孫亞欽，葉盛嘉，范國安,2，張 影，劉 星，吳大付，王 菲

(1. 河南科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

在植物的生長發(fā)育過程中，磷不僅是植物體內(nèi)多種重要化合物的組分，而且還參與糖等重要物質(zhì)的代謝過程。由于磷在土壤中移動性小且固定性高，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的大量施用在保證糧食生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)步增長的同時(shí)，也對生態(tài)環(huán)境造成一定風(fēng)險(xiǎn)，這種以環(huán)境為代價(jià)來換取糧食高產(chǎn)的方式已不符合農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的戰(zhàn)略。因此，充分挖掘土壤本身的生物學(xué)潛力是提高作物磷素利用的一種有效方式，對實(shí)現(xiàn)“產(chǎn)出高效、產(chǎn)品安全、資源節(jié)約、環(huán)境友好”的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展之路有重要 意義。

土壤中存在大量的微生物(全球約為 (4×1030～5×1030)[1]，特別是與磷素循環(huán)相關(guān)的微生物，在土壤磷素活化和植物磷養(yǎng)分吸收過程中扮演著重要角色[2-3]。在如此豐富的微生物中，有一類能夠通過利用自身代謝產(chǎn)物或者與其他生物的協(xié)同作用，將土壤中難溶性的磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的磷酸鹽，這類微生物叫做解磷微生物(Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM)，包括細(xì)菌、真菌和放線菌，但從數(shù)量和種類上來講，解磷細(xì)菌在解磷微生物中所占的比重最大[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，解磷細(xì)菌可占到土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的40%左右[5]，而且解磷潛力可達(dá)到整個(gè)微生物群體的50%[4]，是與磷的活化和周轉(zhuǎn)密切相關(guān)的一類。因此，篩選高效的解磷菌株對提高磷肥利用率和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展具有重大意義。國內(nèi)外已經(jīng)有許多學(xué)者對解磷細(xì)菌的分離篩選、鑒定、解磷效果等方面進(jìn)行了大量研究，如馮哲葉[6]篩選具有較好解磷能力的解磷細(xì)菌，并將其與有機(jī)肥共同接種于盆栽中，發(fā)現(xiàn)大豆植株的莖粗、株高、葉寬和生物量有顯著的提高，并且對磷素的積累有明顯的增加；唐岷宸等[7]將解磷細(xì)菌接種于盆栽黑葉葵扇白菜中，其鮮質(zhì)量增加65.5%，葉片全磷含量增加46.9%。這些研究表明解磷細(xì)菌不僅可以提高植物對磷的吸收利用，還能促進(jìn)土壤中有益微生物的代謝活動，改善植物根際環(huán)境，從而達(dá)到增產(chǎn)效果。因此，通過利用土壤中的解磷微生物來調(diào)控土壤-植物的磷素循環(huán)是一種極佳的方式。同時(shí)，篩選高效的解磷細(xì)菌并對其解磷能力進(jìn)行探索，對于提高磷肥利用率和改善植物的磷營養(yǎng)狀況以及改善土壤條件意義重大。

許多有關(guān)解磷細(xì)菌分離篩選的研究都是以難溶性無機(jī)磷Ca3(PO4)2作為唯一磷源來開展的[8-13]，而土壤中占全磷29%～90%的有機(jī)磷[14]也可以通過解磷細(xì)菌的酶解作用轉(zhuǎn)化成植物能夠吸收利用的無機(jī)磷[15]，但對于解有機(jī)磷細(xì)菌的分離篩選等方面的研究還較少。因此，本文通過對麥田土壤中解有機(jī)磷細(xì)菌的分離篩選及其解磷能力分析，以期了解具有解有機(jī)磷功能的細(xì)菌種類，為解磷細(xì)菌活化土壤有機(jī)磷的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為豐富解磷微生物資源庫提供高效的菌株資源以及微生物肥料的應(yīng)用提供一定的 參考。

1 材料與方法

1.1 土壤的采集與處理

土壤樣品采自河南省林州市姚村鎮(zhèn)的小麥田(113.8°E，36.17°N)，采用五點(diǎn)取樣法，去除表層可見的動植物殘?bào)w，用土鉆取0～20 cm深度的麥田土壤，并裝入無菌袋中，放于4 ℃冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，再將五個(gè)樣點(diǎn)的麥田土壤混勻并過篩(2 mm)，采用四分法收集約200 g的土壤放入樣品采集袋中，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 培養(yǎng)基的配制

有機(jī)磷固體培養(yǎng)基參考國際植物研究所磷酸鹽生長培養(yǎng)基(National Botanical Research Institute’s Phosphate Growth Medium，NBRIP)[16]，成分和含量稍作調(diào)整，葡萄糖(C6H12O6)10 g/L，植酸鈣(Phytin)2 g/L，氯化鎂(MgCl2·6H2O)5 g/L，硫酸鎂 (MgSO4·7H2O)0.25 g/L，氯化鉀(KCl)0.2 g/L，硫酸銨[(NH4)2SO4]0.1 g/L，瓊脂粉15 g/L，有機(jī)磷液體培養(yǎng)基則不需要加入瓊脂粉，pH 7.0。Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基成分和含量：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0。所有培養(yǎng)基在使用前都需要在121 ℃下滅菌30 min。

1.3 解磷細(xì)菌的分離和純化

利用平板稀釋法及選擇性有機(jī)磷培養(yǎng)基對麥田土壤中的解磷細(xì)菌進(jìn)行分離篩選。具體操作如下：在超凈工作臺中稱取新鮮土壤樣品5 g于無菌離心管中，用無菌水定容至50 mL，振蕩20 min，使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，然后按10倍梯度依次進(jìn)行稀釋，用移液槍吸取10-4～10-63個(gè)稀釋度的樣品各0.1 mL，均勻涂布于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度重復(fù)3次，最后在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)并觀察平板中菌落生長狀況及透明圈的產(chǎn)生情況。

用接種環(huán)挑取具有溶磷圈且未發(fā)生重疊的菌落，在新的有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上按照Z字形劃線純化，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，直至得到純菌株，然后置于4 ℃冰箱中保存。

1.4 菌株解磷能力的分析

1.4.1 溶磷圈的測定 將分離純化得到的純菌株點(diǎn)接于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d，觀察溶磷圈產(chǎn)生情況，并選取互相垂直的方向分別測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，分別計(jì)算溶磷指數(shù)(PSI)(PSI=D/d)和溶磷效率(PSE)(PSE=(D-d)/d×100%)以便于對各菌株的解磷能力進(jìn)行初步判斷[17-18]。

1.4.2 解磷能力的定量分析 將篩選得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，600 nm波長下測量菌液的OD值，使其OD600=0.6，然后在5 000 r/min下離心3 min，棄上清液后，用0.85%的NaCl溶液清洗菌體3次，再用0.85%的NaCl溶液定容至15 mL，充分搖勻后用移液槍從中吸取1 mL菌懸液加到有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以不接種菌液的處理為對照，每個(gè)菌株重復(fù)3次，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，隨后于12 000×g 離心2 min，吸取10 mL上清液測定培養(yǎng)液pH，另外吸取1 mL上清液作為待測液，采用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中速效磷的含量[19]，并計(jì)算植酸鈣的活化率[活化率=(接種菌液樣品中的速效磷含量-不接種菌液樣品中的速效磷含量)/接種菌液樣品中的速效磷含量×100%]，然后再吸取1 mL上清液作為待測液，根據(jù)培養(yǎng)液pH，以對硝基苯磷酸二鈉(p-NPP，150 mmol/L)作為反應(yīng)底物測定培養(yǎng)液中的磷酸酶活性[20]。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 采用AxyPrep細(xì)菌基因組DNA 小量制備試劑盒(Axygen，USA)提取細(xì)菌的基因組DNA，具體步驟按照操作說明進(jìn)行。

1.5.2 細(xì)菌基因組PCR擴(kuò)增 采用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)如下：基因組DNA(20 ng/μL)1.0 μL， 10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)5.0 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)1.0 μL，dNTP(10 μmol/L)1.0 μL，27F 引物(10 μmol/L)1.5 μL，1492R 引物(10 μmol/L)1.5 μL，ddH2O 39 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物取3 μL用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)PCR擴(kuò)增 片段。

1.5.3 PCR產(chǎn)物的純化 PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，具體步驟按照操作說明進(jìn)行。

1.5.4 序列測定 取各個(gè)樣品純化后的PCR產(chǎn)物，在上海派森諾生物科技股份有限公司利用ABI3730XL測序儀進(jìn)行雙向測序。

1.5.5 序列分析 利用ChromasPro軟件截去無效序列后，再用BioEdit軟件對雙端有效序列進(jìn)行拼接，然后以Blast程序?qū)⒑细裥蛄信cNCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，獲得與待測菌株序列相似性最大的菌株信息，即為鑒定結(jié)果，并將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得序列號。最后利用MEGA 7.0軟件[21]對所獲得的菌株序列以及與其相似性較高的16S rRNA基因序列進(jìn)行排列并采用Neighbor-joining方法[22]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Pearson相關(guān)性分析，通過新復(fù)極差法(Duncan’s)來比較差異的顯著性(P<0.05)，最后用Microsoft Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株解磷能力的定性分析

通過對解磷細(xì)菌PSI與PSE的計(jì)算(表1)，發(fā)現(xiàn)菌株FLP36的PSI和PSE最大，顯著高于其他菌株；菌株FLP37和FLP50的PSI及PSE居中，而且兩者之間無顯著性差異，但均顯著高于菌株FLP69和FLP72；而菌株FLP69的PSI和PSE最小，顯著低于其他菌株。同樣，根據(jù)各菌株的溶磷圈也可以直觀地判斷出其解磷能力的強(qiáng)弱(圖1)。

表1 不同菌株的溶磷指數(shù)和溶磷效率Table 1 P solubilization index and P solubilization efficiency of different strains

圖1 不同解磷菌株產(chǎn)生的溶磷圈Fig.1 Phosphate-solubilization halo produced by different strains

2.2 解磷菌株培養(yǎng)液pH的變化和磷酸酶活性

在培養(yǎng)液中接種解磷菌株并培養(yǎng)12 h后，培養(yǎng)液pH與初始pH相比均有不同程度的下降，以培養(yǎng)液中初始pH與培養(yǎng)后pH的差值來表示pH的變化幅度。從圖2-A中可以看出5株解磷菌株培養(yǎng)液中的pH變化幅度在0.8～1.9，其中菌株FLP36對應(yīng)的培養(yǎng)液pH變化幅度顯著高于其他菌株，菌株FLP37、FLP69和FLP72對應(yīng)的培養(yǎng)液pH變化幅度之間不存在顯著性差異，但均顯著低于菌株FLP36和FLP50。

不同小寫字母代表解磷菌株間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，下同

根據(jù)培養(yǎng)液的pH，測定其磷酸酶活性，更能真實(shí)地反映培養(yǎng)液的實(shí)際磷酸酶活性的變化情況。5株解磷菌株培養(yǎng)液中的磷酸酶活性在 5.18～6.39 μg/(mL·min)，菌株FLP36和FLP50對應(yīng)的培養(yǎng)液中的磷酸酶活性顯著高于其他菌株，但兩者之間無顯著性差異，菌株FLP37、FLP69和FLP72對應(yīng)的培養(yǎng)液中的磷酸酶活性之間也無顯著性差異(圖2-B)。

2.3 菌株解磷能力的定量分析

根據(jù)培養(yǎng)液中速效磷含量的多少可以判斷菌株的解磷能力。從圖3-A可以看出，5株解磷菌株從植酸鈣中活化出來的速效磷含量為 2.49～3.55 mg/L，其中菌株FLP36對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量最高，顯著高于菌株FLP37和FLP72；菌株FLP50和FLP69對應(yīng)的培養(yǎng)液中速效磷含量居中，且兩者之間無顯著性差異，但均顯著高于菌株FLP72。

如圖3-B所示，5株解磷菌株對植酸鈣的活化率為19.28%～43.54%，其中菌株FLP36對植酸鈣的活化率最高，顯著高于菌株FLP37和FLP72，而與菌株FLP50和FLP69之間并無顯著性差異；菌株FLP37對植酸鈣的活化率顯著高于菌株FLP72。

圖3 不同菌株從植酸鈣中活化出的速效磷含量以及對植酸鈣的活化率Fig.3 Content of available phosphorus from phytin mobilized by different strains and mobilization rate of phytin

2.4 培養(yǎng)液中磷酸酶活性與pH以及速效磷含量的關(guān)系

培養(yǎng)液中pH與磷酸酶活性之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4-A)，即pH下降的幅度越大，其對應(yīng)的磷酸酶活性也就越高；而磷酸酶活性與速效磷含量之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖4-B)，即磷酸酶活性越高，從植酸鈣中活化出的速效磷含量也越高。

圖4 培養(yǎng)液中磷酸酶活性與pH以及速效磷含量的關(guān)系Fig.4 Correlations between phosphatase activity and pH，available phosphorus content

2.5 解磷菌株的分子鑒定

結(jié)合平板稀釋法、16S rRNA基因測序以及同源序列比對，鑒定出菌株FLP36屬于Bacillus，菌株FLP37、FLP50和FLP69同屬于Arthrobacter，菌株FLP72為Pseudarthrobacter。將這些菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank中獲得的序列號分別為MW131227、MW131228、MW131229、MW131231和MW131232(表2)。

將篩選獲得的5株解磷菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中的序列比對同源性高的模式菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5株解磷菌株隸屬于3個(gè)屬(Arthrobacter、Bacillus和Pseudarthrobacter)。其中菌株FLP36與巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)聚為一支，表明二者之間有較近的親緣關(guān)系；菌株FLP37和FLP69分別與兩個(gè)Arthrobacter的菌株聚為一支，表明這兩個(gè)菌株與節(jié)桿菌屬的親緣關(guān)系更近，而屬于Arthrobacter的菌株FLP50則與屬于Pseudarthrobacter的菌株FLP72有較近的親緣關(guān)系。

表2 不同菌株在NCBI中的比對結(jié)果Table 2 Results of different strains in NCBI

圖5 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的解磷菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of phosphate-solubilizing strains based on 16S rRNA gene sequences

3 討 論

利用平板培養(yǎng)對解磷細(xì)菌進(jìn)行分離是一種簡單有效的方法，解磷細(xì)菌將培養(yǎng)基中的植酸鈣溶解產(chǎn)生溶磷圈，通過對溶磷圈的大小進(jìn)行測量，以此可以初步估測微生物的解磷能力。本研究中分離篩選出來的5株解磷細(xì)菌在植酸鈣培養(yǎng)基上均產(chǎn)生明顯的溶磷圈，說明篩選培養(yǎng)出來的細(xì)菌均具有降解有機(jī)磷的能力，而且通過對溶磷指數(shù)(PSI)和溶磷效率(PSE)的分析，可以初步判定菌株FLP36降解有機(jī)磷的能力最強(qiáng)。進(jìn)而對培養(yǎng)液中速效磷含量的分析也發(fā)現(xiàn)菌株FLP36從植酸鈣中活化出的速效磷含量最高，并且對植酸鈣的活化率也最高。這些結(jié)果都表明菌株FLP36降解有機(jī)磷的能力最強(qiáng)。

解磷細(xì)菌活化有機(jī)磷的機(jī)理一般認(rèn)為是酶解作用，即細(xì)菌感受到低磷脅迫，在其代謝過程中就會向胞外分泌酸性或堿性磷酸酶以及植酸酶等物質(zhì)，將含磷有機(jī)化合物礦化，釋放出有效磷[3]。磷酸酶參與的有機(jī)磷礦化主要依賴于磷酸酶自身的活性和有機(jī)磷的底物有效性[23]，而磷酸酶活性又與介質(zhì)pH密切相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)不同菌株對應(yīng)的培養(yǎng)液中pH的變化幅度存在顯著差異，且pH與磷酸酶活性之間也存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而且磷酸酶活性與速效磷含量之間呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，這表明培養(yǎng)液pH的降低有利于磷酸酶活性的增加和有機(jī)磷底物的有效性，進(jìn)而促進(jìn)有機(jī)磷的礦化，提高速效磷含量。

土壤中解磷微生物種類豐富，數(shù)量繁多，目前報(bào)道的具有解磷作用的細(xì)菌種類有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、沙雷氏菌屬、微球菌屬、黃桿菌屬、固氮菌屬、根瘤菌屬、沙門氏菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、色桿菌屬、硫桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬等[24]。許多研究也已證明芽孢桿菌屬的細(xì)菌溶解磷酸鈣的能力較強(qiáng)[25-29]，而對于降解有機(jī)磷的解磷菌株來說，目前相關(guān)研究還相對較少，但也有研究表明芽孢桿菌屬的細(xì)菌降解有機(jī)磷的能力也較強(qiáng)[30-32]。本研究通過分子鑒定發(fā)現(xiàn)菌株FLP36屬于芽孢桿菌屬，而且降解植酸鈣的能力最強(qiáng)，這也證明芽孢桿菌屬的細(xì)菌既能溶解難溶性無機(jī)磷，又能溶解有機(jī)磷，而且溶磷能力較強(qiáng)。

本研究從冬小麥田間篩選鑒定出5株不同的解磷菌株，通過溶磷圈法和液體培養(yǎng)法判斷其解磷能力，發(fā)現(xiàn)降解植酸鈣能力最強(qiáng)的是菌株FLP36，隸屬于芽孢桿菌屬，但由于本研究并未將這些解磷菌株作為菌劑進(jìn)行盆栽或田間試驗(yàn)，還不清楚它們實(shí)際的解磷和促生效果，因?yàn)樵诓煌呐囵B(yǎng)條件下，普遍存在解磷效果不穩(wěn)定的問題[33]。而解磷細(xì)菌作為植物促生菌的一種，已被證明其在促進(jìn)植物生長、提高產(chǎn)量和磷養(yǎng)分吸收以及防治病蟲害等[34-38]方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時(shí)解磷細(xì)菌也是微生物肥料的重要組分，因此，篩選高效的解磷菌株不僅豐富了菌種資源庫，為微生物肥料的研制提供了充足的菌株，而且也降低了作物對化學(xué)肥料的依賴，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展提供了新的思路和理論支撐。