鞠東玲，侯雯莉，王振國(guó)，侯世科，胡金朋

(1.武警特色醫(yī)學(xué)中心 軍人全科醫(yī)學(xué)科，天津 300162；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心 研究部，天津 300162)

肝癌是全球最常見(jiàn)的癌癥死亡原因，我國(guó)腫瘤登記數(shù)據(jù)顯示肝癌在惡性腫瘤發(fā)病中位列第4位，死亡中位列第2位[1-2]。癌癥的本質(zhì)是基因突變，每種類(lèi)型的癌癥都有許多獨(dú)特的表觀遺傳和遺傳變異[3]。探索腫瘤發(fā)展過(guò)程及癌癥表達(dá)譜，為了解疾病的分子基礎(chǔ)以用于患者的潛在診斷和治療靶標(biāo)提供寶貴見(jiàn)解[4]。分泌的磷蛋白1(SPP1)，也稱(chēng)為骨橋蛋白(OPN)，是一種整合素結(jié)合蛋白，可從各種類(lèi)型的細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞)中分泌出來(lái)。在人類(lèi)中，SPP1由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成，并編碼在4號(hào)染色體(4q13)上[5]。 SPP1涉及多個(gè)生理和病理過(guò)程。最近的研究報(bào)道，SPP1與腫瘤生長(zhǎng)、粘附和侵襲顯著相關(guān)，并且在肺癌[6]、結(jié)腸癌[7]、乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、胰腺癌[10]和肝細(xì)胞肝癌[11]中過(guò)表達(dá)。SPP1的表達(dá)水平與腫瘤的分期和惡性程度相關(guān)，這表明SPP1可能是幾種癌癥的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料及生存曲線比較 從包含TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://www.linkedomics.org)下載肝癌患者數(shù)據(jù)集TCGA_LIHC RNASeq和TCGA_LIHC Clinical，篩選出同時(shí)包含生存時(shí)間數(shù)據(jù)信息和CXCR4基因表達(dá)數(shù)據(jù)的患者共343例，比較基因表達(dá)水平與年齡、種族及放療狀況的相關(guān)性。按照SPP1表達(dá)水平由低到高排序，將排在前50%的172例患者設(shè)為高表達(dá)組，年齡(57.96±13.76)歲，剩余171例患者設(shè)為低表達(dá)組，年齡(60.43±12.42)歲，并繪制兩組患者生存曲線，兩組患者年齡沒(méi)有差異。同時(shí)選擇2016年8月至2020年8月我院接收的57例肝癌患者為實(shí)驗(yàn)組，平均年齡(59.25±12.31)歲，對(duì)照組為25例本院近期健康體檢者，平均年齡(58.33±10.57)歲，兩組患者年齡沒(méi)有差異。本實(shí)驗(yàn)符合并通過(guò)本院倫理審批，批準(zhǔn)號(hào)：20160703。

1.2 SPP1在不同腫瘤分期中的比較 根據(jù)腫瘤的病理學(xué)分期及TNM分期，將患者分別歸入相應(yīng)的各組，比較SPP1基因在不同分期中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 SPP1相關(guān)基因篩選 利用Omisc軟件，將檢測(cè)的所有基因表達(dá)水平逐一與SPP1表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，根據(jù)相關(guān)系數(shù)選取與SPP1表達(dá)水平相關(guān)性最高的50個(gè)基因，并繪制基因熱圖。

1.4 血清蛋白檢測(cè) 肝癌患者及健康體格檢查者均在晨起、空腹時(shí)采集上肢靜脈血5 mL。采用低溫離心機(jī)(艾本德5427R)3 000 r/min，離心10 min，取上清。按照試劑說(shuō)明書(shū)采用ELISA法檢測(cè)OPN(Abcam公司ab214050)和甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)(abcam公司ab108838)。

1.5 Child-Pugh 分級(jí) 按評(píng)分值分級(jí)：A 級(jí)5～6 分，B 級(jí)7～9 分，C 級(jí)≥10 分，見(jiàn)表1。

表1 Child-Pugh 分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 SPP1表達(dá)差異對(duì)生存時(shí)間的影響 SPP1高表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間低于SPP1低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(712 d vs 1 327 d，P<0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 兩組患者生存曲線比較

2.2 不同分期患者SPP1表達(dá)差異 根據(jù)病理分期分組， 4組間SPP1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.238，P<0.05)，其中Ⅰ期患者SPP1表達(dá)水平顯著低于Ⅱ～Ⅳ期的患者，Ⅳ期SPP1表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅲ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，見(jiàn)圖2A)。根據(jù)T分期分組， 4組間SPP1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.215，P<0.05)，其中T1期患者SPP1表達(dá)水平顯著低于T2～T4期患者，T4期SPP1表達(dá)水平高于T1-3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，見(jiàn)圖2B)。

A：SPP1病理分期比較，a：與Ⅰ 期比較，P<0.05；b：與Ⅳ期比較，P<0.05；B：SPP1的T分期比較，a：與T1期比較，P<0.05；b：與T4期比較，P<0.05。圖2 不同病理分期患者SPP1表達(dá)水平差異

2.3 SPP1相關(guān)基因的篩選 在檢測(cè)到的19 366個(gè)基因中，有10 285個(gè)基因與SPP1相關(guān)(P<0.05，見(jiàn)圖3A)，選取與SPP1表達(dá)正相關(guān)系數(shù)最高的前50個(gè)基因，并繪制基因熱圖(見(jiàn)圖3B)；通過(guò)文獻(xiàn)檢索這50個(gè)基因中有42個(gè)基因與腫瘤相關(guān)，其中與SPP1最相關(guān)的葡糖胺(N乙酰)轉(zhuǎn)移酶3(Glucosaminyl (Nacetyl) transferase 3，GCNT3)和膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)均與肝癌相關(guān)[12-13]。

A：SPP1與各基因的相關(guān)性分析結(jié)果；B：與SPP1表達(dá)相關(guān)系數(shù)最高的前50個(gè)基因。圖3 SPP1相關(guān)基因篩選結(jié)果

2.4 組間血清指標(biāo)比較及相關(guān)分析 兩組患者SPP1和AFP組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SPP1表達(dá)水平均與AFP正相關(guān)(r=0.514，P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 肝癌組與對(duì)照組檢測(cè)指標(biāo)比較

2.5 不同Child-Pugh分級(jí)肝癌患者SPP1比較 隨著Child-Pugh 分級(jí)的遞增，SPP1逐漸增高，在C 級(jí)達(dá)到最高水平，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，見(jiàn)表3)。

表3 不同Child-Pugh分級(jí)組間SPP1比較

2.6 肝癌患者SPP1及AFP的ROC 曲線 SPP1的ROC 曲線下面積為0.894(95%CI：0.807～0.982)，當(dāng)診斷界值確定為135.5μg/L 時(shí)，SPP1診斷肝癌的靈敏度為92.0%，特異性為60.7%；AFP 的ROC 曲線下面積為0.799(95%CI：0.694～0.903)，當(dāng)界值確定為18.38μg/L 時(shí)，AFP 診斷肝癌的靈敏度為92.0%，特異性為58.9%；GP73 和AFP 聯(lián)合檢測(cè)的ROC 曲線下面積為0.944(95%CI：0.903～0.985)，聯(lián)合診斷的靈敏度為97.6%，特異性為71.4%(見(jiàn)圖4)。

圖4 SPP1及AFP診斷肝癌的ROC曲線

3 討論

迄今為止，人們對(duì)SPP1在癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的詳細(xì)功能和作用知之甚少。因此，本研究就SPP1在肝癌中的預(yù)后、診斷價(jià)值和表達(dá)模式展開(kāi)分析。在缺乏明確的機(jī)理研究的情況下，我們無(wú)法僅根據(jù)表達(dá)水平將特定基因定義為腫瘤促進(jìn)/抑制基因，但是，利用廣泛的致癌數(shù)據(jù)庫(kù)可為研究人員提供對(duì)這些基因的分子機(jī)制的更深入理解。對(duì)SPP1與各種腫瘤預(yù)后之間關(guān)系的分析表明，SPP1在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、肝癌、肺癌和食道癌中表達(dá)上調(diào)[6-11]。并且高水平的SPP1基因表達(dá)與這些癌癥的不良預(yù)后有關(guān)。據(jù)報(bào)道，SPP1可增強(qiáng)癌細(xì)胞的存活，血管生成和炎癥反應(yīng)[14]，同時(shí)通過(guò)促進(jìn)上皮到間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)渡[15]。這些研究在一定程度上說(shuō)明SPP1促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)GCNT3和ANXA2與SPP1表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)最高，其中GCNT3基因是參與粘蛋白生物合成的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶家族成員。眾所周知，GCNT3的異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)多種人類(lèi)癌癥的進(jìn)展[16]。Liu等[12]研究通過(guò)人肝癌細(xì)胞系、原位異種移植瘤和臨床組織樣本證明了GCNT3上調(diào)與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的證據(jù)。差異轉(zhuǎn)錄的糖基因可能是新藥物的潛在靶點(diǎn)，也可能作為預(yù)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。ANXA2主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，參與多種細(xì)胞過(guò)程[17-18]。在肝癌中，ANXA2的表達(dá)不僅與腫瘤大小和分化程度相關(guān)，還與其他癌癥的發(fā)展有關(guān)，如乳腺癌、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、肺癌等。STAT3是調(diào)控肝癌進(jìn)展的另一個(gè)關(guān)鍵分子，通過(guò)磷酸化持續(xù)激活，誘導(dǎo)肝損傷[19]。ANXA2/STAT3的直接相互作用促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲，而ANXA2的Tyr23磷酸化依次激活STAT3的潛在分子機(jī)制[17,19]。一項(xiàng)相關(guān)研究確實(shí)表明，STAT3阻斷全細(xì)胞肝癌疫苗可以誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答對(duì)抗肝癌。此外，一些研究表明，STAT3與其他蛋白(如己糖激酶2、Jab1/Csn5)的相互作用可能導(dǎo)致癌癥進(jìn)展[20-21]。

為進(jìn)一步分析SPP1對(duì)肝癌的診斷分析的作用，本研究分析了SPP1血清表達(dá)蛋白OPN與肝癌診斷指標(biāo)AFP的相關(guān)性，以及對(duì)肝癌Child—pugh評(píng)分的影響。結(jié)果表明SPP1表達(dá)蛋白OPN不僅與AFP呈正相關(guān)，還與Child—pugh分級(jí)密切相關(guān)，可以作為Child—pugh分級(jí)參考指標(biāo)。肝炎會(huì)導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)展，肝硬化患者的最新scRNA-Seq分析[22]和肝癌免疫學(xué)[23]揭示SPP1在炎癥細(xì)胞亞群中表達(dá)增加。OPN在肝纖維化中起關(guān)鍵作用，因?yàn)樗ㄟ^(guò)依賴(lài)TGF-β的機(jī)制激活HSC并誘導(dǎo)I型膠原沉積[24]。重組OPN可以激活肝癌細(xì)胞，并增強(qiáng)其侵襲性和傷口愈合潛力[25]。還有研究表明，OPN是肝癌的前瞻性血清生物標(biāo)志物，在對(duì)12項(xiàng)研究的薈萃分析中,血清OPN的ROC曲線下診斷HCC的面積要比AFP高[26]。此外，OPN與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)，多項(xiàng)研究表明，手術(shù)切除后的患者血清OPN與總體不良狀態(tài)和無(wú)病生存率以及較高的肝癌分期和腫瘤大小之間存在相關(guān)性[26]。并且本研究還發(fā)現(xiàn)OPN聯(lián)合AFP對(duì)肝癌、肝硬化患者的敏感性明顯高于單獨(dú)AFP檢測(cè)。

綜上所述，SPP1可能作為新型的輔助診斷肝癌、肝硬化的血清學(xué)標(biāo)志物，還有助于肝癌早期診斷并為分階段化護(hù)理策略提供參考。