液的影響 由圖1可知，在均質(zhì)次數(shù)相同時(shí)，相較于500 bar，均質(zhì)壓力為600和700 bar時(shí)苦瓜籽油單層乳液的平均粒徑極顯著減?。≒＜0.01）。當(dāng)均質(zhì)壓力為600 bar時(shí)，均質(zhì)次數(shù)≥5次時(shí)，苦瓜籽油單層乳液的粒徑無(wú)明顯變化。這可能是由于高壓均質(zhì)壓力和次數(shù)的增加帶來(lái)強(qiáng)烈的剪切流場(chǎng)，使得乳液獲得更有效的乳化[27]。同時(shí)，由圖1可知，當(dāng)均質(zhì)壓力為600 bar時(shí)，在相同的均質(zhì)壓力下，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，乳液PDI值呈先減小再增大的趨勢(shì)，可能是由于均質(zhì)次數(shù)的增加帶給乳液的能量過(guò)大，從而使乳液產(chǎn)生絮凝聚結(jié)等現(xiàn)象[28]。Kuhn等[29]比較了高壓均質(zhì)壓力（20和80 MPa）和均質(zhì)次數(shù)（1～7次）對(duì)亞麻籽油-乳清分離蛋白乳液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)可以降低液滴大小，然而，在高壓（80 MPa）下，均質(zhì)次數(shù)的增加會(huì)促進(jìn)乳液液滴的聚結(jié)。

圖1 均質(zhì)條件對(duì)苦瓜籽油單層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.1 Effects of homogeneous conditions on mean diameter and polydispersity index of BGSO primary emulsion

不同均質(zhì)條件下制備的苦瓜籽油單層乳液的ζ-電位變化如圖2所示，600 bar均質(zhì)壓力時(shí)，均質(zhì)7次獲得乳液的ζ-電位絕對(duì)值最大（-23.4±0.7 mV），與均質(zhì)5次獲得乳液的ζ-電位值（-22.3±0.8 mV）無(wú)顯著差異。ζ-電位的絕對(duì)值越小，意味著油滴之間形成的靜電排斥力小，可能不足以克服液滴和能壘之間的分子吸引力（即范德華力和疏水吸引力），從而引起乳液發(fā)生絮凝、液滴傾向聚集，使乳液分層率增加[30]。因此從節(jié)約能源的角度出發(fā)，并綜合考慮苦瓜籽油單層乳液平均粒徑、PDI和ζ-電位，選取均質(zhì)壓力600 bar，均質(zhì)5次，所制備的乳液粒徑為460±3 nm，PDI為0.073±0.004，ζ-電位為-22.3±0.8 mV。

圖2 均質(zhì)條件對(duì)苦瓜籽油單層乳液ζ-電位的影響Fig.2 Effect of homogeneous conditions on ζ-potential of BGSO primary emulsion

2.2.2 pH對(duì)苦瓜籽油單層乳液的影響 由圖3與圖4可知，苦瓜籽油單層乳液的粒徑、PDI和ζ-電位受pH的影響較大，當(dāng)pH為4.6左右時(shí)，乳液ζ-電位為（-1.0±0.2 mV）趨向于 0 mV，粒徑增大，PDI增大，表明當(dāng)乳液pH接近WPI等電點(diǎn)時(shí)，乳液間靜電排斥作用減小，乳滴易發(fā)生聚集，穩(wěn)定性降低[31]。當(dāng)pH小于3.2時(shí)，PDI增大，乳液穩(wěn)定性降低，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在酸性條件下易變性造成的。綜合考慮，在制備苦瓜籽油單層乳時(shí)，不調(diào)整pH，此時(shí)pH為7.0，乳液粒徑較小，粒徑分布較為均一，ζ-電位絕對(duì)值較大，乳液較為穩(wěn)定。這與林傳舟等[9]在用乳清蛋白制備亞麻籽油單層乳液時(shí)，選擇pH條件為7.0結(jié)果相似，pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，所得乳液較為穩(wěn)定。

圖3 pH對(duì)苦瓜籽油單層乳液的ζ-電位的影響Fig.3 Effect of pH on ζ-potential of BGSO primary emulsion

圖4 pH對(duì)苦瓜籽油單層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.4 Effects of pH on mean diameter and polydispersity index of BGSO primary emulsion

2.3 苦瓜籽油雙層乳液的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 AP濃度對(duì)苦瓜籽油雙層乳液的影響 制備多層乳液時(shí)，通常多糖的濃度必須經(jīng)過(guò)優(yōu)化，使油滴既能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的空間排斥力和靜電排斥力，同時(shí)又不促進(jìn)橋連或耗損絮凝[32]。在制備苦瓜籽油雙層乳液時(shí)，調(diào)整單層乳液pH為4.0，此時(shí)苦瓜籽油單層乳液帶正電。由圖5和圖6可知當(dāng)AP濃度為3.5%（w/v）時(shí)，乳液粒徑最?。?40±47 nm），PDI最?。?.322±0.140），ζ-電位絕對(duì)值最大（-12.9±0.7 mV），表明乳滴間的靜電排斥力較強(qiáng)，乳液液滴不易相互聚集，此時(shí)乳液穩(wěn)定性最好。當(dāng)AP濃度大于3.5%（w/v）時(shí)，由于陰離子高分子聚電解質(zhì)過(guò)剩，乳液中存在大量未吸附的果膠使得乳液發(fā)生損耗絮凝[33]，當(dāng)AP濃度小于3.5%（w/v）時(shí)，由于陰離子高分子聚電解質(zhì)不足，導(dǎo)致兩個(gè)或多個(gè)帶正電的液滴共享陰離子果膠分子而引起橋連絮凝[20]。林傳舟等[9]在制備亞麻籽油雙層乳液時(shí)，乳液穩(wěn)定性隨著果膠濃度的逐漸增大，出現(xiàn)聚結(jié)-穩(wěn)定-絮凝現(xiàn)象，說(shuō)明在制備雙層乳液時(shí)，果膠濃度過(guò)低，乳液易產(chǎn)生橋連絮凝，果膠濃度過(guò)高時(shí)，易產(chǎn)生損耗絮凝。所以，選擇果膠濃度為3.5%（w/v）進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 AP濃度對(duì)苦瓜籽油雙層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.5 Effects of AP concentration on mean diameter and polydispersity index of BGSO secondary emulsion

圖6 AP濃度對(duì)苦瓜籽油雙層乳液ζ-電位的影響Fig.6 Effect of AP concentration on ζ-potential of BGSO secondary emulsion

2.3.2 pH對(duì)苦瓜籽油雙層乳液的影響 采用靜電層層自組裝法制備乳液，油滴周圍通常會(huì)形成多層生物聚合物，多層生物聚合物主要是依賴聚電解質(zhì)相互之間的靜電吸引而形成的，因此pH會(huì)影響多層界面的形成、分解和穩(wěn)定乳液的能力[34]。由圖3可知，當(dāng)pH＞5時(shí)，單層乳液液滴表面的WPI帶負(fù)電荷，AP溶液也帶負(fù)電荷，在這種情況下，兩種生物聚合物往往相互競(jìng)爭(zhēng)油水界面，且彼此之間沒(méi)有很強(qiáng)的相互作用[35]。調(diào)節(jié)pH可通過(guò)改變生物聚合物的帶電荷性質(zhì)，從而改變兩種生物聚合物的競(jìng)爭(zhēng)或者合作程度，從而可能導(dǎo)致均相（生物聚合物混合）或者非均相（生物聚合物分離）界面的形成[36]。由圖3可推測(cè)當(dāng)pH為4.4時(shí)，單層乳液帶正電荷，由圖7和圖8可知，當(dāng)pH為4.4時(shí)，苦瓜籽油雙層乳液粒徑較小，PDI較小，ζ-電位絕對(duì)值較大，推測(cè)這是由于pH變化，增加了帶正電的單層乳液與帶負(fù)電荷的果膠之間的靜電作用力。這可能是由于當(dāng)pH遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷和水溶性通常會(huì)增加，這可以增加帶電荷的多糖的靜電吸引或排斥[37]。但當(dāng)pH小于4.4時(shí)，單層乳液ζ-電位增大，表明液滴表面所帶正電荷電荷密度增加，此時(shí)，AP不足以覆蓋單層乳液液滴，兩個(gè)或多個(gè)帶正電的液滴共享一個(gè)AP分子，此時(shí)乳液ζ-電位絕對(duì)值減小，易發(fā)生靜電中和效應(yīng)，形成橋連結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生聚集。因此，選擇pH為4.4為制備的苦瓜籽油雙層乳液pH條件，制得的雙層乳液粒徑為 670±9 nm，PDI為 0.258±0.020，ζ-電位為-19.6±0.9 mV。

圖7 pH對(duì)苦瓜籽油雙層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.7 Effects of pH on mean diameter and polydispersity index of BGSO secondary emulsion

圖8 pH對(duì)苦瓜籽油雙層乳液ζ-電位的影響Fig.8 Effect of pH on ζ-potential of BGSO secondary emulsion

2.4 苦瓜籽油三層乳液制備的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 CTS濃度對(duì)苦瓜籽油三層乳液的影響 殼寡糖是自然界唯一帶正電荷、陽(yáng)離子堿性氨基低聚糖[38]，由圖9和圖10可知，當(dāng)CTS濃度為1%（w/v）時(shí)，形成的苦瓜籽油三層乳液ζ-電位仍然為負(fù)值（-16.6±0.4 mV），推測(cè)此時(shí)CTS不足吸附在帶負(fù)電荷的二層乳液液滴上，維持乳液穩(wěn)定的靜電作用力較小，易產(chǎn)生橋連結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生聚集。隨著CTS濃度的增大，乳液粒徑和PDI呈上升趨勢(shì)，而ζ-電位值在CTS濃度為 4%（w/v）時(shí)為-1.8±0.5 mV，趨近 0 mV，表明此時(shí)乳液中靜電排斥力較弱。當(dāng)CTS濃度大于4%（w/v）時(shí)，乳液ζ-電位仍然為負(fù)值，且乳液多分散系數(shù)趨近1，說(shuō)明乳液粒徑分布不均，此時(shí)由于CTS濃度過(guò)大，CTS的加入增加了乳液體系的黏度，乳液液滴易產(chǎn)生聚集，使得乳液液滴分布不均。綜合平均粒徑、PDI和ζ-電位結(jié)果，選擇 CTS 濃度為 2%（w/v），進(jìn)行下一步研究。

圖9 CTS濃度對(duì)苦瓜籽油三層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.9 Effect of CTS concentration on mean diameter and polydispersity index of BGSO tertiary emulsion

圖10 CTS濃度對(duì)苦瓜籽油三層乳液的ζ-電位的影響Fig.10 Effect of CTS concentration on ζ-potential of BGSO tertiary emulsion

2.4.2 pH對(duì)苦瓜籽油三層乳液的影響 由圖11和圖12可知，苦瓜籽油三層乳液的ζ-電位隨pH的增大先增大再減小，在pH為3.8附近時(shí)，乳液的ζ-電位接近于0 mV，當(dāng)pH小于3.8時(shí)，乳液的ζ-電位為正值，表明此時(shí)殼寡糖能吸附在果膠聚電解質(zhì)層上，當(dāng)pH大于3.8時(shí)，乳液的ζ-電位為負(fù)值，這可能是由于pH增大，雙層乳液的聚電解質(zhì)層所帶電荷密度增加，使得CTS不能夠完全吸附在雙層乳液液滴上。當(dāng)pH為2.2時(shí)制備的三層乳液平均粒徑比在pH為3.2條件下制備的三層乳液粒徑極顯著減?。≒＜0.01），ζ-電位極顯著增大（P＜0.01）。通過(guò)改變pH，直到CTS所帶的負(fù)電荷占主導(dǎo)地位，當(dāng)pH為2.2時(shí)，乳液ζ-電位為16.3±0.3 mV，粒徑為1623±10 nm，PDI為0.480±0.034，說(shuō)明此時(shí)CTS既能為乳液穩(wěn)定提供靜電排斥力，又能提供空間作用力使乳液體系更加穩(wěn)定[27]。所以選擇制備苦瓜籽油三層乳液的pH為2.2。

圖11 pH對(duì)苦瓜籽油三層乳液ζ-電位的影響Fig.11 Effect of pH on ζ-potential of BGSO tertiary emulsion

圖12 pH對(duì)苦瓜籽油三層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.12 Effects of pH on mean diameter and polydispersity index of BGSO tertiary emulsion

2.5 苦瓜籽油多層乳液的表征

2.5.1 苦瓜籽油多層乳液的平均粒徑、PDI和ζ-電位 由圖13可知，苦瓜籽油和WPI溶液在pH為7條件下制備的單層乳液粒徑較小，在460 nm左右。將濃度為3.5%（w/v）的AP溶液加入到制備的單層乳液中，將pH調(diào)至4.4，此時(shí)，單層乳液液滴表面帶正電荷，帶負(fù)電荷的AP吸附到液滴表面，粒徑增大至680 nm左右，ζ-電位為負(fù)值。通過(guò)將濃度為2%（w/v）的CTS溶液加入到制備的雙層乳液中，pH調(diào)至2.2，制得三層乳液，由于CTS分子所帶的電荷為正，雙層乳液表面帶負(fù)電荷，通過(guò)靜電相互作用，CTS吸附到雙層乳液液滴表面，乳液粒徑進(jìn)一步增大，ζ-電位由負(fù)值（-19.6±0.9 mV）轉(zhuǎn)變?yōu)檎担?0.3±0.5 mV），表明聚合電解質(zhì)已經(jīng)被吸附到液滴表面。

圖13 苦瓜籽油多層乳液的平均粒徑、PDI和ζ-電位Fig.13 Mean diameter, polydispersity index and ζ-potential of BGSO multilayer emulsion

2.5.2 苦瓜籽油多層乳液的微觀形態(tài) 采用靜電層層自組裝技術(shù)制備多層乳液時(shí)，需通過(guò)仔細(xì)控制聚電解質(zhì)的濃度和環(huán)境pH，改變不同界面層的結(jié)構(gòu)和性能，以確保其能夠快速和足夠吸附在油水界面，以確保幾乎沒(méi)有游離的聚電解質(zhì)在水相（這可能促進(jìn)損耗絮凝），得到穩(wěn)定的多層穩(wěn)定劑[37]，從而使得乳液體系更加穩(wěn)定。在最優(yōu)條件下制備的苦瓜籽油多層乳液微觀形態(tài)結(jié)果如圖14所示，乳液粒徑較小，液滴較為分散，且無(wú)明顯聚集現(xiàn)象。

圖14 苦瓜籽油多層乳液的微觀形態(tài)（100×）Fig.14 Microscopic morphology of BGSO multilayer emulsion(100×）

2.5.3 苦瓜籽油多層乳液的流變性 由圖15可知，各層乳液的黏度和剪切速率成非線性關(guān)系，表明乳液為假塑性非牛頓流體[39]，隨著剪切速率的增加，乳液黏度明顯降低。水包油乳劑的流變性質(zhì)取決于如乳化劑和油相的種類、連續(xù)相與分散相的比例、粒徑及分布等諸多因素[40]。結(jié)果表明苦瓜籽油三層乳液黏度明顯高于單層、雙層乳液，這可能是由于CTS溶液的黏性使得乳液的黏度增大。雙層乳液和單層乳液的黏度隨剪切速率的變化趨勢(shì)基本相似，說(shuō)明制備雙層乳液時(shí)，AP和WPI之間產(chǎn)生的正負(fù)電荷靜電吸引力起主導(dǎo)作用，從而提高界面層的機(jī)械強(qiáng)度，使液滴能避免液滴聚結(jié)[41]。

圖15 苦瓜籽油多層乳液的流變性Fig.15 Rheological property of BGSO multilayer emulsion

2.5.4 苦瓜籽油多層乳液的脂肪酸組成分析 由表2可知，苦瓜籽油中，硬脂酸和α-桐酸含量較高，其相對(duì)含量分別高達(dá)到33.574%和32.026%，與之前的研究結(jié)果具有一定差異[26,42]，可能是由于苦瓜品種和油脂提取方法不同所導(dǎo)致?？喙献延蛦螌尤橐号c苦瓜籽油相比，α-桐酸相對(duì)含量極顯著降低 （P＜0.01），這可能是由于高壓均質(zhì)過(guò)程中產(chǎn)熱使得α-桐酸氧化導(dǎo)致其含量降低?？喙献延碗p層乳液和三層乳液中的α-桐酸含量極顯著升高（P＜0.01），這可能是由于制備條件的不同導(dǎo)致苦瓜籽油中其他成分的損失，造成α-桐酸的相對(duì)含量升高?？喙献延透鲗尤橐旱膩営退帷LN-B、CLN-C相對(duì)含量，與苦瓜籽油相比都極顯著降低（P＜0.01），這與廖一等[43]的研究結(jié)論相似，可能是由于在乳液制備過(guò)程中使用的儀器和制備方式使油脂受到剪切力和摩擦作用，使油脂發(fā)生氧化反應(yīng)。說(shuō)明苦瓜籽油多層乳液的氧化穩(wěn)定性需進(jìn)一步研究。

表2 苦瓜籽油多層乳液的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of BGSO multilayer emulsion

2.5.5 苦瓜籽油多層乳液的物理穩(wěn)定性分析 利用Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性分析，可通過(guò)ΔBS的強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線，可快速、準(zhǔn)確地反映出乳化體系的上浮、沉淀、聚集等動(dòng)態(tài)變化，以及乳化體系的穩(wěn)定性情況[44]。利用Turbiscan Lab分析儀對(duì)新鮮制備的乳液進(jìn)行掃描1 h，結(jié)果見(jiàn)圖16，左側(cè)背散射光強(qiáng)度減少，說(shuō)明底部樣品濃度降低出現(xiàn)澄清層；右側(cè)背散射光強(qiáng)度增加，說(shuō)明樣品頂部濃度增加，出現(xiàn)上浮層[44]，反映出苦瓜籽油單層乳液、雙層乳液和三層乳液的失穩(wěn)過(guò)程都主要是上浮。

圖16 苦瓜籽油多層乳液的背散射光（ΔBS）Fig.16 ΔBS of BGSO multilayer emulsion

TSI是用于估計(jì)乳化體系物理穩(wěn)定性的重要參數(shù)，可用于比較不同樣品的穩(wěn)定性差異[44]。由圖17可看出，在14 d內(nèi)苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液的TSI值比苦瓜籽油單層乳液的TSI值小且上升速度慢。說(shuō)明雙層乳液和三層乳液比單層乳液更加穩(wěn)定，這可能是由于大多數(shù)兩親性蛋白質(zhì)都是小分子，它們形成相對(duì)較薄的界面層（幾納米），因此它們只產(chǎn)生非常短的空間排斥力[45]，而多糖能夠增加油滴間的空間排斥力和靜電排斥力，所以在蛋白質(zhì)包裹的油滴中添加電荷相反的多糖能夠增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境應(yīng)力的抵抗能力[46]。利用靜電層層自組裝技術(shù)，使AP和CTS通過(guò)靜電相互作用一層一層沉積在液滴表面，使乳滴產(chǎn)生較厚的聚合物層，為乳液提供更大的穩(wěn)定性[47]。所以苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液物理穩(wěn)定性優(yōu)于單層乳液。

圖17 苦瓜籽油多層乳液的穩(wěn)定性指數(shù)（TSI）Fig.17 Turbiscan stability index （TSI） of BGSO multilayer emulsion

3 結(jié)論

本研究基于靜電層層自組裝技術(shù)，以苦瓜籽油為油相，用WPI、AP和CTS制備苦瓜籽油多層乳液，用粒徑電位對(duì)三種乳液進(jìn)行表征，考察高壓均質(zhì)條件、聚電解質(zhì)濃度和環(huán)境pH對(duì)乳液性質(zhì)的影響，得到制備的苦瓜籽油多層乳液最佳參數(shù)如下：將苦瓜籽油和 WPI溶液（1% w/v）混合，pH7.0，經(jīng)10000 r/min剪切5 min后高壓均質(zhì)600 bar均質(zhì)5次即得苦瓜籽油單層乳液，單層乳液組成為5%（w/w）苦瓜籽油，0.95% （w/v）WPI；雙層乳液在單層乳的基礎(chǔ)上添加3.5%（w/v）AP溶液，使得雙層乳組成為4.5%（w/w）苦瓜籽油，0.86% （w/v） WPI，0.35% （w/v） AP，調(diào)節(jié)溶液pH至4.4，8000 r/min剪切1 min即得；三層乳液在雙層乳液的基礎(chǔ)上添加CTS溶液，使得三層乳液組成為 4% （w/w）苦瓜籽油，0.76% （w/v）WPI，0.31% （w/v）AP，0.22% （w/v）CTS，調(diào)節(jié) pH 至 2.2，8000 r/min剪切1 min即得?？喙献延透鲗尤橐壕哂休^小的粒徑，較好的分散性。乳液物理穩(wěn)定性結(jié)果表明，苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液比單層乳液物理穩(wěn)定性更好。本研究為進(jìn)一步研究苦瓜籽油多層乳液提供理論基礎(chǔ)，對(duì)更好發(fā)揮苦瓜籽油的功效價(jià)值具有參考意義。