鐘 翔，向曉曦

(恩施州中心醫(yī)院1.病理科；2.普外科，湖北 恩施 445000)

結(jié)腸癌是我國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。目前臨床上免疫法糞便隱血檢測(cè)和纖維乙狀結(jié)腸鏡檢查作為主要的篩查手段，已經(jīng)明顯降低了結(jié)腸癌的死亡率，然而這些技術(shù)都有其固定的局限性[2]，開(kāi)發(fā)結(jié)腸癌特異性標(biāo)志物，則有助于提高患者的早期診斷率。許多惡性腫瘤組織中都存在miRNAs表達(dá)或功能異常，這與其表觀遺傳學(xué)改變有關(guān)，而檢測(cè)糞便樣本中miRNAs內(nèi)源性表達(dá)和甲基化狀態(tài)有望成為癌癥早期診斷和預(yù)后評(píng)估最具潛力的、無(wú)創(chuàng)性的生物學(xué)檢測(cè)手段[3]。miR-21和miR-34a都是靶向腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)相關(guān)炎癥通路的重要介質(zhì)[4]，而且眾多研究證實(shí)miRNAs表達(dá)和甲基化調(diào)節(jié)具有一定的組織依賴性[5]。因此本研究擬分析糞便和癌組織中miR-21和miR-34a表達(dá)及甲基化檢測(cè)對(duì)于結(jié)腸癌診斷的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2019年3月至2020年1月在我院行結(jié)腸癌原發(fā)灶腫瘤切除(部分患者同時(shí)行肝轉(zhuǎn)移灶切除)82例結(jié)腸癌患者中，收集了腫瘤組織標(biāo)本和癌旁(距離癌變組織邊界大于5 cm)結(jié)腸黏膜組織樣本。同時(shí)在手術(shù)前使用15mL的收集管取得糞便樣本。將手術(shù)前接受化療、放療、免疫治療等患者，復(fù)發(fā)患者或合并任何其他惡性腫瘤的患者排除在本研究之外。所有病例術(shù)后病理證實(shí)為原發(fā)性結(jié)腸癌，采取美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)或國(guó)際聯(lián)合抗癌委員會(huì)(UICC/AJCC)的結(jié)腸癌(第7版)TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)腸癌病理分期[6]。對(duì)照組糞便樣本來(lái)自40例結(jié)腸良性腫瘤患者，經(jīng)體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查排除合并任何惡性腫瘤者。包括結(jié)腸息肉12例，結(jié)腸腺瘤20例，直腸息肉5例，直腸腺瘤3例。結(jié)腸癌組(n=82例)，男性51例，女性31例，平均年齡(59.87±10.67)歲，平均體重指數(shù)(23.58±4.12)kg/m2，吸煙史20.73%(17/82)，家族腫瘤史6.10%(5/82)；TNM I～I(xiàn)I期44例，III～I(xiàn)V期38例，9例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。對(duì)照組(n=40)，男性22例，女性18例，平均年齡(58.55±12.73)歲，平均體重指數(shù)(23.90±3.75)kg/m2，吸煙史15.0%(6/40)，家族腫瘤史5.0%(2/40)。結(jié)腸癌患者和正常對(duì)照組在性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、家族腫瘤史等方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，從而排除潛在影響DNA甲基化水平的一些客觀因素。本研究是根據(jù)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行的。在詳細(xì)解釋了目的和具體程序之后，所有參與者簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-21/miR-34a基因表達(dá)情況 采用Trizol試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)和糞便RNA提取試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司)分別提取組織樣本和糞便樣本中的總RNA。采用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量，只采用A260/280 nm1.8～2.0的RNA片段用于逆轉(zhuǎn)錄。以5μg/L的RNA為模板，采用通用cDNA合成試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)合成cDNA。利用Roche LC480系統(tǒng)檢測(cè)miR-21/miR-34a的表達(dá)。根據(jù)Primer Finder數(shù)據(jù)庫(kù)(www.applied-science.roche.com)設(shè)計(jì)了miR-21、miR-34a的PCR引物序列，并委托上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系包含2μL特異性引物、8μL DNA模板、10μL LC480 SYBR Green I Master mix，總體積為20μL。PCR反應(yīng)混合液在95℃預(yù)變性5min，然后經(jīng)過(guò)45個(gè)三步擴(kuò)增周期(95℃5s，50℃15 s，72℃5s)。所有樣本平行進(jìn)行3次，取平均值。以5srRNA和U6snRNA作為內(nèi)源參考，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。采用2-ΔΔCT法比較相對(duì)miRNA表達(dá)水平。miR-21引物序列為(正向)5’-GCG GTA GCT TAT CAG ACT GA-3’，(反向)5’-TGC GTG TCG TGG AGT C-3’。miR-34a引物序列為(正向)5’-GCG GTA GCT TAT CAG ACT GA-3’，(反向)5’-TGC GTG TCG TGG AGT C-3’。 U6引物序列為(正向)5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，(反向)5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。qRT-PCR反應(yīng)特異性由熔解曲線判斷，若呈單峰則特異。在分析miRNAs表達(dá)與病理分期的關(guān)系時(shí)，將中位數(shù)設(shè)為臨界值(臨界值高值和下限值均為50%)，95%置信區(qū)間。

1.2.2 甲基化特異性PCR(MSP)法分析miR-21/miR-34a基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 用液氮砂漿將組織標(biāo)本(20 ± 1 mg)快速研磨成粉末。糞便樣品(200～220 mg)稱重后，置于2 mL微量離心管中離心，然后加入1.6 mL緩沖液。所有的操作步驟都在冰浴中完成。分別用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(大連寶生公司)和QIAamp DNA Stool Mini Kit(美國(guó)Qiagen公司)提取組織和糞便基因組DNA。用紫外分光光度法測(cè)定DNA的濃度，同樣采用A260/280 nm1.8～2.0的DNA片段用于逆轉(zhuǎn)錄。使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)對(duì)1.5～2.0μL DNA樣本進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。將修飾后的DNA稀釋成15 μL保存。合成MSP引物，配制25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)混合液在95℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)過(guò)45個(gè)三步擴(kuò)增周期(95℃5 s，50℃ 15 s，72℃ 5 s)，最后的延伸步驟在72℃下進(jìn)行5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠分離，凝膠成像分析系統(tǒng)顯示清晰的特征DNA條帶。miR-21甲基化引物序列為(正向)5’-ATT CGT TTC GTT TCG CGT TCG TTT C-3’，(反向)5’-CTA AAA CTA ACT CTC TCG ACC CCG-3’。miR-21非甲基化引物序列為(正向)5’-TTT TTA TTT GTT TTG TTT TGT GTT TGT TTT G-3’，(反向)5’-CCT AAA ACT AAC TCT CTC AAC CCC A-3’。miR-34a甲基化引物序列為(正向)5’-GGT TTT GGG TAG GCC GTT TC-3’，(反向)5’-TCC TCA TCC CCT TCA CCG CCG-3’。miR-34a非甲基化引物序列為(正向)5’-NNG GTT TTG GGT AGG TGT GTT TT-3’，(反向)5’-AAT CCT CAT CCC CTT CAC ACC A-3’。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，若甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，而非甲基化特異性引物未擴(kuò)增出條帶則為甲基化；若非甲基化特異性引物擴(kuò)增出目的條帶，而甲基化引物未擴(kuò)增出條帶，則為非甲基化；若甲基化或非甲基化引物都能擴(kuò)增出目的條帶，則判斷為部分甲基化。

1.2.3 血清學(xué)指標(biāo)檢查 采集糞便樣本同時(shí)留取血液樣本，2 000 r/min離心10 min取上清，-80℃保存直至分析。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interluekin-6，IL-6)水平。試劑盒購(gòu)自美國(guó)Genzyme公司。

1.2.4 糞便隱血檢測(cè) 以糞便隱血膠體金檢測(cè)試紙法檢測(cè)所有參與者的糞便樣本。若試紙出現(xiàn)藍(lán)綠色則為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織中miR-21、miR-34a表達(dá)和甲基化狀態(tài) 與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中miR-21相對(duì)表達(dá)量升高，同時(shí)miR-34a相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而經(jīng)qMSP法檢測(cè)，結(jié)腸癌組織中miR-21啟動(dòng)子甲基化率(6例完全甲基化和19例部分甲基化)較癌旁組織降低，同時(shí)miR-34a啟動(dòng)子甲基化率(26例完全甲基化和32例部分甲基化)較癌旁組織升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1和圖1)。

表1 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織中miR-21、miR-34a表達(dá)和甲基化狀態(tài)(n=82)

2.2 兩組糞便中miR-21、miR-34a表達(dá)和甲基化狀態(tài) 與對(duì)照組相比，結(jié)腸癌患者糞便中miR-21相對(duì)表達(dá)量升高，同時(shí)miR-34a相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而經(jīng)qMSP法檢測(cè)，結(jié)腸癌患者糞便中miR-21啟動(dòng)子甲基化率(3例完全甲基化和14例部分甲基化)較對(duì)照組降低，同時(shí)miR-34a啟動(dòng)子甲基化率(33例完全甲基化和40例部分甲基化)較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2和圖2)。

表2 結(jié)腸癌患者和對(duì)照組人群糞便中miR-21、miR-34a表達(dá)和甲基化狀態(tài)

2.3 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a表達(dá)和甲基化狀態(tài)的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析，miR-21、miR-34a在結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中的表達(dá)量呈正相關(guān)性(r=0.782，0.618，P<0.001)。此外，根據(jù)Fisher’s精確概率法檢驗(yàn)結(jié)果，P<0.001，提示腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)不一致；而根據(jù)Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果，Kappa>0.4，P<0.001，提示腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a甲基化結(jié)果存在一致性，但是Kappa在0.4～0.75范圍內(nèi)，一致性一般(見(jiàn)表3、4和圖1)。

表3 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-21甲基化狀態(tài)的一致性

表4 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-34a甲基化狀態(tài)的一致性

圖1 結(jié)腸癌患者腫瘤組織和糞便中miR-21、miR-34a表達(dá)的Pearson相關(guān)性

2.4 糞便中miR-21、miR-34a甲基化檢測(cè)聯(lián)合糞便隱血試驗(yàn)對(duì)結(jié)腸癌的診斷價(jià)值 結(jié)腸癌的診斷以術(shù)后病理檢查作為金標(biāo)準(zhǔn)。糞便miR-21、miR-34a甲基化檢測(cè)分別聯(lián)合糞便隱血均能夠提高糞便隱血單獨(dú)用于結(jié)腸癌診斷的敏感性、特異性和檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表5)。

表5 糞便中miR-21、miR-34a甲基化檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌的診斷價(jià)值

2.5 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌患者糞便miR-21非甲基化和miR-34a甲基化狀態(tài)與腫瘤直徑有關(guān)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是與其他臨床病理特征，包括年齡、性別、吸煙史、病灶部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05，見(jiàn)表6)。

表6 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化檢測(cè)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.6 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與血清TNF-α、IL-6水平的關(guān)系 結(jié)腸癌患者糞便miR-21非甲基化組血清TNF-α、IL-6水平較甲基化組水平升高，同時(shí)糞便miR-34a甲基化組血清TNF-α、IL-6水平較非甲基化組水平亦升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表7)。

表7 結(jié)腸癌患者糞便中miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與血清TNF-α、IL-6水平的關(guān)系

3 討論

本研究利用人糞便標(biāo)本，證實(shí)結(jié)腸癌患者糞便miR-21呈低甲基化，同時(shí)miR-34a則呈高甲基化，聯(lián)合檢測(cè)糞便miR-21或miR-34a甲基化狀態(tài)可以提高糞便隱血用于結(jié)腸癌診斷的敏感性、特異性和檢出率，因此可作為常規(guī)篩查手段的輔助工具，以提高早期結(jié)腸癌的篩查或診斷率。此外糞便miR-21和miR-34a甲基化狀態(tài)發(fā)生變化可能與下游TNF-α炎癥信號(hào)通路的激活也有一定的關(guān)系，進(jìn)而促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞癌變的進(jìn)展。

在我國(guó)，結(jié)腸癌患者5年生存率極低，這可能與早期篩查手段有限有關(guān)[7]。因此迫切需要新的健全和可靠的診斷方法來(lái)改進(jìn)現(xiàn)有的篩查策略，以提高結(jié)腸癌的早期診斷率，進(jìn)而改善患者預(yù)后。目前大多數(shù)針對(duì)結(jié)腸癌篩查或診斷的非侵入性分子檢測(cè)都是基于糞便和/或血液的分析。例如免疫學(xué)糞便隱血檢測(cè)(Fecal occult blood testing，F(xiàn)OBT)就是最常用的檢測(cè)方法。然而，F(xiàn)OBT檢測(cè)也有一些局限性，例如對(duì)于結(jié)腸癌和結(jié)腸腺瘤的鑒別診斷敏感性較低。另一種鑒別結(jié)直腸和其他良性腫瘤的有前途的方法是檢測(cè)糞便中代表癌癥相關(guān)基因和/或表觀遺傳變異譜的分子生物標(biāo)志物。腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞不斷脫落，進(jìn)入糞便，這為發(fā)現(xiàn)癌癥相關(guān)基因“特征”提供了基礎(chǔ)[8]。在本研究中，結(jié)腸癌miR-21表達(dá)量普遍升高，同時(shí)miR-34a表達(dá)量則降低，這與其基因啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化或者超甲基化有關(guān)；且這兩項(xiàng)因子在糞便組織和癌組織中的表達(dá)變化和甲基化狀態(tài)基本一致，說(shuō)明糞便DNA檢測(cè)能夠敏感地反應(yīng)腫瘤組織中的DNA分子變化。雖然眾多研究也已證實(shí)糞便DNA甲基化檢測(cè)的可行性，但是由于臨床醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)有限，目前糞便DNA檢測(cè)暫時(shí)只能作為研究或試驗(yàn)用，距臨床應(yīng)用尚需要大量的工作支持[9]。但是本研究結(jié)果也為篩選糞便中的生物標(biāo)志分子提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。

眾多研究表明，miR-21的表達(dá)增加與結(jié)腸癌[9]等多種惡性腫瘤密切相關(guān)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡具有促進(jìn)作用。例如You等[10]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-21表達(dá)后，可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的增殖，而且miR-21在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，與患者的惡性化程度呈正相關(guān)性，但與生存率呈負(fù)相關(guān)性。說(shuō)明miR-21可能參與結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的調(diào)控。此外Hulf等[11]學(xué)者證實(shí)，在前列腺癌細(xì)胞系中，miR-21啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)被抑制；而經(jīng)去甲基化藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理后，可導(dǎo)致miR-21表達(dá)上調(diào)。Ortiz等[12]學(xué)者采用Illumina的450K甲基化芯片分析、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩查、數(shù)據(jù)驗(yàn)證(焦磷酸測(cè)序和qRT-PCR)和功能分析等方法，證實(shí)miR-21和miR-146b 可能受到去甲基化的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致miR-21和miR-146b表達(dá)模式發(fā)生改變；并且通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在TPC1細(xì)胞系中檢測(cè)到由于甲基化丟失導(dǎo)致miR-21表達(dá)增加。因此作者推斷檢測(cè)miR-21基因的甲基化和表達(dá)水平對(duì)惡性病變和良性病變的鑒別具有潛在的臨床價(jià)值。為了證實(shí)上述推斷，我們首先檢測(cè)了結(jié)腸癌組織標(biāo)本中miR-21的表達(dá)情況和甲基化狀態(tài)，證實(shí)miR-21在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，同時(shí)伴有甲基化丟失，說(shuō)明miR-21表達(dá)增加是由于DNA甲基化缺失引起的轉(zhuǎn)錄機(jī)制和生物學(xué)途徑的中斷。而且糞便組織中miR-21表達(dá)水平直接反映了結(jié)腸癌組織的狀態(tài)，但是甲基化狀態(tài)與腫瘤組織中存在一定的差異，這可能與樣本量偏少有關(guān)。同樣miR-34a在結(jié)腸癌組織和患者的糞便樣本中也出現(xiàn)表觀遺傳學(xué)改變。miR-34a在結(jié)腸癌組織中表現(xiàn)出頻繁的表觀沉默，而在鄰近的正常腸黏膜組織中則沒(méi)有表現(xiàn)，這可能是導(dǎo)致miR-34a表達(dá)量下調(diào)的主要原因，這與很多其他類(lèi)型的癌癥研究結(jié)論基本一致[13-14]，如miR-34a高甲基化可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力。

此外，我們還分析了糞便miR-21、miR-34a的甲基化狀態(tài)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，由于納入的樣本量有限，我們進(jìn)證實(shí)糞便miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與腫瘤直徑有關(guān)。這也可以分子機(jī)制角度解釋?zhuān)鏼iR-34a表達(dá)下降與c-Met、Snail和β-catenin蛋白水平上調(diào)有關(guān)，而這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)是促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要原因[15]。除此以外，我們還發(fā)現(xiàn)，糞便miR-21、miR-34a甲基化狀態(tài)與血清炎癥因子TNF-α、IL-6水平升高有關(guān)。炎癥是結(jié)腸癌發(fā)生和進(jìn)展的重要機(jī)制。一些炎癥細(xì)胞因子在癌癥組織中被上調(diào)，包括TNF-α、IL-6等，進(jìn)而導(dǎo)致壞死和炎癥，并促進(jìn)癌癥的發(fā)生。而miR-21、miR-34a和TNF-α旁分泌/自分泌之間的關(guān)系早已被多項(xiàng)研究證實(shí)[16-19]。但是根據(jù)miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，人們認(rèn)為T(mén)NF-α并非miR-21或miR-34a的直接靶標(biāo)，因此miR-21、miR-34a對(duì)TNF-α蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)間接途徑發(fā)生的，但具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚需進(jìn)一步完善。

綜上所述，結(jié)腸癌患者糞便和癌組織中miR-21呈低甲基化，同時(shí)miR-34a呈高甲基化，聯(lián)合檢測(cè)糞便中miR-21或miR-34a甲基化狀態(tài)都能夠提高糞便隱血對(duì)結(jié)腸癌的臨床診斷效能。但是是否具有臨床推廣價(jià)值尚需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論的可靠性。