趙芳芳，郭學(xué)良，劉 研，汪月寧，殷夢婷，代紅軍

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

隨著寧夏葡萄酒業(yè)的發(fā)展，釀酒葡萄的種植面積逐年擴(kuò)大，但主產(chǎn)區(qū)冬季低溫干旱，凍害頻繁發(fā)生，造成葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)下降，在一定程度上影響和制約著葡萄酒業(yè)的發(fā)展[1-3]。2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide,簡稱EBR)被譽(yù)為第六大植物生長調(diào)節(jié)劑[4]，極低濃度即可提高植物的抗性，如抗旱性、抗寒性和抗毒性[5-6]。釀酒葡萄對低溫反應(yīng)敏感，枝條萌發(fā)適溫為18～20℃，低于15℃萌芽率顯著降低，氣溫達(dá)到-25℃時(shí)植株將會死亡[7-8]。因此，尋找簡單有效的方法，對緩解釀酒葡萄的受害程度具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對解決釀酒葡萄生產(chǎn)有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。劉良松等[9]研究表明，EBR能有效緩解低溫脅迫對華山松幼苗的影響，降低活性氧對其幼苗的傷害，減輕膜脂過氧化程度，提高華山松幼苗的抗寒能力。劉麗杰等[10]研究表明，在低溫條件下， EBR能提高小麥葉片中保護(hù)酶活性，并通過多種作用機(jī)制，增加了小麥對低溫的抵抗力。張霓雯等[11]研究了低溫脅迫下，噴施EBR能明顯減緩黃金香柳葉片生長受抑制程度，顯著增加葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性，同時(shí)降低了MDA含量，表明外源應(yīng)用EBR可通過影響黃金香柳葉片葉綠素含量及促進(jìn)根系抗氧化系統(tǒng)活性升高，從而増強(qiáng)植株抗低溫的能力。近年來，許多學(xué)者對EBR在不同作物抗性方面的應(yīng)用進(jìn)行了大量研究，但在釀酒葡萄抗寒性方面的應(yīng)用少有報(bào)道。本研究以釀酒葡萄‘美樂’為試材，經(jīng)不同濃度EBR(0、0.2、0.4、0.6mg/L)噴施處理，隨后在低溫(5℃、-5℃、-10℃、-20℃)條件下處理，研究其對釀酒葡萄枝條抗寒性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2020年10月在寧夏農(nóng)墾集團(tuán)玉泉營農(nóng)場，國家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系栽培生理與調(diào)控崗位試驗(yàn)基地中進(jìn)行(北緯38°12′，東經(jīng)105°99′，冬季日均氣溫-11 ℃，絕對低溫-24 ℃)，20～ 40 cm處的地溫經(jīng)常達(dá)到-5 ℃以下。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料為5 a生歐洲釀酒葡萄‘美樂’。2020年10月3日果實(shí)采收后選取長勢基本一致的植株3行，每行4組，每組10株標(biāo)簽標(biāo)記。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，將各濃度EBR(0、0.2、 0.4、0.6 mg/L，依次標(biāo)記為CK、T1、T2、T3)噴施于葡萄整株，每組大約噴施10 L左右，以枝條滴水為準(zhǔn)，第1次噴施后隔1 d進(jìn)行第2次噴施處理，共計(jì)噴施2次。之后在埋土防寒前采樣，各組剪取1 a生枝條30枝，分別從基部起第6節(jié)剪取20～30 cm(粗度在0.9～1.1 cm)的枝條，剪取枝條后兩端封蠟，用保鮮膜密封后置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。

將埋土之前采集的樣本于4 ℃沙藏1個(gè)月后，分別置于5 ℃、-5 ℃、-10 ℃、-20 ℃的變溫試驗(yàn)箱(型號:BC1300)進(jìn)行低溫處理。降溫至設(shè)定溫度后持續(xù)24 h，之后逐步升溫至0 ℃，并保持12 h，升降溫速率均為4 ℃/1 h。其余枝條避開芽眼切成1～2 mm薄片，測定其相關(guān)指標(biāo)。

1.3 單芽段恢復(fù)生長試驗(yàn)

將用不同濃度油菜素內(nèi)酯和低溫處理后的單芽段用蒸餾水沖洗后晾干，插入含有輕型基質(zhì)的培養(yǎng)盤中，每個(gè)處理3盤，每盤10個(gè)單芽段。將培養(yǎng)盤置于人工氣候培養(yǎng)箱(MGC-100 H)中，白天溫度設(shè)置為23 ℃，夜間溫度15 ℃，濕度為60%～80%，光照度為3 000 lx。培養(yǎng)40 d后觀察記錄萌芽率，以露綠芽為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 測定指標(biāo)及方法

電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法(DDS-307型)測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量采用蔥酮比色法，游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法，過氧化物酶活性(POD)采用愈創(chuàng)木酚法[12-13]，超氧化物歧化酶活性(SOD)采用試劑盒法(購自南京建成生物科技有限公司)。扦插培養(yǎng)40 d后調(diào)查萌芽率，并按下式計(jì)算。

萌芽率=萌發(fā)芽總數(shù)/扦插芽段總數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、SPSS 21.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR處理對‘美樂’葡萄枝條相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響

在低溫脅迫條件下植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，致使電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大，因此，電導(dǎo)率越小，耐寒性就越強(qiáng)。由圖1可知，各處理葡萄枝條的電導(dǎo)率及MDA均隨溫度的降低而增加，在 -10 ℃低溫處理下，電導(dǎo)率差異顯著，其中CK的電導(dǎo)率值最大，為81.77%，T2處理電導(dǎo)率最小，為45.8%；經(jīng)EBR處理的葡萄枝條相對電導(dǎo)率和MDA增幅也較小，其中T2處理增幅最小，與CK相比增幅分別減少15.3%和51.2%。因此，EBR可以降低葡萄枝條細(xì)胞膜的損害程度，減少電解質(zhì)外滲。

圖1 ‘美樂’葡萄枝條中相對電導(dǎo)率和MDA含量Fig.1 Relative conductivity and malondialdehyde content in branches of ‘Merlot’ grape

2.2 EBR處理對‘美樂’葡萄枝條POD和SOD活性的影響

由圖2可知，隨溫度的降低，各處理葡萄枝條的POD活性呈先升后降趨勢。隨EBR濃度的增加，當(dāng)溫度大于-5 ℃處理時(shí)，POD活性呈先升后降趨勢，小于-5 ℃時(shí)，呈上升趨勢。經(jīng)EBR處理的葡萄枝條POD活性均高于CK，在-5 ℃時(shí)達(dá)到最大，其中0.4 mg/L處理差異顯著，與對照相比增加 48.05%；在-20 ℃時(shí)，POD活性有所下降，但經(jīng)EBR處理的葡萄枝條POD依然高于對照，0.6 mg/L處理差異顯著，與對照相比增加61.81%?？偟膩碚f，EBR能夠提高葡萄枝條的抗氧化能力，減輕膜脂氧化程度，其中濃度為0.4、0.6 mg/L EBR處理效果較好。隨著溫度的降低，各處理葡萄枝條的SOD活性呈波動趨勢，隨著EBR濃度的升高，SOD活性呈上升趨勢。EBR濃度為0.6 mg/L時(shí)，SOD活性最高，與CK差異顯著，這說明濃度為0.6 mg/L的EBR有利于提高葡萄枝條的SOD活性。溫度在-20 ℃時(shí)，SOD活性增幅最大，說明EBR在-20 ℃時(shí)，對葡萄枝條SOD活性的影響最大。

圖2 ‘美樂’葡萄枝條中POD和SOD活性Fig.2 Activity of POD and SOD in branches of ‘Merlot’ grape

2.3 EBR處理對‘美樂’葡萄枝條滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

從圖3可以看出，隨著溫度的降低，葡萄枝條脯氨酸含量呈先升后降的變化趨勢，但整體趨勢較為平穩(wěn)，除T1處理外，其余處理均高于對照。-10 ℃處理時(shí)，T2處理的脯氨酸含量最高，與CK相比增加8.65%；當(dāng)EBR濃度低于0.4 mg/L時(shí)，脯氨酸含量與CK接近，差異不顯著 (P>0.05)，說明濃度低于0.4 mg/L的EBR對提高葡萄枝條在低溫條件下的脯氨酸含量作用小。隨著溫度的降低，除T2處理外，各處理葡萄枝條的可溶性糖呈下降趨勢；隨著EBR濃度的增加，呈先升后降趨勢，經(jīng)EBR處理的葡萄枝條可溶性糖含量均高于CK。不同濃度EBR在5 ℃時(shí)各處理間差異不顯著，在-20 ℃條件下增幅最大，T2處理與CK相比增加46.96%；說明在低溫條件下EBR可以促進(jìn)可溶性糖的積累來保持滲透壓平衡，減少水分散失，避免植物因過量脫水死亡。

圖3 ‘美樂’葡萄枝條中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Fig.3 Osmotic adjustment substances in branches of ‘Merlot’ grape

2.4 EBR處理對‘美樂’葡萄枝條萌芽率的影響

由表1可知，通過對低溫脅迫后，各處理葡萄枝條進(jìn)行可恢復(fù)生長試驗(yàn)，得出各處理枝條在 5 ℃處理時(shí)生長勢較好，低溫脅迫后的萌芽率為60%以上；-5 ℃時(shí)，各處理萌芽率都有所降低，0.4 mg/L與對照相比增加了24.05%；-10 ℃，除了對照其余均高于60%以上，0.4 mg/L與對照相比增加了48.07%。在-20 ℃時(shí)，各處理萌芽率差異顯著，其中0.4 mg/L處理萌芽率最高，與對照相比增加了77.87%。這說明，EBR能夠提高低溫脅迫時(shí)葡萄枝條的萌芽率，且不同濃度對其影響不同，差異顯著，其中0.4 mg/L處理相對較好。

表1 ‘美樂’葡萄枝條的萌芽率Table 1 Germination rate of branches of ‘Merlot’ grape %

2.5 葡萄枝條抗寒指標(biāo)主成分分析

對不同濃度EBR處理的葡萄枝條中6種抗寒指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到提取要求80%以上的要求，為80.446%，可以代表6種抗寒指標(biāo)的絕大部分信息。從表2可知，第一主成分的特征值為3.128，貢獻(xiàn)率為52.125%，主要反映低溫脅迫下EBR對葡萄枝條中電導(dǎo)率、MDA的影響；第二主成分的特征值為1.699，貢獻(xiàn)率為28.321%，主要反映低溫脅迫下EBR對葡萄枝條中POD、SOD、脯氨酸的影響，因此抗氧化酶可作為第二主成分。

表2 主成分分析Table 2 Principal component analysis

3 討 論

3.1 EBR處理對‘美樂’葡萄枝條萌芽率的影響

低溫脅迫將會導(dǎo)致植物萌芽延遲、生長發(fā)育受阻，生長量增加遲緩，脅迫嚴(yán)重時(shí)生長完全停止[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，噴施EBR對煙草萌芽有顯著促進(jìn)作用，隨處理濃度升高，促進(jìn)作用增強(qiáng)[15]。也有研究表明，適宜濃度的EBR能有效緩解低溫脅迫對水稻萌芽的影響[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨低溫脅迫程度的增加，各處理萌芽率都有所降低，但經(jīng)EBR處理的葡萄枝條萌芽率隨溫度的減低降幅較小，0.4 mg/L處理的EBR能夠顯著提高葡萄枝條的萌芽率。這與前人研究結(jié)果一致[15-16]。

3.2 EBR處理對‘美樂’葡萄枝條生理指標(biāo)的影響

植物受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累，使其代謝失衡，導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)生丙二醛(MDA)，最終造成細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)的離子外滲，細(xì)胞的相對電導(dǎo)率增大[17-18]。此時(shí)，植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)活性增加，防止細(xì)胞內(nèi)過量積累的活性氧對植物造成的氧化傷害。SOD作為植物細(xì)胞的第一道抗氧化防線，能將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。POD能將過氧化氫(H2O2)分解，從而緩解了由于活性氧積累對細(xì)胞帶來的傷害[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后，經(jīng) 0.4 mg/L處理的葡萄枝條的電導(dǎo)率和MDA含量最低，適當(dāng)濃度的EBR可以降低MDA含量和減少離子外滲，這與小麥和甘薯等其他作物上的研究結(jié)果一致[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫時(shí)，0.4 mg/L和0.6 mg/L的EBR使得SOD活性都顯著增強(qiáng)，EBR濃度為0.4 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，這與楊蓮等[22]對番茄的研究基本一致，0.2 mg/L的SOD活性雖然也增強(qiáng)，但不顯著。這說明一定濃度的EBR能顯著提高葡萄枝條POD活性，從而降低氧自由基含量，清除過多的活性氧，從而減輕膜脂過氧化程度，進(jìn)而增強(qiáng)葡萄枝條的抗寒性。這與張愛敏等[23]在低溫脅迫下BR處理能提高黃瓜POD活性以及吳旺嬪等[24]對低溫脅迫下EBR處理可使水稻種子的POD活性顯著增強(qiáng)的研究結(jié)果一致。

低溫脅迫下植物細(xì)胞內(nèi)正常的代謝活動會發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)會積累一些滲透調(diào)物質(zhì)來維持細(xì)胞膨壓對一些生理功能的調(diào)控，從而緩解逆境脅迫給植物帶來的傷害[9]。本研究中EBR促進(jìn)了枝條對可溶性糖和脯氨酸的積累，可溶性糖在 0.4 mg/L處理中積累得最多，而EBR對脯氨酸積累則不顯著，這說明葡萄枝條在受到低溫脅迫時(shí)，通過提高自身可溶性糖含量來增強(qiáng)抵抗低溫的能力，這與其他學(xué)者在作物[25-26]中的研究結(jié)果一致。植物在受到低溫脅迫時(shí)EBR可調(diào)控葡萄植株積累較多的可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些可溶性糖可防止細(xì)胞脫水，降低冰點(diǎn)，從而減輕低溫傷害。

4 結(jié) 論

EBR提高了葡萄枝條的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，減少了質(zhì)膜受損程度，提高了葡萄枝條的抗寒性，其中0.4 mg/L表現(xiàn)最優(yōu)。