高薇，王秀，李見(jiàn)春，涂密密，高菲，徐峰，王玉帥

蚌埠醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蚌埠 233030

0 引言

太平猴魁是我國(guó)十大名茶之一，因其獨(dú)特的品質(zhì)深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)，成為國(guó)茶珍品。該茶的核心產(chǎn)地為黃山市黃山區(qū)新明鄉(xiāng)猴坑、猴崗、顏家3個(gè)自然村落的鳳凰尖、獅彤山、雞公尖一帶，不同產(chǎn)地和等級(jí)的太平猴魁色、香、味及口感各有差異。市場(chǎng)上不同品質(zhì)的太平猴魁價(jià)格懸殊，從幾百元500 g到幾千元500 g不等。在利益的驅(qū)使下，一些不法商人以非核心產(chǎn)地茶假冒核心產(chǎn)地茶，坑騙廣大消費(fèi)者以獲取暴利，嚴(yán)重影響了太平猴魁品牌的信譽(yù)。近年來(lái)，茶葉地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品越來(lái)越多，國(guó)家工商總局、農(nóng)業(yè)部等部門(mén)也對(duì)地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品實(shí)行不同的管理和保護(hù)模式[1-2]。太平猴魁作為我國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，尋找簡(jiǎn)單、可靠的分析方法對(duì)原產(chǎn)地與非原產(chǎn)地產(chǎn)品進(jìn)行鑒別，對(duì)維護(hù)生產(chǎn)者和消費(fèi)者的權(quán)益具有重要意義。

傳統(tǒng)的茶葉鑒別方法是通過(guò)茶葉的外形、湯色、香氣、滋味與葉底進(jìn)行判斷，這種方法易受人為因素及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)的影響，且鑒定結(jié)果無(wú)法量化[3-5]。而基于指紋圖譜及多元統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)學(xué)模型具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力，在食品檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。張俊杰等[6]通過(guò)構(gòu)建分子指紋圖譜實(shí)現(xiàn)了對(duì)福建不同茶品種的鑒別。陳琦等[7]開(kāi)發(fā)了一種基于元素及近紅外分析的方法，可對(duì)來(lái)自6個(gè)產(chǎn)地的太平猴魁樣品進(jìn)行產(chǎn)區(qū)甄別，但無(wú)法進(jìn)行產(chǎn)地甄別。雷攀登等[8]對(duì)采集自不同產(chǎn)地的13種太平猴魁中的水浸出物、游離氨基酸、咖啡堿、茶多酚含量進(jìn)行了分析測(cè)定，并利用GC-MS進(jìn)行香氣成分分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的太平猴魁香氣成分差異較大，但未明確對(duì)品質(zhì)起關(guān)鍵作用的特征成分。楊停等[9]采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合主成分分析(PCA)法對(duì)3個(gè)產(chǎn)地7種太平猴魁香氣成分進(jìn)行分析，共鑒定出了29種特征香氣成分。

高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜是一種簡(jiǎn)單高效、應(yīng)用廣泛的指紋圖譜檢測(cè)方法，可分析鑒定茶葉中的兒茶酚類(lèi)、沒(méi)食子酸、嘌呤生物堿、茶氨酸等36種成分[10]。目前，HPLC指紋圖譜已被用于多種名優(yōu)茶產(chǎn)品(如龍井茶、烏龍茶、普洱茶、大紅袍、紫陽(yáng)毛尖茶等)的品質(zhì)控制[11-15]，但關(guān)于太平猴魁指紋圖譜的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。多元統(tǒng)計(jì)分析是研究多變量問(wèn)題的常用方法，主要包括PCA、判別分析、偏最小二乘回歸分析(OPLS-DA)、因子分析等，該方法在茶葉產(chǎn)地溯源和鑒別方面應(yīng)用廣泛[16]。本研究擬對(duì)來(lái)自核心產(chǎn)地(新明鄉(xiāng)猴坑、猴崗和顏家)的太平猴魁進(jìn)行HPLC指紋譜圖相似度評(píng)價(jià)，并對(duì)來(lái)自核心產(chǎn)地與非核心產(chǎn)地(龍門(mén)鄉(xiāng)東坑和汪王嶺)太平猴魁進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，以期開(kāi)發(fā)一種快速、高效的太平猴魁產(chǎn)地判別方法，用于太平猴魁的品質(zhì)鑒定與評(píng)價(jià)，為核心產(chǎn)地太平猴魁的鑒別提供理論依據(jù)。

1 樣品溶液制備

1.1 供試樣品溶液制備

將從不同核心產(chǎn)地(新明鄉(xiāng)猴坑(S1—S4)、猴崗(S5—S7)、顏家(S8—S10))采摘的一芽二葉或一芽三葉新鮮太平猴魁茶葉采用傳統(tǒng)手工加工方式(揀尖、攤放、殺青、理?xiàng)l、整形、毛烘、足烘、復(fù)焙)制作太平猴魁。將制得的太平猴魁成品用小型高速粉碎機(jī)(WK-1000A型，重慶瑞仟順制藥設(shè)備有限公司產(chǎn))粉碎，精密稱(chēng)取1.0 g置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(IKARV10 型，上海人和科學(xué)儀器有限公司產(chǎn))的100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，于85 ℃條件下加熱回流提取兩次，每次30 min；合并濾液并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻后過(guò) 0.45 μm微孔濾膜，收集的濾液即為供試樣品溶液。按產(chǎn)地標(biāo)注供試樣品溶液，備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

分別稱(chēng)取適量標(biāo)準(zhǔn)品(沒(méi)食子酸(GA)、5-沒(méi)食子?；鼘幩?5-GC)和沒(méi)食子兒茶素(GC)，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)；可可堿(TB)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、兒茶素(Cat)、表兒茶素(EC)、咖啡因(Caf)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(GCG)和表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)，南京源植生物科技有限公司產(chǎn))，利用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液超聲溶解后，配制成質(zhì)量濃度分別為0.204 mg/mL、0.198 mg/mL、0.226 mg/mL、0.236 mg/mL、0.218 mg/mL、0.210 mg/mL、0.231 mg/mL、1.056 mg/mL、1.126 mg/mL、0.228 mg/mL和0.308 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液；分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品母液0.05 mL、0.25 mL、1.00 mL、5.00 mL，置于10 mL容量瓶中，以體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液稀釋至刻度線(xiàn)，將混合標(biāo)準(zhǔn)品母液和稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品母液各取10 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品均重復(fù)檢測(cè)3次，以色譜峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 HPLC檢測(cè)方法優(yōu)化

筆者前期對(duì)HPLC分析方法進(jìn)行了很多摸索，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，EGC和Cat的色譜峰重疊，而單獨(dú)使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)，GC和TB無(wú)法完成分離，即使高效液相色譜儀(包括Waters 1525二元梯度泵、Waters 2998 PDA型檢測(cè)器和2707 waters自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司產(chǎn))改變洗脫條件或更換不同型號(hào)(包括ZORBAX SAX、YMC-Pack ODS-AM、Sunfire C-18、Watchers 120 ODS-AP、Discovery?C18、Acclaim 120等)色譜柱，均不能達(dá)到很好的分離效果(如圖1所示)。

圖1 前期HPLC色譜圖Fig.1 Preliminary HPLC chromatograms注：1為GA，2為5-GC，3為GC，4為T(mén)B，5為EGC，6為Cat，7為EC，8為Caf，9為EGCG，10為GCG，11為ECG，下同。

為了檢測(cè)太平猴魁中的11種主要成分(GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG和ECG)，并使各成分獲得較好的分離度，在前期研究的基礎(chǔ)上，筆者選擇甲醇和乙腈的混合溶液作為有機(jī)相進(jìn)行洗脫。水相(A)確定為體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液，有機(jī)相(B)確定為甲醇和乙腈混合溶液(V(甲醇)∶V(乙腈)=65∶35)，色譜條件確定為：0～3 min，5% B；3～8 min，5%～15% B；8～20 min，15%～30% B；20～32 min，30%～50% B；32～35 min，50%～95% B；35～38 min，95% B；38～41 min，95%～5% B；41～45 min，5% B。另外，設(shè)定流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。在此條件下，太平猴魁中的11種主要成分可實(shí)現(xiàn)很好的分離，分離度均大于1.5，且峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)拖尾現(xiàn)象(見(jiàn)圖2)。

圖2 優(yōu)化后的太平猴魁HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of Taiping Houkui after optimization

3 HPLC檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

3.1 線(xiàn)性關(guān)系評(píng)價(jià)

太平猴魁中各待測(cè)成分的線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，所有回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 9，表明在質(zhì)量濃度檢測(cè)范圍內(nèi)，11種成分的線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 太平猴魁中各待測(cè)成分的線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear regression data of the analytes in Taiping Houkui

3.2 精密度評(píng)價(jià)

精密吸取同一質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法重復(fù)檢測(cè)6次，記錄各成分的色譜峰面積及相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，11種待測(cè)成分的色譜峰面積RSD介于0.31%～1.39%之間，保留時(shí)間RSD介于0.27%～0.55%之間，表明優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法精密度良好。

3.3 重復(fù)性評(píng)價(jià)

以S1為例，取樣品溶液6份，按優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法分別進(jìn)行定量分析，并以外標(biāo)法計(jì)算11種待測(cè)成分含量及其RSD。結(jié)果顯示，S1的GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG平均含量分別為0.11 μg/g、1.99 μg/g、1.39 μg/g、0.51 μg/g、40.90 μg/g、1.60 μg/g、8.37 μg/g、18.15 μg/g、49.24 μg/g、0.21 μg/g和12.23 μg/g，RSD介于0.94%～1.92%之間，表明優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

以S1為例，取樣品溶液于室溫放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h，按優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法分別進(jìn)行定量分析，計(jì)算可得11種待測(cè)成分色譜峰面積RSD在0.26%～3.75%范圍內(nèi)，表明供試樣品溶液在室溫條件下放置48 h內(nèi)的主要成分含量穩(wěn)定。

3.5 回收率評(píng)價(jià)

以S1為例，取樣品9份，每份約1.0 g，分成3組，分別精密加入含GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL、2.0 mL、5.0 mL，按1.1所述方法制備供試樣品溶液，然后按優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法分別進(jìn)行定量分析，計(jì)算11種待測(cè)成分的平均加標(biāo)回收率及其RSD。結(jié)果顯示，GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG的平均加標(biāo)回收率分別為98.0%、101.6%、98.7%、99.5%、100.7%、99.1%、102.4%、100.4%、99.8%、99.2%、99.0%；RSD分別為2.5%、4.1%、2.6%、1.9%、2.9%、3.6%、2.8%、1.7%、2.3%、3.7%、2.6%。這表明優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法具有較好的回收率。

4 HPLC指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

鑒于優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和較好的回收率，可用于核心產(chǎn)地太平猴魁的定量分析，取S1-S10樣品溶液，利用外標(biāo)法計(jì)算其11種主要成分含量(見(jiàn)表2)，并記錄HPLC色譜圖。

表2 核心產(chǎn)地太平猴魁中11個(gè)主要成分含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Contents of 11 analytes in Taiping Houkui from core producing area mg/g

將10種太平猴魁供試樣品的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)進(jìn)行分析，以S1色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)定為0.3 s，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后得到太平猴魁HPLC指紋圖譜，如圖3所示。由圖3可知，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間比對(duì)，共鑒定出11個(gè)共有峰，分別為GA、5-GC、GC、TB、EGC、Cat、EC、Caf、EGCG、GCG、ECG，其中，Caf出峰時(shí)間適中、峰面積較大、對(duì)稱(chēng)性較好，可將其作為參照峰，分別計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算相應(yīng)的RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.73%，相對(duì)峰面積RSD均小于15.30%，表明本研究建立的HPLC指紋圖譜是一種穩(wěn)定的、重現(xiàn)性較好的方法，可以用于評(píng)定太平猴魁的品質(zhì)。EGCG的相對(duì)峰面積RSD>15%，表明該成分在不同樣品中的差異較大，這可能是因?yàn)樵诩庸み^(guò)程中EGCG發(fā)生了不同程度的降解[17-18]。

表3 太平猴魁HPLC指紋圖譜的11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積Table 3 Relative retention time and relative peak area of 11 common peaks in HPLC fingerprints of Taiping Houkui

圖3 核心產(chǎn)地太平猴魁的HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of Taiping Houkui from core producing area

將太平猴魁樣品的HPLC指紋圖譜分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，計(jì)算各樣品的指紋圖譜與對(duì)照色譜圖(S1)之間的相似度。結(jié)果顯示，各太平猴魁相似度為0.982～0.992，表明這10種太平猴魁樣品的品質(zhì)成分相似，建立的HPLC指紋圖譜可以作為太平猴魁的參考指紋信息用于鑒定和評(píng)價(jià)太平猴魁的品質(zhì)。

5 多元統(tǒng)計(jì)分析

5.1 PCA結(jié)果分析

為判別不同產(chǎn)地太平猴魁的品質(zhì)差異，從非核心產(chǎn)地龍門(mén)鄉(xiāng)東坑(D1—D4)和汪王嶺(W1—W4)兩地各取樣4種，按照1.1方法制備非核心產(chǎn)地供試樣品，并按優(yōu)化后的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)樣定量分析。采用UV scaling法將定量分析結(jié)果與核心產(chǎn)地太平猴魁樣品定量分析結(jié)果進(jìn)行歸一化處理，并導(dǎo)入Simca-P 14.1軟件進(jìn)行PCA分析。通過(guò)PCA分析所提取的2個(gè)主成分PC1和PC2的累計(jì)貢獻(xiàn)率為63.9%，可反映太平猴魁主要成分含量的大部分信息。不同產(chǎn)地太平猴魁的PCA得分圖如圖4所示。

由圖4可知，來(lái)自核心產(chǎn)地與非核心產(chǎn)地的太平猴魁樣品在PCA中實(shí)現(xiàn)了較好的分離，各樣品在圖中按照產(chǎn)地聚集，表明利用PCA分析可以有效區(qū)分不同產(chǎn)地太平猴魁。

圖4 不同產(chǎn)地太平猴魁的PCA得分圖Fig.4 PCA score plot of Taiping Houkui tea from different producing areas

5.2 OPLS-DA結(jié)果分析

PCA分析是一種無(wú)監(jiān)督的模型驗(yàn)證方法，不能消除組內(nèi)噪音，而OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析方式，更能突出組間差異[19]。采用Simca-P 14.1軟件對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的太平猴魁主要成分含量進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，不同產(chǎn)地太平猴魁均按其產(chǎn)地聚為一類(lèi)。擬合模型R2X=0.635，R2Y=0.891，Q2=0.802，均大于0.5，表明該模型擬合效果較好，預(yù)測(cè)結(jié)果可靠，可用于對(duì)太平猴魁產(chǎn)地進(jìn)行判別。變量重要性投影值(Variable Importance in Projection，VIP)常用來(lái)衡量各變量對(duì)各組樣本分類(lèi)判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，其值越大，代表變量越重要，一般以VIP>1的變量作為生物標(biāo)志物。不同產(chǎn)地太平猴魁OPLS-DA模型中不同變量的VIP如圖6所示。由圖6可知，11種主要成分中共篩選出6種生物標(biāo)志物，即EC、GC、Cat、TB、EGC和Caf可作為區(qū)分太平猴魁是否來(lái)自核心產(chǎn)地的特征性成分。

圖5 不同產(chǎn)地太平猴魁OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA score plot of Taiping Houkui tea from different producing areas

圖6 不同產(chǎn)地太平猴魁OPLS-DA模型中不同變量的VIP Fig.6 VIP of different variable in OPLS-DA model for Taiping Houkui from different producing areas

6 結(jié)論

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)太平猴魁的HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，基于前期甲醇和乙腈單獨(dú)作為有機(jī)相時(shí)均不能很好實(shí)現(xiàn)成分分離的問(wèn)題，最終確定流動(dòng)相中水相A為體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液，有機(jī)相B為甲醇和乙腈混合溶液(V(甲醇)∶V(乙腈)=65∶35)，在此條件下，HPLC色譜圖中11種化合物各峰無(wú)干擾，分離度均大于1.5，且峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)拖尾現(xiàn)象，該方法具有良好的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和較好的回收率。核心產(chǎn)地10種太平猴魁的HPLC指紋圖譜中，11種主要成分的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.73%，相似度為0.982～0.992，表明本文建立的HPLC指紋圖譜是一種穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好的方法，可以作為太平猴魁品質(zhì)評(píng)定的可靠方法。利用PCA對(duì)不同產(chǎn)地太平猴魁樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自核心產(chǎn)地與非核心產(chǎn)地的樣品分別聚集成類(lèi)，提取得到兩個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)63.9%，可反映太平猴魁主要成分含量的大部分信息。進(jìn)一步的OPLS-DA分析則顯示了該方法較為可靠的產(chǎn)地預(yù)測(cè)能力，通過(guò)各成分VIP的確定發(fā)現(xiàn)EC、GC、Cat、TB、EGC、Caf這6種成分在不同產(chǎn)地樣品中差異較大，可作為區(qū)分是否來(lái)自核心產(chǎn)地的特征成分。該研究可為太平猴魁的產(chǎn)地判別和品質(zhì)鑒定提供參考，為進(jìn)一步完善太平猴魁品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。