寇卜心，柴夢音，豆雙雙，龐麗君，陳德喜，劉曉霓

條件性基因敲除(conditional knockout，CKO)是將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段，實(shí)現(xiàn)對小鼠基因組的時(shí)空特異性修飾[1,2]。CKO技術(shù)主要是通過染色體位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的，如Cre-LoxP系統(tǒng)[3,4]、FLP-Frt系統(tǒng)[5,6]和Dre-Rox系統(tǒng)[7]，其中最為常用的是Cre-LoxP系統(tǒng)，是在待敲除的一段目的DNA序列的兩端各放置一個(gè)LoxP序列，得到目的基因插入兩個(gè)LoxP位點(diǎn) (flanked by loxP，F(xiàn)lox) 的小鼠。將Flox小鼠與特異性表達(dá)Cre的工具鼠交配，即可獲得具有組織或細(xì)胞特異性敲除目的的基因小鼠[8]。研究顯示，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating of p53 protein 2，ASPP2)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[9-15]。我們前期構(gòu)建了ASPP2全身敲除小鼠，顯示可以促進(jìn)二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，DEN)誘導(dǎo)的肝癌形成[16,17]。為了更好地研究ASPP2在肝臟疾病發(fā)病過程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，我們利用簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9，CRISPR/Cas9) 技術(shù)獲得 ASPP2-flox小鼠，與肝臟特異性表達(dá)Alb-Cre的小鼠交配繁育，構(gòu)建ASPP2肝臟條件性基因敲除小鼠，為深入探討ASPP2在肝臟疾病(如肝癌、肝再生和脂肪肝形成等)發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了應(yīng)用模型。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 12～16周齡SPF級Balbl/c小鼠，雌雄各半，共10只； 12～16周齡SPF級C57b6l/J Alb-Cre小鼠，雌雄各半，共10只，購自江蘇集萃藥康生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SYXK(蘇)2018-0008]，并在該公司SPF級動物房飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)[使用許可證號：SYXK(蘇)2018-0027]。所有小鼠飼養(yǎng)于12 h/12 h光照/黑暗條件下，自由采食和飲水，嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理和福利相關(guān)規(guī)定(倫理批件號：AEEI-2019-068)進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。DH5a 感受態(tài)細(xì)胞(諾唯贊生物科技股份有限公司，中國)；MEGA short script Kit 試劑盒(Invitrogen， 美國)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)；抗β-actin和抗ASPP2(Cell Signaling Technology，美國)。ProFlexTM 96-well PCR system(Applied Biosystems，美國)；DFC450 C正置顯微鏡(LEICA，德國)； ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BioRad，美國)；PowerPacTMBasic電泳儀(BioRad，美國)。

1.2 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠的構(gòu)建策略 采用CRISPR/Cas9基因編輯法，以Balb/c近交系小鼠為背景鼠，按照圖1的示例，選擇ASPP2-201轉(zhuǎn)錄本 (ENSMUST00000117245.1) 為模板，在1～2號和3～4號外顯子區(qū)插入Loxp片段，以獲得 ASPP2-flox小鼠。

圖1 ASPP2肝臟條件性敲除小鼠的構(gòu)建策略

1.3 載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和純化 使用麻省理工學(xué)院的CRISPR Design 工具(http://crispr.mit.edu/)，依據(jù) Score 的高低設(shè)計(jì)一對長度為20 bp 的針對靶標(biāo) DNA 的寡聚核苷酸鏈序列，用于制備向?qū)NA (small guide RNA, sgRNA)，sgRNA序列見表1。根據(jù) sgRNA 序列，設(shè)計(jì)一個(gè)攜帶靶位點(diǎn)同源區(qū)域和 Loxp 位點(diǎn)的重組質(zhì)粒，并在該靶區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用于后續(xù)小鼠的基因鑒定，鑒定策略見圖2，引物信息見表2(引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成)，測序引物信息見表3，反應(yīng)體系見表4。制作攜帶靶位點(diǎn)同源區(qū)域和LoxP 位點(diǎn)片段的重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素抗性和插入片段測序，對陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行篩選和鑒定，挑選正確的菌落克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并純化，獲得的片段產(chǎn)物用于注射使用。

表1 sgRNA序列

表2 ASPP2-flox小鼠鑒定引物

圖2 ASPP2肝臟條件性敲除小鼠基因型鑒定策略

野生型：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)只獲得單一的243 bp或669 bp或754 bp條帶；雜合子：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得243 bp、330 bp或669 bp、423 bp或754 bp、399 bp條帶；純合子：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)只獲得單一的330 bp或423 bp或399 bp條帶。

表3 測序引物序列

表4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系及條件

1.4 肝臟敲除ASPP2基因小鼠的獲得 將 sgRNA 表達(dá)載體線性化，經(jīng)酚氯仿抽提純化，作為模板用于體外轉(zhuǎn)錄，并使用 MEGAshortscript Kit 體外合成 sgRNA。將轉(zhuǎn)錄好的 sgRNA 和 cas9 以及純化后的重組片段混合并調(diào)整濃度，使用顯微注射儀將混合物顯微注射到BALB/c小鼠受精卵，再將受精卵移植到假孕的 BALB/c 母鼠子宮，等待 ASPP2-flox F0 代小鼠出生。在 F0 代小鼠出生后 5～7 d，采用剪腳趾法標(biāo)記小鼠，并剪取鼠尾組織，經(jīng)酚氯仿法提取DNA，依據(jù)上述在靶區(qū)域設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行基因型鑒定，選取PCR檢測為雜合子表型的樣品進(jìn)行測序。 將PCR檢測和測序正確的F0代小鼠與野生型BALB/c 小鼠進(jìn)行交配，產(chǎn)生 F1代小鼠。采用上述鑒定方法對 F1 代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，并測序驗(yàn)證，獲得的陽性 F1 代雜合子小鼠即可穩(wěn)定地遺傳。將F1代ASPP2-flox小鼠與C57b6l/J Alb-Cre小鼠交配，獲得ASPP2fl/-CreT小鼠，用得到的該基因型小鼠與BALB/c 背景的ASPP2fl/-小鼠回交5代以上，得到BALB/c.B6J ASPP2fl/flCreT小鼠，即為肝臟敲除ASPP2基因的小鼠?；蛐蜋z測引物見表2和表5。

表5 Cre 鑒定引物

1.5 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠肝臟蛋白表型表達(dá)檢測 取ASPP2fl/flCreT小鼠，采用脫頸椎處死，快速取得肝組織，將一部分肝組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)制備石蠟切片，采用免疫組化法(SP法)進(jìn)行ASPP2蛋白表達(dá)檢測；將另一部分肝組織放入液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存，后期提取總蛋白，測蛋白濃度、電泳轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，凝膠成像系統(tǒng)檢測ASPP2蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 ASPP2-flox基因型鑒定和測序結(jié)果 將F0代和F1代ASPP2-flox小鼠的鼠尾組織PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，雜合子基因型小鼠可以獲得243 bp和330 bp(5'arm+wt)或669 bp和423 bp(5'arm)或754 bp和399 bp(3'arm)條帶。如61、63、66號小鼠即為F1代陽性雜合子(ASPP2fl/-，圖3)。進(jìn)一步測序發(fā)現(xiàn)，loxp位點(diǎn)序列為ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT，說明61、63、66號小鼠是陽性雜合子小鼠無誤(圖4)，可供后續(xù)繁育。

圖3 ASPP2-flox小鼠 F1代基因型鑒定P:陽性對照；WT：野生型對照；N：陰性對照；M：分子量標(biāo)準(zhǔn)

圖4 ASPP2-flox小鼠 F1代鼠尾組織基因測序鑒定結(jié)果A和B：5’端測序結(jié)果；C：3’端測序結(jié)果為測序位點(diǎn)

2.2 ASPP2肝臟條件性敲除(ASPP2fl/flCreT)鑒定情況 將ASPP2fl/flCreT小鼠的鼠尾組織PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測ASPP2基因：Flox/flox(fl/fl) 基因型小鼠顯示為330 bp和399 bp單一條帶，即311、312、316、320、322、325、326；Flox/wt(fl/wt)基因型小鼠顯示為243 bp和330 bp或745 bp和399 bp兩條帶，即313、314、317、319、32、323、327、328、329；其余小鼠為野生型，僅顯示為243 bp或745 bp條帶。檢測Alb-cre基因：Mut/wt基因型小鼠顯示為390 bp單一條帶，即為311、312、314、316、317、321、325、326、327、328、329；其余小鼠為野生型，顯示為351 bp條帶(圖5)。因此，311、312、316、325、326號小鼠為ASPP2fl/flCreT小鼠(顯示為330、399、390 bp條帶)，即肝臟特異敲除的小鼠模型。

圖5 ASPP2肝臟條件性敲除(ASPP2fl/fl CreT)小鼠基因型鑒定結(jié)果A：243 bp和330 bp條帶；B：754 bp和399 bp條帶；C：351 bp條帶；D：390 bp條帶;P:為陽性對照；B6：陰性對照(B6小鼠基因組DNA)；N：無模板的對照;M: DL2000 分子量標(biāo)記，2000 bp/1000 bp/750 bp/500 bp/250 bp/100 bp

2.3 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠肝組織ASPP2蛋白表達(dá)情況 經(jīng)Western blot檢測顯示，與野生小鼠比，ASPP2fl/flCreT小鼠肝組織ASPP2蛋白表達(dá)顯著減弱(圖6A)；經(jīng)免疫組化檢測顯示，ASPP2主要表達(dá)于肝細(xì)胞核。與野生小鼠比，ASPP2fl/flCreT小鼠肝組織ASPP2陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(圖6B)。

圖6 ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠肝組織ASPP2蛋白表達(dá)A：Western blot法檢測ASPP2蛋白表達(dá)；B：ASPP2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核(SP法，200×)

3 討論

基因敲除包括全身性基因敲除和條件性基因敲除兩種方法，其中全身性基因敲除是指在小鼠所有組織細(xì)胞，將靶基因敲除掉，從而使靶基因的表達(dá)缺失[18,19]。本文所提及的基因條件性敲除是利用Cre-Loxp 重組系統(tǒng)，將 Cre 基因插入特定的啟動子序列后面，即可人為地控制 Cre 基因在某些細(xì)胞譜系或者在機(jī)體發(fā)育的特定時(shí)間段抑或在外源性藥物誘導(dǎo)下表達(dá)，表達(dá)的 CRE 蛋白識別特定的 DNA序列 (如 Loxp 位點(diǎn))，并進(jìn)行 Loxp 位點(diǎn)之間的靶基因剪切，從而實(shí)現(xiàn)目的基因在特定細(xì)胞類型中功能性缺失[20]。

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，通過同源重組的原理，對ASPP2靶基因進(jìn)行flox 修飾，即在ASPP2基因2、3外顯子兩側(cè)插入Loxp序列，構(gòu)建ASPP2-flox小鼠。該flox 小鼠與肝臟特異性的Cre 工具鼠(Alb-Cre)交配后，可獲得肝臟特異性敲除ASPP2基因的小鼠。本研究采用了PCR對F0代和F1代ASPP2-flox小鼠的基因型進(jìn)行了檢測，顯示為243 bp和330 bp (5'arm+wt)或669 bp和423 bp(5'arm)或754 bp和399 bp(3'arm)條帶，基因型為ASPP2fl/-，測序結(jié)果顯示loxp位點(diǎn)序列為ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT，提示ASPP2-flox 雜合小鼠模型構(gòu)建成功。F1代雜合小鼠與Alb-Cre小鼠進(jìn)行雜交后，回交ASPP2 fl/-小鼠，得到基因型為ASPP2fl/flCreT的小鼠，即得到ASPP2肝臟條件性敲除小鼠，PCR檢測基因結(jié)果顯示為30 bp、399 bp和390 bp條帶。經(jīng)Westernblot和免疫組化法檢測顯示ASPP2fl/flCreT小鼠肝臟ASPP2 蛋白表達(dá)顯著減弱。

綜上所述，基因型、測序和蛋白表達(dá)分析結(jié)果均顯示基于Cre-LoxP系統(tǒng)成功構(gòu)建了ASPP2基因肝臟條件性敲除小鼠，該模型可以為下一步研究ASPP2在肝病發(fā)生過程中的作用提供模型基礎(chǔ)。