劉晨，王禎，朱先約，王文婷，黃申，翟玉俊

1.甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730050；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

烤煙致香前體物質(zhì)種類繁多，多酚類化合物尤為重要，在一定程度上決定著烤煙的香氣風(fēng)格[1]；同時(shí)，在煙葉生長(zhǎng)、醇化和吸食燃燒過(guò)程中，其黃酮類化合物蕓香苷的含量同樣會(huì)直接影響烤煙的香氣質(zhì)量[2]。有研究表明,黃酮類化合物是影響煙草內(nèi)在品質(zhì)最為關(guān)鍵的因素之一，其含量大小對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所參與的防御、抗逆機(jī)制起到至關(guān)重要的作用[3-5]。

肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)是多酚類化合物苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其作用是將苯丙氨酸催化為香豆酸，香豆酸再經(jīng)過(guò)4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaroyl CoA Ligase,4CL)處理，進(jìn)一步生成香豆酰輔酶A。研究表明，植物中黃酮類化合物、木質(zhì)素、芳香族類化合物合成等多條代謝途徑會(huì)隨著C4H蛋白質(zhì)活性和轉(zhuǎn)錄豐度的變化而發(fā)生變化[6]。大豆中C4H 蛋白的減少會(huì)直接導(dǎo)致苯丙烷類物質(zhì)含量明顯降低，木質(zhì)化進(jìn)程受阻，嚴(yán)重干擾植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[7]。因此，C4H蛋白在植物細(xì)胞中的含量變化會(huì)對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素和黃酮類物質(zhì)合成的多條代謝支路產(chǎn)生直接影響[8]。

目前，C4H 蛋白家族成員中的C4H2基因已在擬南芥、大豆、桂花等多種植物中進(jìn)行了克隆研究[9-12]。于利等[13]利用同源克隆技術(shù)成功從煙草中克隆出C4H基因家族，比較了C4H1與C4H2在HD和K326兩個(gè)煙草品種各組織器官及不同生育期中部葉中的表達(dá)差異性。但關(guān)于C4H2基因在煙草中的遺傳組成、表達(dá)特性和作用方式等更為細(xì)致、完整的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，其基因表達(dá)量與煙草中黃酮含量的相關(guān)性也有待研究。

鑒于此，本文擬通過(guò)對(duì)煙草C4H2基因進(jìn)行克隆、序列分析，進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建、純化，實(shí)現(xiàn)其體外融合表達(dá)并進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，以探究在激素誘導(dǎo)調(diào)控下不同組織NtC4H2(煙草C4H2)基因的表達(dá)水平與總黃酮含量變化趨勢(shì)的相關(guān)性，為該基因在煙草黃酮類化合物生物合成中的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

中煙202及其無(wú)菌幼苗，來(lái)自甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

主要儀器：QIAcube核酸提取儀、QIAxceL Advanced全自動(dòng)電泳分析儀，德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)；Qubit熒光定量?jī)x，美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)；LightCycler 96熒光定量PCR儀，美國(guó) Roche公司產(chǎn)；水平電泳儀、Geldoc EZ凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)；PCR儀、離心機(jī)、德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)；MiniSeq高通量測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司產(chǎn)；HD3100超聲波細(xì)胞破碎儀，德國(guó) WIGGENS公司產(chǎn)；Cary60紫外分光光度計(jì)，美國(guó) Agilent公司產(chǎn)。

主要試劑：RNeasy Plant Mini Kit，德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)；1st Stand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq Hot Start Version、PCR Mix，日本TaKaRa公司產(chǎn)；Mini Seq High Output Library Prep Kit，美國(guó)Illumina公司產(chǎn)；EDTA，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司產(chǎn)；胰蛋白胨、酵母抽提物，英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)；IPTG，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA合成總 RNA 的提取。稱取0.2 g中煙202無(wú)菌幼苗葉片組織，加無(wú)菌水清洗；液氮研磨；加入1 mL TRizol，混勻轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中；加200 μL 氯仿，混勻，12 000 r/min離心15 min；移取上清，加600 μL 異丙醇，充分混勻，于-20 ℃靜置45 min后，12 000r/min離心15 min；棄上清，加1 mL RNA專用體積分?jǐn)?shù)為75%的預(yù)冷乙醇，混勻，12 000 r/min離心10 min；室溫下靜置10～15 min，使RNA 適度干燥；用不含RNase的去離子水溶解，取2 μL 測(cè)定濃度。

cDNA合成。合成反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA 0.5 μg，Nuclease-free water補(bǔ)足10 μL；反應(yīng)參數(shù)為42 ℃、2 min。逆轉(zhuǎn)錄體系：去基因組反應(yīng)液10 μL，5×primer Script Buffer 4 μL，RT Enzyme Mix1 1 μL，RT primer 1 μL，Nuclease-free water補(bǔ)足20 μL；反應(yīng)參數(shù)為37 ℃、60 min，85 ℃、5 s。以得到的cDNA為模板，進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.2.2 煙草C4H2-CDS區(qū)的克隆根據(jù)NCBI馬鈴薯C4H2基因序列(ABC69 046.1)篩選出CDS區(qū)序列，使用DNAStar軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers used in the NtC4H2 cloning

PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板 5 μL，Primer Mix 2 μL，LA TAQ PCR Mix 10 μL，Nuclease-free water 3 μL，補(bǔ)充dd H2O至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，55 ℃、40 s，72 ℃、60 s，40 cycle；72 ℃、10 min；4 ℃保存。將上述目標(biāo)CDS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳割膠回收后進(jìn)行TA克隆，與大腸桿菌Top10連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽(yáng)性克隆。使用MiniSeq High Output Library Prep Kit 試劑盒，在IlluminaMiniSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析利用DNAMAN 7分析預(yù)測(cè)NtC4H2基因編碼的蛋白并進(jìn)行同源序列比對(duì)；ProtParam和ProtScaLe用于氨基酸理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)親/疏水性分析；SignalP用于分析蛋白是否含有信號(hào)肽；TMHMMserver2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預(yù)測(cè)；PredictProtein和CD search對(duì)蛋白質(zhì)的保守域和功能位點(diǎn)進(jìn)行分析；SOPMA和SWISS-MODEL分別用于蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析、預(yù)測(cè)。

1.2.4NtC4H2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)NtC4H2基因的測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)分析結(jié)果，將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌落進(jìn)行T-C4H2-CDS質(zhì)粒抽提，并與pET22b質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)粒1 μg；10×H 3 μL；XhoⅠ1 μL；EcoRⅠ1 μL；dd H2O補(bǔ)齊至30 μL。分別把雙酶切后的載體pET22b和C4H2-CDS片段割膠回收，用T4 DNA Ligase將雙酶切后的載體片段和目的基因片段于16 ℃連接2 h，將連接的產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，均勻涂布在LB平板 (含50 μg/mL氨芐青霉素，下同)上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑單克隆搖菌提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)得到的pET22b-C4H2-CDS質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，通過(guò)酶切鑒定出正確的克隆并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化挑取3個(gè)含pET22b-C4H2-CDS質(zhì)粒的BL21(DE3)菌體單斑至2 mL LB中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后將菌液與水按1∶50的體積比稀釋后，取0.1 mL稀釋菌液加入到含5 mL LB培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6 ～ 0.8。然后加入1 mM/L的IPTG誘導(dǎo)劑30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。誘導(dǎo)后，取菌液1 mL，12 000 r/min離心30 s,收獲沉淀，用5×蛋白Loading buffer重懸，混勻，100 ℃水浴10 min，然后進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳分析。適度擴(kuò)大培養(yǎng)體積，使用超聲裂解菌體，裂解后離心、取沉淀，溶于含有8 mol/L 尿素的結(jié)合緩沖液中，采用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白。

1.2.6NtC4H2基因的表達(dá)特性及酶活性測(cè)定

RT-PCR按SYBR Premix Ex Taq試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。以26 s作為內(nèi)參。反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10 μL，Nuclease-free water 3 μL，Primer Mix 2 μL，cDNA 5 μL，終體積20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 cycle。每份樣品設(shè)6次重復(fù)，采用比較CT值的2-ΔΔCT方法分析基因的表達(dá)量[14]。肉桂酸-4-羥化酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行，測(cè)定波長(zhǎng)為340 nm，OD值每1 h變化0.01為一個(gè)酶活性單位/U。

1.2.7NtC4H2基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析及黃酮類物質(zhì)的測(cè)定采用RT-PCR分析經(jīng)茉莉酸甲酯(MEJA)分別處理0 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h的上部葉NtC4H2基因表達(dá)量，每份樣品設(shè)6次重復(fù)。采用紫外分光光度法測(cè)定MEJA誘導(dǎo)后的各上部葉片總黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 9.0進(jìn)行單因素方差分析[16-17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 NtC4H2基因的克隆及測(cè)序結(jié)果分析

NtC4H2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其中，M為DNA Marker，1、2為NtC4H2基因擴(kuò)增結(jié)果。由圖1可知，NtC4H2基因序列長(zhǎng)度為1500 bp左右，對(duì)割膠回收后的基因片段進(jìn)行測(cè)序，得到序列長(zhǎng)度為1521 bp，NtC4H2基因序列全長(zhǎng)如圖2所示。將得到的基因序列與Gene Bank中已登錄的普通煙草(Nicotianatabacum/common tobacco)C4H2基因序列(DQ350353.1)進(jìn)行比對(duì)，顯示相似度達(dá)94.67%。因此可以確定得到的基因序列為C4H2基因序列。

圖1 NtC4H2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of NtC4H2 gene

圖2 NtC4H2基因序列全長(zhǎng)Fig.2 Full length of NtC4H2 gene sequence

2.2 NtC4H2蛋白的生物信息學(xué)結(jié)果分析

煙草NtC4H2蛋白與其他植物C4H蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示，其中，紅框?yàn)镻450保守序列區(qū)域，下劃線為特征性底物結(jié)合位點(diǎn)。由圖3可知，NtC4H2蛋白與美花煙草(Nictianasylvestris)C4H蛋白(XP-009766429.1)、普通煙草C4H2蛋白、矮牽牛(Petuniaxhybrida)PhC4H2蛋白(F1B283.1)相似性最高，達(dá)98%；與番茄(Solanumpennellii)C4H蛋白(XP_015078931.1)、龍葵(Solanumnigrum)C4H蛋白(QIC52990.1)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)C4H蛋白(ABC69046.1)等相似度達(dá)85%以上。煙草NtC4H2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，美花煙草、普通煙草、矮牽牛、番茄、龍葵、馬鈴薯、枸杞(Lyciumchinense)、辣椒(Capsicumannuum)、大花牽牛(Ipomoeanil)的C4H蛋白與煙草NtC4H2蛋白均處于同一進(jìn)化支，表明其親緣關(guān)系較近。煙草NtC4H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析與預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，NtC4H2蛋白符合細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)域特征，具有P450保守序列，是細(xì)胞色素P450超家族成員；NtC4H2蛋白序列中共有20個(gè)功能位點(diǎn)，酰胺化位點(diǎn)1處、酰基化位點(diǎn)6處，糖基化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)分別為2處、7處、4處；有5個(gè)特征性底物結(jié)合位點(diǎn)(substrate recognition sites)SRS1、SRS2、SRS4、SRS5和SRS6，其中序列241和277處不含二硫鍵[18]。

圖3 煙草NtC4H2蛋白與其他植物C4H蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Multiple comparison of amino acid sequence between NtC4H2 protein in tobacco and C4H protein in other plant species

圖4 煙草NtC4H2蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果Fig.4 Phylogenetic tree of NtC4H2 protein in tobacco

圖5 煙草NtC4H2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析與預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Analysis and prediction of secondary structure of NtC4H2 protein

預(yù)測(cè)顯示其分子式為C2660H4204N722O727S16，相對(duì)分子質(zhì)量和理論pI等電點(diǎn)值分別為58.44 kD和9.26，總原子數(shù)8329個(gè)，由506個(gè)氨基酸編碼其蛋白質(zhì)，帶正、負(fù)電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)、(Asp+Glu)分別為72個(gè)和62個(gè)，其中亮氨酸(Leu)含量最高，達(dá)11.1%；其次是纈氨酸(Val)和谷氨酸(Glu)均為7.7%；半胱氨酸(Cys)含量達(dá)到最低，僅為0.4%，這種氨基酸比例可能與NtC4H2蛋白的功能結(jié)構(gòu)和酶學(xué)特性有關(guān)。分析表明這種蛋白不穩(wěn)定，系數(shù)為46.21，其半衰期30 h、脂肪系數(shù)為96.66。對(duì)其親/疏水性的分析表明NtC4H2蛋白為親水蛋白，總平均吸水性為-0.264。

信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示NtC4H2蛋白有信號(hào)肽的概率是0.048 9，表明該蛋白質(zhì)C、Y、S的值均低于0.2，說(shuō)明其不含信號(hào)肽。該蛋白在N末端第5位到第24位氨基酸區(qū)域組成了1個(gè)跨膜區(qū)，且在膜外，跨膜區(qū)域占比3.95%。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分析結(jié)果顯示：煙草NtC4H2蛋白中參與α螺旋的氨基酸(藍(lán)色)、延伸鏈(紅色)、β轉(zhuǎn)角的氨基酸(綠色)和無(wú)規(guī)則卷曲的氨基酸(黃色)分別有240個(gè)、74個(gè)、26個(gè)、166個(gè)，它們的占比分別達(dá)47.43%、14.62%、5.14%和32.81%。

煙草NtC4H2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以數(shù)據(jù)庫(kù)中高粱(Sorghumbicolor)C4H2蛋白結(jié)構(gòu)為模板，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，預(yù)測(cè)空間結(jié)構(gòu)一致性達(dá)75.5%，共涵蓋了32～503個(gè)氨基酸，相似度為0.54，覆蓋度為0.98，三級(jí)結(jié)構(gòu)總體評(píng)價(jià)0.86，Qmean為-1.99。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,煙草NtC4H2蛋白質(zhì)三級(jí)空間結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)目與和生物學(xué)功能與二級(jí)結(jié)構(gòu)相一致，可能以單體的形式在植株中發(fā)揮作用。

圖6 煙草NtC4H2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Prediction of tertiary structure of NtC4H2 protein

2.3 煙草NtC4H2原核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果分析

煙草NtC4H2原核表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果如圖7所示，其中,M為DNA Marker,1為雙酶切鑒定結(jié)果。由圖7可知，載體條帶和目的基因條帶大小分別約為5000 bp和1500 bp。將雙酶切鑒定正確的單克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET-22b-C4H2-CDS中NtC4H2基因的序列與目的基因中的CDS區(qū)序列一致，并且未出現(xiàn)堿基突變、插入缺失等情況，表明原核表達(dá)載體pET-22b-C4H2-CDS構(gòu)建成功。

圖7 煙草NtC4H2原核表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果Fig.7 Identification of tobacco expression vector pET-22b-C4H2-CDS with double digestion

2.4 煙草NtC4H2重組蛋白的原核表達(dá)與純化結(jié)果分析

誘導(dǎo)前后大腸桿菌總蛋白 SDS-PAGE分析結(jié)果如圖8所示，其中，M為Protein marker；1、3、5為誘導(dǎo)前；2、4、6為誘導(dǎo)后；箭頭表示NtC4H2重組蛋白。由圖8可知，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在約70 kD處出現(xiàn)較明顯的目的蛋白條帶。NtC4H2蛋白在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，其蛋白N-末端會(huì)與pET-22b載體的標(biāo)簽序列(His-Tag)進(jìn)行一定的融合，其分子質(zhì)量大小約為75 kD，這與試驗(yàn)結(jié)果保持一致。含pET-22b空載體的菌株經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，未在70 kD處出現(xiàn)條帶。

圖8 誘導(dǎo)前后大腸桿菌總蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE analysis of recombinant NtC4H2 protein

重組蛋白純化分析結(jié)果如圖9所示，其中，M為Protein marker；1為純化前；2為純化后；箭頭表示NtC4H2重組蛋白。由圖9可知，NtC4H2蛋白在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，并獲得純化NtC4H2重組蛋白。重組蛋白NtC4H2主要以不溶性包涵體形式存在，這可能是由于原核表達(dá)中目的蛋白經(jīng)常發(fā)生錯(cuò)誤的折疊，聚集發(fā)展為包涵體所導(dǎo)致；大腸桿菌在進(jìn)行表達(dá)時(shí)沒(méi)有NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶來(lái)催化C4H2蛋白，這也會(huì)造成CYP450蛋白失活后以包涵體的形式存在。試驗(yàn)中通過(guò)重組蛋白上的表達(dá)序列標(biāo)簽，利用Ni柱即可純化回收目的蛋白，靶蛋白通常占細(xì)胞總蛋白的50%以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的形式存在，但多達(dá)95%(甚至可以更多)的蛋白則在包涵體中。包涵體的形成是靶蛋白高表達(dá)的標(biāo)志，通?？梢悦庥诘鞍酌傅乃馄茐淖饔谩?/p>

圖9 重組蛋白純化分析結(jié)果Fig.9 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein

2.5 煙草NtC4H2基因的表達(dá)特征及酶活性測(cè)定結(jié)果分析

煙草NtC4H2基因在不同組織中的表達(dá)分析及酶活變化如圖10所示。由圖10a)可知，NtC4H2基因在各個(gè)組織中的表達(dá)豐度存在較大差異，在煙草幼苗上部葉中相對(duì)表達(dá)量最大，為28.7；下部葉表達(dá)量最小，為20.7；相對(duì)表達(dá)量由少至多依次為下部葉<莖<中部葉<根<上部葉。由圖10b)可知，酶活性變化趨勢(shì)與NtC4H2基因在不同組織中的表達(dá)水平一致。

圖10 煙草NtC4H2基因在不同組織中的表達(dá)分析及酶活變化Fig.10 Expression analysis of NtC4H2 gene in different tissues and enzyme activity

于利等[13]對(duì)HD、K326 兩個(gè)煙草品種不同部位的組織表達(dá)特性對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，C4H2基因在HD根部的表達(dá)水平最高，下部葉表達(dá)水平最低，整體表達(dá)情況為為下部葉<上部葉<中部葉<根，而K326則表現(xiàn)為中部葉<下部葉<根<上部葉。這些結(jié)論與本研究結(jié)果對(duì)比顯示，中煙202中NtC4H2基因的表達(dá)模式、表達(dá)量與HD、K326均存在一定差異。這種差異的產(chǎn)生一方面可能是植株品種間的差異造成的，另一方面則與試驗(yàn)植株所處不同生命階段對(duì)其木質(zhì)化進(jìn)程相關(guān)。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的組成成分之一，植物木質(zhì)化進(jìn)程是指木質(zhì)素在植物細(xì)胞壁中大量沉淀、積累。有研究表明C4H蛋白會(huì)與其他酶形成多酶復(fù)合體的構(gòu)造，這種構(gòu)造有助于控制木質(zhì)素的生成[19-20]。當(dāng)植株隨著自身生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)于木質(zhì)素的需求量逐漸增加時(shí)，其基因表達(dá)量也會(huì)發(fā)生變化。本試驗(yàn)煙草植株處于生命活動(dòng)初期，是植株快速生長(zhǎng)的階段。試驗(yàn)結(jié)果顯示上部葉中NtC4H2基因含量高于中部和下部，這可能由于幼苗期植株在頂端優(yōu)勢(shì)的作用下經(jīng)過(guò)分生組織不斷的細(xì)胞分裂、分化、伸長(zhǎng)，頂部細(xì)胞壁加厚，合成大量木質(zhì)素，導(dǎo)致植株快速生長(zhǎng)、加粗。這一系列組織變化過(guò)程同時(shí)伴隨煙草下部葉中細(xì)胞增殖和伸長(zhǎng)停止，大量細(xì)胞壁會(huì)同時(shí)出現(xiàn)沉積現(xiàn)象，從而使處于下部葉中的細(xì)胞木質(zhì)化能力減弱[21-23]。這些研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致，即下部葉中NtC4H2基因表達(dá)量可能低于上部、中部葉。與此同時(shí)，有研究[24]表明，大蒜幼苗中C4H的轉(zhuǎn)錄在根中最高，在莖中卻很低。推測(cè)可能是由于大蒜中苯丙烷類物質(zhì)在根中進(jìn)行了大量合成、積累后轉(zhuǎn)運(yùn)到莖中。這也與本試驗(yàn)中NtC4H2基因定量檢測(cè)結(jié)果一致，即根中的表達(dá)量相對(duì)高于莖中。

2.6 MEJA誘導(dǎo)表達(dá)及黃酮類物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果分析

上部葉中NtC4H2基因在茉莉酸甲酯激素處理下的表達(dá)分析結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，經(jīng)過(guò)MEJA誘導(dǎo)后，在不同采樣時(shí)間內(nèi)NtC4H2基因表達(dá)量均有明顯波動(dòng)。在前48 h的采樣時(shí)間內(nèi)，除4 h表達(dá)量略有下降外，之后的3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均呈現(xiàn)緩慢升高趨勢(shì)。24 h表達(dá)量為0 h表達(dá)量的1.36倍，在48 h時(shí)NtC4H2基因的表達(dá)量達(dá)到最大值，是0 h表達(dá)量的1.58倍。72 h后NtC4H2的表達(dá)量又呈現(xiàn)出回落趨勢(shì)。

圖11 上部葉中NtC4H2基因在茉莉酸甲酯激素處理下的表達(dá)分析結(jié)果Fig.11 Expression analysis of NtC4H2 gene in upper leaves treated with MEJA

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及不同時(shí)間茉莉酸甲酯處理上部葉中黃酮含量分析結(jié)果如圖12所示。由圖12可知，經(jīng)MEJA誘導(dǎo)后NtC4H2的表達(dá)模式可能與葉中黃酮的積累有關(guān)，對(duì)照組在6個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)中黃酮含量沒(méi)有明顯變化，而MEJA處理組在4 h時(shí)黃酮含量升高至9.34 mg/g DW，比0 h時(shí)升高了27.78%；在12 h時(shí)黃酮含量比4 h略有降低，為8.81 mg/g DW。在24 h時(shí)黃酮含量升高至9.96 mg/g DW；48 h時(shí)達(dá)到峰值，為13.19 mg/g DW，比對(duì)照組提高80.19%。當(dāng)MEJA處理72 h后，黃酮含量開(kāi)始下降，為6.47 mg/g DW，比對(duì)照組下降了11.49%。MEJA處理組黃酮含量總體變化趨勢(shì)呈現(xiàn)先升高后下降的態(tài)勢(shì)。

圖12 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及不同時(shí)間茉莉酸甲酯處理上部葉中黃酮含量分析結(jié)果Fig.12 The standard curve of rutin and analysis of flavonoid content in upper leaves treated with MEJA at different time

MEJA是植物體內(nèi)廣泛存在的激素，其作為信號(hào)源參與到植物的各個(gè)抗逆過(guò)程。MEJA也會(huì)增加植物次生代謝產(chǎn)物的積累，它可以誘導(dǎo)合成三萜類化合物，同時(shí)提高黃酮類物質(zhì)含量[25-27]。研究表明，短期脅迫有利于黃酮類化合物的合成和積累，有利于提高 PAL 和 C4H 等酶的活性[28]。M.H.Ibrahim等[29]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)高的施氮量會(huì)使C4H酶活性適度下調(diào)，使得一些黃酮類化合物的含量隨之下降；黃利娜等[30]研究與其結(jié)果一致，即外源NO處理會(huì)抑制蓮霧果實(shí)中C4H表達(dá)水平和木質(zhì)素的積累。而王愛(ài)華等[31]研究表明，在烤煙的上部葉片中，施加適量的純氮，在一定程度上可以使C4H 酶活性以及黃酮類化合物的含量有效增加。同時(shí)在轉(zhuǎn)DfC4H基因香鱗毛蕨T1代植株中，黃酮類化合物合成途徑的終產(chǎn)物花色素苷的含量明顯高于野生型[32]。馮藝川等[33]研究膜莢黃芪AmC4H2基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，在根、莖、葉中該基因的表達(dá)趨勢(shì)與毛蕊異黃酮及其糖苷的含量基本一致，因此推測(cè)其參與了毛蕊異黃酮及其糖苷的生物合成。這些研究結(jié)果都與本試驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)煙草植株檢測(cè)到外界MEJA激素信號(hào)時(shí)，由信號(hào)傳導(dǎo)開(kāi)啟自身抗逆機(jī)制，體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物開(kāi)始逐步積累以抵御和適應(yīng)外界的不良環(huán)境。本研究通過(guò)檢測(cè)經(jīng)MEJA誘導(dǎo)不同時(shí)間后煙草上部葉中NtC4H2基因的表達(dá)量和黃酮含量，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)規(guī)律與黃酮含量變化趨勢(shì)相同。驗(yàn)證了基因NtC4H2與煙草植株黃酮類物質(zhì)的生物合成具有一定相關(guān)性。

3 結(jié)論

本文從煙草中克隆出長(zhǎng)度為1521 bp(CDS)的NtC4H2基因，經(jīng)分析顯示共編碼506個(gè)氨基酸，與美花煙草C4H蛋白、普通煙草C4H2蛋白和矮牽牛C4H2蛋白相似性最高達(dá)98%；與番茄、龍葵、馬鈴薯等植物C4H蛋白相似度達(dá)85%以上。NtC4H2蛋白是細(xì)胞色素P450 超家族成員，具有P450保守序列，有1個(gè)跨膜區(qū)，為不穩(wěn)定親水蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成。通過(guò)構(gòu)建pET-22b-C4H2-CDS表達(dá)載體，重組、純化了NtC4H2蛋白，重組NtC4H2蛋白主要以不溶性包涵體的形式存在于表達(dá)細(xì)菌中。NtC4H2基因在煙草不同組織中進(jìn)行表達(dá)，C4H2酶活性的大小與基因的表達(dá)水平一致，依次為下部葉<莖<中部葉<根<上部葉。不同組織表達(dá)量與誘導(dǎo)表達(dá)分析顯示，經(jīng)MEJA誘導(dǎo)后NtC4H2基因在煙草上部幼葉中的表達(dá)量呈先高升后降低的趨勢(shì)，在48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值且與葉中黃酮物質(zhì)的積累呈正相關(guān)。