邢勝利，宋麗麗，張志平，魏濤，馬歌麗，邢進(jìn)，黎園，楊旭

1.江蘇合拓環(huán)境技術(shù)有限公司，江蘇 無錫 214000；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.鄭州市代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001

0 引言

自然界存在的大量農(nóng)業(yè)廢棄物(如玉米秸稈、小麥秸稈、稻草、麩皮等)是轉(zhuǎn)化生物基化學(xué)品(如乙醇、丁醇、L-乳酸等)的潛在原料[1]，其主要成分(如纖維素、半纖維素等)可被纖維素酶降解產(chǎn)生可發(fā)酵單糖(如葡萄糖、木糖等)，并通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)相應(yīng)的產(chǎn)品[2]。纖維素酶是由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成的復(fù)合酶，通過協(xié)同催化作用將纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖[3]。同傳統(tǒng)物化處理方式相比，纖維素酶水解纖維素和半纖維素具有轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[4]。目前，木質(zhì)纖維類原料生化轉(zhuǎn)化的主要問題是纖維素酶用量大且成本高[5]，如何降低纖維素酶的生產(chǎn)成本，是促進(jìn)纖維素酶在多個(gè)領(lǐng)域更廣泛應(yīng)用的重要課題。業(yè)界普遍認(rèn)為,里氏木霉是目前分泌纖維素酶能力最強(qiáng)的微生物，在纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)業(yè)應(yīng)用廣泛[6]。

培養(yǎng)基可為微生物的生長和代謝產(chǎn)物的形成提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，是影響發(fā)酵水平的關(guān)鍵因素[7]。傳統(tǒng)纖維素酶液態(tài)發(fā)酵多采用純纖維素及其衍生物(如結(jié)晶纖維素、羧甲基纖維素鈉或紙漿等)作為發(fā)酵培養(yǎng)基成分[8-9]。為降低生產(chǎn)成本，近年來逐步出現(xiàn)了利用天然原料替代高成本工業(yè)產(chǎn)品用作發(fā)酵培養(yǎng)基成分產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道，如利用豆餅粉、麩皮、甘蔗渣、橡木或各種農(nóng)作物秸稈等進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果表明天然原料在纖維素酶生產(chǎn)上具有經(jīng)濟(jì)可行性[10-11]。

基于此，本文以天然原料(豆餅粉、麩皮等)為培養(yǎng)基主要營養(yǎng)成分，采用Plackett-Burman(PB)、最陡爬坡和Box-Behnken(BB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面(RSM)分析對纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，并進(jìn)行酶解驗(yàn)證，擬篩選影響纖維素酶活力的顯著因素及其最適添加量，以期提高里氏木霉Rut-C30(TrichodermareeseiRut-C30)的發(fā)酵產(chǎn)酶水平，為纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

里氏木霉Rut-C30，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2 主要材料與試劑

蒸汽爆破玉米秸稈，河南天冠集團(tuán)有限公司產(chǎn)；馬鈴薯、豆餅粉和麩皮，購于鄭州市某菜市場；葡萄糖、尿素、蛋白胨、結(jié)晶纖維素、KH2PO4、(NH4)2SO4、CaCl2、MgSO4、吐溫80、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O，均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)。

1.3 主要儀器與設(shè)備

LDZF-30KB-Ⅲ型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)；THZ-100型搖床、TY2014003876型無菌操作臺(tái)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；TDL-5-A型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司產(chǎn)；LIDA PHS-3C型pH計(jì)，上海理達(dá)儀器廠產(chǎn)；HH-S型恒溫水浴鍋，鄭州科華儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)；UV-2012PC型紫外分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)。

1.4 主要培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件

菌種保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1.0 L，葡萄糖 20.0 g，瓊脂 15.0 g，pH值保持自然。馬鈴薯提取液：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加去離子水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，添加去離子水將濾液定容至1.0 L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，尿素0.3 g，蛋白胨0.75 g，(NH4)2SO41.4 g，KH2PO42.0 g，CaCl20.06 g，MgSO40.06 g，吐溫80 2 mL，微量元素溶液0.2 mL，添加去離子水定容至1 L，pH值調(diào)至5.50。微量元素溶液組成為：CoCl2·6H2O 0.003 7 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，添加去離子水定容至1 L。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：將種子培養(yǎng)基中的葡萄糖換為結(jié)晶纖維素，其他成分保持不變，即得。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 粗酶液的制備將里氏木霉Rut-C30菌株接種于菌種保藏培養(yǎng)基上，于28 ℃條件下培養(yǎng)96 h后，用接種環(huán)刮取表面孢子并接入100 mL種子培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)中，于28 ℃、175 r/min條件下培養(yǎng)46 h，即得種子液；將種子液以5%的接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(250 mL三角瓶)，于28 ℃、250 r/min條件下發(fā)酵168 h后，將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為纖維素酶粗酶液。

1.5.2 酶活力的測定方法酶活力依據(jù)QB 2583—2003[12]進(jìn)行測定。

1.5.3 酶解實(shí)驗(yàn)方法為了考查纖維素酶對木質(zhì)纖維素原料的酶解效果，對蒸汽爆破玉米秸稈進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。稱取一定量的原料置于三角瓶中，加入pH值為4.8的檸檬酸緩沖液和適量纖維素酶，將三角瓶置于50 ℃恒溫振蕩水浴中，于200 r/min條件下振蕩酶解48 h后，將酶解液加熱至100 ℃進(jìn)行滅活處理，于5000 r/min條件下離心10 min，取上清液用濾膜過濾，通過液相色譜分析酶解產(chǎn)物。

1.5.4 酶解液單糖組成測定酶解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖等物質(zhì)采用高效液相色譜進(jìn)行測定，具體方法為：液體樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過濾；分析柱為Biorad Aminex HPX-87H柱(300 mm×7.8 mm)；流動(dòng)相為0.05 mol/L H2SO4溶液，流速為0.5 mL/min；柱溫為65 ℃。

1.5.5PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別選取豆餅粉添加量、麩皮添加量、結(jié)晶纖維素添加量、蛋白胨添加量、KH2PO4添加量、(NH4)2SO4添加量、CaCl2添加量和MgSO4添加量(依次記為X1—X8)這8個(gè)因素的高低2個(gè)水平，選用Factors=8，Runs=12進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素和水平見表1。以纖維素酶活力為響應(yīng)值(記為Y1)，通過比較各因素的顯著性水平，篩選對酶活力影響較顯著的因素。

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表Table 1 The factors and levels of PB test design %

1.5.6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)PB試驗(yàn)及其分析結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，對顯著因素進(jìn)行梯度設(shè)計(jì)，其余不顯著的因素，在PB分析結(jié)果中是正效應(yīng)的取高水平，是負(fù)效應(yīng)的取低水平。

1.5.7BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用 SAS V9.2軟件中的BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)模擬RSM模型，以最陡爬坡試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果為中心點(diǎn)，以纖維素酶活力為響應(yīng)值(記為Y2)。根據(jù) BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)三因素三水平RSM分析試驗(yàn)，共12個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，3個(gè)中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.1.1PB試驗(yàn)結(jié)果分析PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2，PB試驗(yàn)結(jié)果對纖維素酶活力影響的統(tǒng)計(jì)分析見表3。由表3可知，豆餅粉添加量、麩皮添加量和蛋白胨添加量均對纖維素酶活力呈負(fù)效應(yīng)且影響顯著(P<0.1)，可作為主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)和BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)。其他不顯著因素，KH2PO4添加量、(NH4)2SO4添加量、CaCl2添加量和MgSO4添加量對纖維素酶活力呈正效應(yīng)，取高水平；結(jié)晶纖維素添加量對纖維素酶活力呈負(fù)效應(yīng)，取低水平[13]。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 PB test design and results

表3 PB試驗(yàn)結(jié)果對纖維素酶活力影響的統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of the PB test results on cellulase activity

2.1.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果分析因PB試驗(yàn)結(jié)果中豆餅粉添加量、麩皮添加量和蛋白胨添加量均呈顯著負(fù)效應(yīng)，故最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)中三者水平都應(yīng)減小。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表4。由表4可知，纖維素酶活力在第3組達(dá)到最大值21.42 U/mL，故以第3組作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 4 Steepest climbing test design and results

2.1.3BB試驗(yàn)結(jié)果分析BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平見表5，BB-RSM矩陣與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

表5 BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平表Table 5 The factors and levels of BB test design %

表6 BB-RSM矩陣與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The BB-RSM program and test results

通過SAS V9.2軟件對BB試驗(yàn)數(shù)據(jù)及模擬的RSM模型進(jìn)行分析，該模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.961 6，表明模型的擬合程度較好。一般認(rèn)為Radj2至少要大于0.850 0[14]，而本試驗(yàn)校正系數(shù)Radj2為0.892 6，表明89.26%試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性能夠用此模型解釋，試驗(yàn)誤差小，應(yīng)用RSM法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基工藝條件是可行的，具有參考性。

利用SAS V9.2軟件中的RSM分析得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：豆餅粉添加量2.140%，麩皮添加量1.88%，蛋白胨添加量0.30%，該條件下預(yù)測里氏木霉發(fā)酵液中纖維素酶活力為41.75 U/mL。在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，里氏木霉發(fā)酵液中纖維素酶活力為(42.62±1.30)U/mL。

2.2 發(fā)酵過程中里氏木霉的形態(tài)變化分析

里氏木霉液態(tài)發(fā)酵過程中的形態(tài)變化見圖1。由圖1可以看出，發(fā)酵初期(3 d)，里氏木霉菌絲為初級(jí)菌絲，形態(tài)呈細(xì)絲狀，孢子囊很少，且該時(shí)期纖維素酶活力上升很慢；發(fā)酵后期(5 d)，里氏木霉菌絲為次級(jí)菌絲，大量的分支和孢子囊開始出現(xiàn)，纖維素酶活力增長迅速。纖維素酶的產(chǎn)生與次級(jí)菌絲密切相關(guān)，一般認(rèn)為絲狀真菌蛋白的分泌主要發(fā)生在菌絲頂點(diǎn)處[15]。S.Velkovska等[16]在研究里氏木霉 RUT-C30初級(jí)菌絲與次級(jí)菌絲形態(tài)特征的變化時(shí)指出，只有次級(jí)菌絲才能生產(chǎn)纖維素酶。因此，在液態(tài)發(fā)酵過程中，需要控制好發(fā)酵條件以維持里氏木霉的蛋白分泌能力。

圖1 里氏木霉液態(tài)發(fā)酵過程中的形態(tài)變化Fig.1 The morphology changes of Trichoderma ressei during liquid-state fermentation

2.3 酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在纖維素降解過程中，首先是纖維素酶分子吸附到纖維素表面，由內(nèi)切葡聚糖酶在葡聚糖鏈的隨機(jī)位點(diǎn)水解底物，產(chǎn)生短鏈纖維素和纖維低聚糖；然后由外切葡聚糖酶從短鏈纖維素和纖維低聚糖的非還原性端進(jìn)行水解，主要產(chǎn)物為纖維二糖；最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖[17-18]。里氏木霉發(fā)酵液中的纖維素酶組成常存在β-葡萄糖苷酶活力較低的情況，導(dǎo)致酶解過程中纖維二糖積累，降低酶解效率[19]。纖維素酶酶解玉米秸稈的高效液相色譜圖如圖2所示。由圖2可以看出，在最優(yōu)產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件下，纖維素酶的酶解液中含少量纖維二糖，表明里氏木霉發(fā)酵液中纖維素酶體系的β-葡萄糖苷酶含量不足，這在一定程度上成為整個(gè)纖維素酶系有效降解纖維素底物從而生成葡萄糖的瓶頸[20-21]。由于玉米秸稈中含有一定量的半纖維素，在纖維素酶解作用下，也會(huì)降解產(chǎn)生少量木糖、阿拉伯糖等單糖。

圖2 纖維素酶酶解玉米秸稈的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of corn stover hydrolyzed by crude cellulase solution

3 結(jié)論

本文選取豆餅粉添加量、麩皮添加量、結(jié)晶纖維素添加量、蛋白胨添加量、KH2PO4添加量、(NH4)2SO4添加量、CaCl2添加量和MgSO4添加量8個(gè)因素，通過PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和BB試驗(yàn)優(yōu)化得到里氏木霉最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件為豆餅粉添加量2.140%，麩皮添加量1.88%，蛋白胨添加量0.30%，在此條件下，里氏木霉發(fā)酵液中的纖維素酶活力可達(dá)(42.62±1.30)U/mL。里氏木霉發(fā)酵過程中需要控制好發(fā)酵條件以產(chǎn)生大量分支和孢子囊，維持里氏木霉的纖維素酶蛋白分泌能力。以該優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵制備的纖維素粗酶液水解玉米秸稈中的纖維素和半纖維素可得游離葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纖維二糖等可發(fā)酵性糖。后續(xù)研究需要利用分子生物學(xué)等技術(shù)手段將不同來源的高效β-葡萄糖苷酶基因在里氏木霉中表達(dá)，以提高β-葡萄糖苷酶活力，增強(qiáng)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶降解天然纖維素底物的能力。