蔣薇，司曉喜，張鳳梅，劉志華，李明，唐石云，劉春波，朱瑞芝

1.云南中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心/云南省煙草化學重點實驗室，云南 昆明 650231；2.紅塔煙草(集團)有限責任公司 玉溪卷煙廠，云南 玉溪 653100

0 引言

有機酸是一類重要的煙用香料，其作用主要體現(xiàn)在中和煙氣堿性成分，調(diào)節(jié)煙氣中質(zhì)子化和游離態(tài)煙堿的比例，減輕煙氣刺激性，增加煙氣濃度，改善吸味，使煙氣口感醇和等方面[1-3]，有機酸種類和含量會直接影響卷煙的香氣和香味[4-5]。香氣和香味是人體的嗅感和味感通過接收外界刺激引起的感官體驗，目前主要通過香氣活性值(Odor Activity Value，OAV)和味覺活性值(Taste Activity Value，TAV)評價致香成分的感官貢獻度[6-9]，OAV/TAV是通過計算致香成分質(zhì)量與其嗅覺/味覺閾值的比值得到。在OAV/TAV感官貢獻度評價方法基礎上，史清照等[10]將致香成分轉(zhuǎn)移率與嗅覺閾值的比值定義為香氣成分的加香貢獻度，其中轉(zhuǎn)移率代表致香成分被消費者感知到的量的大小，結(jié)合嗅覺閾值后可真實反映不同致香成分對卷煙煙氣的感官貢獻，然而該研究只考慮了致香成分對香氣的影響，并未考慮對香味的影響。

基于此，本研究擬在已有OAV、TAV和加香貢獻度評價致香成分感官貢獻度方法的基礎上，將致香成分的煙氣粒相轉(zhuǎn)移率與其嗅覺閾值/味覺閾值有效結(jié)合，定義其比值為嗅覺貢獻度和味覺貢獻度，考查在煙絲加香和爆珠加香兩種方式下，戊酸、辛酸、癸酸3種有機酸在不同圓周卷煙中的嗅覺貢獻度和味覺貢獻度，以期全面反映不同酸類香料的應用特點，為香料輔助篩選、卷煙加香方式優(yōu)化，以及卷煙產(chǎn)品香料配方設計提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：常規(guī)基準煙支、中支基準煙支、細支基準煙支(濾棒長度均為30 mm，煙支長度分別為84 mm，90 mm、97 mm，圓周分別為24 mm、20 mm、17 mm)；常規(guī)爆珠煙支、中支爆珠煙支、細支爆珠煙支(濾棒長度均為30 mm，煙支長度分別為84 mm，90 mm、97 mm，圓周分別為24 mm、20 mm、17 mm，爆珠粒徑分別為3.6 mm、3.0 mm、2.8 mm，距唇端距離均為15 mm)，爆珠中的酸類成分按廠家的生產(chǎn)實際使用比例進行添加，添加量以各種規(guī)格爆珠的經(jīng)驗檢測值為準.所有煙支樣品(濾嘴通風率約為10%)均由云南中煙工業(yè)有限責任公司提供。

主要試劑：戊酸、辛酸、癸酸、反式-2-己烯酸，均為色譜純，德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)；N,O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)，美國Sigma Aldrich 公司；二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水吡啶，均為色譜純，美國Merck公司產(chǎn)。

主要儀器：Agilent 7693A Autosampler、Agilent 5977B GC/MSD、Agilent8890 GC System，美國Agilent 公司產(chǎn)；KBF240恒溫恒濕箱，德國 BINDER 公司產(chǎn)；KQ-700超聲波清洗箱，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)；BT 125 D電子天平(感量0.01 mg),德國賽多利斯科學儀器有限公司產(chǎn)；S0509/20744直線型吸煙機，美國斯茹林公司產(chǎn)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海貝倫儀器設備有限公司產(chǎn)。

1.2 萃取溶劑優(yōu)化與溶液配制

萃取溶劑優(yōu)化：分別以二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和無水吡啶為溶劑配制質(zhì)量濃度為50 mg/L的戊酸、辛酸、癸酸混合標準溶液，分別準確移取500 μL上述3種混合標準溶液，加入20 μL BSTFA，密閉后于60 ℃水浴中反應60 min，進行GC-MS分析，以總峰面積和出峰個數(shù)比較溶劑的萃取效果，確定優(yōu)選溶劑。

準確稱取50 mg反式-2-己烯酸置于50 mL容量瓶中，用優(yōu)選溶劑溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為1000 mg/L的內(nèi)標儲備液；用優(yōu)選溶劑將內(nèi)標儲備液稀釋為質(zhì)量濃度為5 mg/L的內(nèi)標工作溶液，即萃取溶液。

分別稱取酸類標準品各0.05 g置于不同的5 mL容量瓶中，用優(yōu)選溶劑定容，配制成10 000 mg/L的標準單標儲備液；分別準確移取適量標準單標儲備液于50 mL容量瓶中，用優(yōu)選溶劑定容，配制10 mg/L、200 mg/L的混標儲備溶液；分別準確移取適量200 mg/L混標儲備溶液和125 μL內(nèi)標儲備液于25 mL容量瓶中配制5 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的混標工作溶液，用優(yōu)選溶劑定容；分別準確移取適量10 mg/L混標儲備溶液和125 μL內(nèi)標儲備液于25 mL容量瓶中配制0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.00 mg/L、25.00 mg/L、50.00 mg/L的混標工作溶液，用優(yōu)選溶劑定容；所有標準混合工作溶液即配即用。

1.3 樣品前處理

煙絲加香樣品制備：為防止煙絲加香成分揮發(fā)散失，將基準煙支樣品在(22±2)℃和相對濕度(60±2)%條件下平衡48 h，取出卷煙，常規(guī)煙、中支煙和細支煙按對應規(guī)格的添加量將爆珠油用微量注射器注入基準煙支煙絲中，注射完畢，迅速使用吸煙機在ISO 3308標準[11]條件下進行抽吸。

爆珠加香樣品制備：將卷煙樣品置于溫度(22±1)℃、相對濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱中平衡48 h后進行抽吸，在抽吸之前激活爆珠。

爆珠樣品中的酸類成分提取：隨機取1顆爆珠于頂空瓶中，用1 mL一次性注射器壓破爆珠，加入10 mL萃取溶液，使用注射器抽吸混勻后，超聲萃取30 min，萃取液過0.22 μm濾膜，待衍生化處理。

氣溶膠捕集：捕集5支卷煙煙氣至兩張劍橋濾片上，將劍橋濾片置于50 mL離心管中，加入15 mL萃取溶液，超聲萃取30 min，然后用0.22 μm的有機濾膜過濾，待衍生化處理。

1.4 衍生化處理及其條件優(yōu)化

各類樣品衍生化前處理：準確移取500 μL樣品萃取液，加入適量BSTFA，密封處理后置于適宜溫度中反應60 min進行GC-MS分析。

衍生化溫度優(yōu)化：準確移取500 μL的50 mg/L標準溶液置于進樣瓶中，加入20 μL BSTFA，分別在45 ℃、60 ℃、75 ℃、100 ℃和115 ℃溫度下進行衍生化處理后，進行GC-MS分析，以總峰面積和出峰個數(shù)比較溶劑的萃取效果，確定衍生化適宜溫度。

萃取液與衍生化試劑體積比例優(yōu)化：以同一種卷煙煙絲為實驗對象，超聲萃取30 min后，取500 μL萃取液置于進樣瓶中，分別加入15 μL、20 μL、50 μL的衍生化試劑BSTFA，封口，適宜溫度水浴反應1 h，進行GC-MS分析，以總峰面積和出峰個數(shù)比較溶劑的萃取效果，確定萃取液與衍生化試劑適宜體積比。

1.5 GC-MS分析條件

GC分析條件：DB-5MS彈性石英毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度280 ℃；載氣氦氣(≥99.999%)；恒流模式1 mL/min；進樣量1 μL；分流比5∶1。升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min速率由50 ℃升至200 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

MS分析條件：電離方式EI，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，溶劑延遲3.5 min，掃描模式為全掃描和選擇離子模式(SIM)，全掃描質(zhì)量掃描范圍30～500 amu，特征化合物的選擇離子參數(shù)見表1。

表1 特征化合物的選擇離子參數(shù)Table 1 Selective ion parameters of characteristic compounds

1.6 標準工作曲線的建立

標準系列工作溶液的GC-MS分析按照色譜條件進行，用內(nèi)標法定量。根據(jù)酸類化學成分標樣的定量離子峰面積與內(nèi)標峰面積的比值及標準工作溶液中目標物與內(nèi)標物質(zhì)量濃度的比值，使用Agilent MassHunter定量分析軟件處理實驗數(shù)據(jù)，并建立標準工作曲線。對每個物質(zhì)的最低質(zhì)量濃度標準溶液平行測定10次，計算測定值的標準偏差，以標準偏差的3倍作為方法檢出限，以標準偏差的10倍作為方法定量限；根據(jù)已知含量的樣品，分別按照低、中、高3個水平在劍橋濾片上加入標準溶液進行加標回收率的測定，每個水平平行測定5次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)，以RSD結(jié)果評價方法重復性。

1.7 有機酸轉(zhuǎn)移行為評價方法

根據(jù)1.5中方法測試不同加香方式下3種有機酸向不同圓周卷煙樣品主流煙氣粒相物中的轉(zhuǎn)移量，按下式計算有機酸主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率T：

其中,M為加香樣品抽吸后粒相物中有機酸的含量/(μg·支-1)；M0為空白樣品抽吸后粒相物中有機酸的含量/(μg·支-1)；W為有機酸在卷煙中的添加量/(μg·支-1)。

本文實驗方法的萃取環(huán)境為酸性，文獻[12]中總煙堿的測定是通過加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值進行的，因此此處僅考慮煙氣中以有機酸形態(tài)存在的酸的轉(zhuǎn)移率，不考慮結(jié)合為煙堿鹽部分的酸的轉(zhuǎn)移。

1.8 有機酸嗅覺貢獻度和味覺貢獻度分析方法

3種有機酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率主要以其含量為基礎反映香氣成分在卷煙加香中的利用率，并未綜合考慮其對感官效應的影響。與卷煙抽吸感受密切相關的是嗅覺和味覺，為了更加全面地表征不同香料在卷煙中的作用，筆者在主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率基礎上結(jié)合嗅覺閾值評價3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度。根據(jù)各酸類單體香料通過煙絲加香或爆珠加香后的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率和嗅覺閾值[13]，計算該酸類香料的嗅覺貢獻度，計算公式如下：

味覺貢獻度是在主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率基礎上，結(jié)合味覺閾值提出的，可以更全面地反映香料引發(fā)的味覺感官效應。根據(jù)各酸類單體香料通過煙絲加香或爆珠加香后的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率和味覺閾值[13]，計算該酸類香料的味覺貢獻度，計算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化結(jié)果與分析

二氯甲烷、DMF和無水吡啶3種萃取溶劑優(yōu)化結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，對于辛酸和癸酸，二氯甲烷的萃取效果最好；對于戊酸，二氯甲烷萃取效果略低于無水吡啶。綜合考慮，選取二氯甲烷為萃取溶劑。

圖1 萃取溶劑優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Investigation results of extraction solvent

衍生化溫度的優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，75 ℃時，戊酸和癸酸的出峰面積最大，但雜峰較多；60 ℃時，辛酸的出峰面積最大，戊酸和癸酸的出峰面積略低于75 ℃，但3種峰的峰形較好，雜峰干擾較少。因此選取60 ℃為衍生化溫度。

圖2 衍生化溫度優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Investigation results of derivatization temperature

萃取液與衍生化試劑體積比優(yōu)化結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當萃取液與衍生化試劑的體積比為25∶1時，3種有機酸都能檢出，因此選取25∶1為萃取液與衍生化試劑體積比例。

圖3 萃取液與衍生化試劑體積比優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Investigation results of volume ratio of extraction solution to derivatization reagent

在優(yōu)化的前處理條件下，選擇離子模式(SIM)下3種有機酸混合標準溶液的GC-MS譜圖如圖4所示，典型煙氣樣品的GC-MS譜圖如圖5所示。由圖4和圖5可知，該處理條件下，選取的特征離子選擇性好，抗干擾能力強，可實現(xiàn)3種有機酸的有效分離，適合復雜基質(zhì)樣品的定性定量分析。3種有機酸的檢測方法評價結(jié)果如表2所示。由表2可知，3種有機酸相關系數(shù)R2均大于0.99，表明在其各自的線性范圍內(nèi)線性關系良好，檢出限為0.018 2～0.032 3 mg/L，定量限為0.060 8～0.107 8 mg/L，重復性為0.87%～1.42%，回收率為80%～120%，在該優(yōu)化條件下測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖4 選擇離子模式(SIM)下3種有機酸混合標準溶液的GC-MS譜圖Fig.4 GC-MS chromatograms of three keyacids mixed standard solutions components under SIM mode

圖5 選擇離子模式(SIM)下典型煙氣樣品的GC-MS譜圖Fig.5 GC-MS chromatograms of typical cigarette smoke samples under SIM mode

表2 3種有機酸的檢測方法評價結(jié)果Table 2 Evaluation results of detection methods for three acids

2.2 有機酸在不同加香方式下的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率

3種有機酸在不同加香方式下的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率結(jié)果如圖6所示。由圖6并結(jié)合3種有機酸的物化參數(shù)(見表3)可得如下結(jié)果。1)爆珠加香方式下，隨著3種有機酸的相對分子質(zhì)量減小，沸點降低，主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率升高；煙絲加香方式下，在細支煙中戊酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率較高，其他規(guī)格卷煙中的戊酸、辛酸、癸酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率皆隨相對分子質(zhì)量增大、沸點升高而增高。2)對于揮發(fā)性有機酸(戊酸)，在3種圓周卷煙中爆珠加香的轉(zhuǎn)移率皆高于煙絲加香，兩種加香方式下主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率的大小順序均為細支煙>中支煙>常規(guī)煙；對于半揮發(fā)性有機酸(辛酸、癸酸)，在3種圓周卷煙中煙絲加香的轉(zhuǎn)移率皆高于爆珠加香，爆珠加香下兩種酸轉(zhuǎn)移率的大小順序是常規(guī)煙>中支煙>細支煙，煙絲加香下兩種酸主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率的大小順序是細支煙>中支煙>常規(guī)煙。根據(jù)上述結(jié)果可知，兩種加香方式下有機酸類香料的揮發(fā)性和卷煙煙支主流煙氣的流速都是影響主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率的重要因素。爆珠加香中，香料受熱溫度較低，沸點越低、相對分子質(zhì)量越小的揮發(fā)性有機酸類香料,越有利于提高主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率；煙絲加香中，香料受熱溫度較高，沸點越高、相對分子質(zhì)量越大的半揮發(fā)性有機酸類香料,越有利于提高主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率，這與蔡君蘭等[14]的研究結(jié)果一致。不同煙絲加香方式下，揮發(fā)性及半揮發(fā)性有機酸都是在細支煙中的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率最高，可能是因為細支煙的圓周截面較小，抽吸時的煙氣流速較快，關鍵成分在濾嘴中駐留時間較短，濾嘴對其過濾效率較低[15-17]。爆珠加香方式下半揮發(fā)性有機酸的轉(zhuǎn)移率隨煙支圓周的增大而增大，這可能是因為隨著有機酸揮發(fā)性的降低，煙支流速成為影響主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率的關鍵因素。在常規(guī)煙支中，爆珠粒徑較大，捏破爆珠后濾棒中的空腔在3種規(guī)格的卷煙中也是最大的，主流煙氣在濾嘴中受到的阻力減小從而流速增快，煙氣溫度更高[18-19]，進而使轉(zhuǎn)移率增大。

圖6 3種有機酸在不同加香方式下的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率Fig.6 Calculation results of transfer rate of three acids under different flavoring methods

2.3 3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度

3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度如圖7所示。由圖7可以看出：1)兩種加香方式下,3種有機酸類香料的嗅覺貢獻度排序嗅覺貢獻度高度一致；2)爆珠加香方式下，嗅覺貢獻度大小順序是辛酸>戊酸>癸酸，辛酸的轉(zhuǎn)移能力約為戊酸的0.2～0.6倍，但能帶來的嗅覺效果卻遠遠高于戊酸，其嗅覺貢獻度約為戊酸的13～42倍；3)煙絲加香方式下，嗅覺貢獻度大小順序是辛酸>戊酸>癸酸，辛酸的轉(zhuǎn)移能力約為戊酸的0.5～2倍，但其嗅覺貢獻度約為戊酸的32～115倍，帶來的嗅覺效果遠遠高于戊酸，此外辛酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率與癸酸相近，但嗅香貢獻度卻存在200倍左右的差距。

圖7 3種有機酸在不同加香方式下的嗅覺貢獻度Fig.7 Calculation results of olfactory contribution of three acids under different flavoring methods

可見，兩種加香方式下，不同圓周的煙支中，辛酸的嗅覺貢獻度在3種有機酸中都是最佳的?！墩{(diào)香術》[20]中通過綜合分、香比強值、香品值和留香值評價香料的優(yōu)劣，綜合分反映的是香料的香氣強度、留香效果和香氣品質(zhì)的綜合評價值，分值越高，香料的綜合質(zhì)量越好；香比強值反映的則是香料的香氣強度，強度越大，配方中需要使用的香料含量越少。從3種有機酸的感官信息(見表3)可以看出，辛酸和癸酸的綜合得分相同，但癸酸的香比強值較低，即癸酸需要較高的添加量和主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率才能達到與辛酸相同的加香效果。轉(zhuǎn)移行為研究中發(fā)現(xiàn)，爆珠加香時辛酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率略高于癸酸，煙絲加香時辛酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率略低于癸酸，但兩種加香方式下辛酸的嗅覺貢獻度都遠高于癸酸，可知辛酸在3種有機酸中的加香效果最佳，與文獻[20]中的評價結(jié)果一致。

表3 3種有機酸的物化參數(shù)及感官信息Table 3 Physicochemical parameters and sensory information of 3 acids

2.4 3種有機酸在不同加香方式下的味覺貢獻度

3種有機酸在不同加香方式下的味覺貢獻度如圖8所示。由圖8可以看出，爆珠加香方式下，主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率與味覺貢獻度排序相同，都是戊酸>辛酸>癸酸，戊酸的轉(zhuǎn)移能力約為辛酸的1.5～5倍、癸酸的4～20倍，但戊酸的味覺閾值較辛酸和癸酸小，綜合該因素計算后發(fā)現(xiàn)戊酸的味覺貢獻度為辛酸的300～960倍、癸酸的650～2800倍，感官效應增加明顯；煙絲加香方式下，主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率的排序是癸酸>辛酸>戊酸(除細支煙的戊酸較高外)，味覺貢獻度卻是戊酸>癸酸>辛酸，常規(guī)煙和中支煙中戊酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率雖然最低，但卻能帶來較好的味覺效果。

圖8 3種有機酸在不同加香方式下的味覺貢獻度Fig.8 Calculation results of taste contribution of three acids under different flavoring methods

可見，不論何種加香方式、何種圓周的卷煙，戊酸的味覺貢獻都是相當明顯的，冒德壽等[21]通過味覺活力值分析鑒定出煙氣中的關鍵酸味物質(zhì)為甲酸、乙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、乳酸和琥珀酸，冒德壽等[21]和本文中的研究結(jié)果都顯示,戊酸是煙氣酸味的主要來源。對比3種有機酸的嗅覺貢獻度與味覺貢獻度的比值發(fā)現(xiàn)，戊酸、辛酸和癸酸對煙氣的感官貢獻都主要以嗅覺效應為主，辛酸和癸酸的嗅覺效應尤為突出。范武等[22]對乙酸、丁酸、異戊酸和戊酸的嗅覺與味覺貢獻度進行比較發(fā)現(xiàn)，這些酸香成分的感官貢獻以嗅覺效應為主，這與本文中戊酸的主要感官效果一致。

3 結(jié)論

本文研究了在煙絲加香和爆珠加香兩種加香方式下，戊酸、辛酸、癸酸3種有機酸在不同圓周卷煙中的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率，并結(jié)合嗅覺閾值、味覺閾值定義嗅覺貢獻度和味覺貢獻度,得到如下結(jié)論。1)在兩種不同加香方式和不同圓周的卷煙中，就主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率大小而言，揮發(fā)性有機酸(戊酸)更適合采用爆珠加香的添加方式，半揮發(fā)性有機酸(辛酸、癸酸)更適合采用煙絲加香的添加方式。2)在不同加香方式下，揮發(fā)性有機酸都是在細支煙的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率最高，煙絲加香方式下半揮發(fā)性有機酸在細支煙的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率最高，爆珠加香方式下半揮發(fā)性有機酸的主流煙氣粒相轉(zhuǎn)移率則隨煙支圓周的增大而增大。3)不同加香方式和不同圓周的卷煙中，辛酸的嗅覺貢獻度最佳，戊酸的味覺貢獻度最佳，3種有機酸的感官貢獻都是以嗅覺效應為主。本研究可為卷煙產(chǎn)品香料配方設計提供數(shù)據(jù)支撐。