郭 成，王寶寶，鄧 東，張小杰，王春明，周天旺，李敏權(quán)，郭致杰

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；3. 石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，石家莊 050041；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，北京 100081；5. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070)

玉米是中國種植面積最大的農(nóng)作物[1]。在2021年“秸稈畜牧業(yè)”以及“糧改飼”的形勢和政策下，糧飼兼用型玉米具較大的發(fā)展?jié)摿?，能?shí)現(xiàn)糧食和飼料有效補(bǔ)給，是國內(nèi)糧食安全生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。一般年份，莖腐病田間發(fā)病率在5%～10%，重發(fā)年份達(dá)到20%～30%，高感品種的發(fā)病率可高達(dá)40%～100%，發(fā)病率每增加1%，單穗籽粒損失率約提高0.485%，千粒質(zhì)量損失率約提高0.304%，若發(fā)病嚴(yán)重將引起30%以上的產(chǎn)量損失[3]。受玉米連年種植、秸稈還田以及氣候逐年變暖等因素影響，田間土壤中病原菌基數(shù)逐年上升，玉米莖腐病呈逐年加重趨勢[4]。據(jù)郭成等[5]連續(xù)多年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在甘肅及周邊地區(qū)玉米莖腐病自然發(fā)生率偏高，玉米莖腐病對產(chǎn)量的制約已成為西北地區(qū)以及其他玉米主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)上的重大問題。

玉米莖腐病的致病菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量較為復(fù)雜，目前已報(bào)道玉米莖腐病的病原菌多達(dá)30種，其中禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)和腫囊腐霉(Pythiuminflatum)為國內(nèi)玉米莖腐病的兩大主要致病菌[5]。禾谷鐮孢復(fù)合種種群組成復(fù)雜，已探明包含超過10個菌種，其對環(huán)境有廣泛的適應(yīng)性，不僅能夠侵染多種水果、蔬菜、花卉，還引起小麥和大豆、馬鈴薯、玉米等多種作物病害的發(fā)生[6-11]。病原菌群體遺傳多樣性越豐富表明病原菌對環(huán)境的適應(yīng)力越強(qiáng)，較高遺傳多樣性的致病菌具有較強(qiáng)的進(jìn)化和生存優(yōu)勢[12]。ISSR、VNTR、RAPD、AFLP和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于禾谷鐮孢復(fù)合種群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[13-18]。禾谷鐮孢復(fù)合種侵染作物后，在寄主體內(nèi)產(chǎn)生多種次生代謝物和毒素，這些毒素貯藏在植物體內(nèi)潛在危害巨大[19-20]。

研究病原菌群體結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性特征是應(yīng)對植物病害的發(fā)生、流行及其防治的關(guān)鍵[21]。解析致病菌遺傳分化特征及其致病力是抗病品種選育及病害防控的研究基礎(chǔ)[22-23]。有效控制玉米莖腐病對保障中國玉米產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前缺乏對甘肅省玉米莖腐病致病菌遺傳多樣性的系統(tǒng)報(bào)道，本研究以甘肅省玉米莖腐病優(yōu)勢病原菌禾谷鐮孢復(fù)合種為對象，研究其在4大生態(tài)區(qū)的分布特征及遺傳多樣性，該結(jié)果將為甘肅省玉米生產(chǎn)提供風(fēng)險(xiǎn)警示，為玉米鐮孢莖腐病防控提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 菌株信息

從甘肅省4大生態(tài)區(qū)采集莖腐病樣，采用組織分離法，即在樣品病健交界處用剪刀剪取約 (0.2×0.5) cm大小的玉米莖稈及維管束組織，參照文獻(xiàn)[24-25]進(jìn)行分離、培養(yǎng)和純化，獲得菌株。經(jīng)致病性測定后，采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合TEF-1α基因測序并將所得序列在NCBI中心的BLAST模塊進(jìn)行比對分析[18]，鑒定到具體種，從中選取114株禾谷鐮孢復(fù)合種(FGSC)菌種，平均分布在4個生態(tài)區(qū)。菌株分布地點(diǎn)見表1。

表1 禾谷鐮孢復(fù)合種采集信息Table 1 Distribution and number of F.graminearum species complex

1.2 供試引物

遺傳多樣性引物采用任旭等[17]和Qu等[26]使用的8對VNTR(序號g1～8)和10對SSR引物(序號g9～18)，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表 2)。

表2 禾谷鐮孢復(fù)合種遺傳多樣性引物Table 2 Genetic diversity primer of F.graminearum species complex

1.3 PCR 擴(kuò)增體系

參照賀小倫等[27]的方法以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度按照引物進(jìn)行相應(yīng)的 設(shè)定。

1.4 凝膠電泳

對PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，以恒定功率75 W，電泳90 min，將凝膠置于顯影液中進(jìn)行條帶自顯影，條帶顯影后用蒸餾水沖去殘液，將凝膠平鋪在燈箱上統(tǒng)計(jì)條帶，并拍照。

1.5 電泳譜帶的統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)好電泳DNA圖譜的條帶信息，有條帶，統(tǒng)計(jì)為“1”，無條帶，統(tǒng)計(jì)為“0”，進(jìn)而將多態(tài)性位點(diǎn)，也以0和1的方式，轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)據(jù)。利用軟件POPGENE來計(jì)算引物的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、群體間的Shannon’s多樣性指數(shù)(I)[28]。利用軟件NTSYSpc 2.11的非加權(quán)組平均法進(jìn)行不同地區(qū)的菌群的SAHN聚類，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 TEF-1α基因序列聚類結(jié)果

禾谷鐮孢復(fù)合種經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合TEF-1α基因測序，在114株中鑒定出16株禾谷鐮孢和98株布氏鐮孢(F.boothii)，選取部分菌株構(gòu)建聚類樹(圖1)。

圖中節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字表示每100次聚類分析中能聚到同一個分支的次數(shù)

統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在4大地區(qū)中均以布氏鐮孢為主。隴南地區(qū)僅有布氏鐮孢分布，23株，未分離得到禾谷鐮孢；河西走廊布氏鐮孢有27株，禾谷鐮孢有3株；隴東地區(qū)布氏鐮孢有20株，禾谷鐮孢有11株；隴中地區(qū)布氏鐮孢有28株，禾谷鐮孢有2株(表3)。

表3 4個生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種分布Table 3 Distribution of F.graminearum complex species in four regions

(續(xù)表3 Continued table 3)

2.2 18對引物的擴(kuò)增結(jié)果

對VNTR和SSR引物擴(kuò)增結(jié)果表明，114株禾谷鐮孢復(fù)合種菌株多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為26。擴(kuò)增片段集中在50～300 bp，其中引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)均在1條以上，表明其多態(tài)性可觀。

2.3 禾谷鐮孢復(fù)合種不同地理種群遺傳變異和遺傳分化

POPGENE分析結(jié)果顯示，4個生態(tài)區(qū)的禾谷鐮孢復(fù)合種群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)為 0.924 9，而其種群間的遺傳分化系數(shù)是0.075 1，群體內(nèi)基因流為0.02，種群間的基因流為 6.153 5，說明禾谷鐮孢復(fù)合種遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。禾谷鐮孢復(fù)合種群體總基因多樣度為0.425 9，各地理群體內(nèi)基因多樣度為0.393 9，不同地區(qū)間基因多樣度為0.032，綜上，來自同一個生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種菌株間攜帶的基因最為接近，遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。

Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)均以隴中為最高，分別為0.608 7和0.422 9，表明該地區(qū)菌株的基因豐富度最高；隴東地區(qū)的次之，分別為0.601 7和0.416 8；而隴南地區(qū)的則分別為0.564 1和0.392 6；河西走廊的最低，分別為0.501 7和0.343 2，說明基因多樣性與地理區(qū)域有較大的相關(guān)性。4大生態(tài)區(qū)Shannon’s信息指數(shù)均在0.50以上，Nei’s基因多樣性指數(shù)均在0.34以上，表明甘肅省禾谷鐮孢復(fù)合種菌群的遺傳多樣性十分豐富。如表4所示，4個生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種的有效等位基因數(shù)(Ne)在 1.612 6～1.775 7，平均有效等位基因數(shù)為 1.714 0；多態(tài)位點(diǎn)百分率在88.46%～100%，平均為95.19%；多態(tài)位點(diǎn)數(shù)在23～26，平均為 24.75。研究結(jié)果表明，甘肅隴東地區(qū)和隴中地區(qū)菌株遺傳多樣性最為豐富。

2.4 禾谷鐮孢復(fù)合種種群的遺傳相似度和遺傳距離

如表4所示，隴中地區(qū)和隴東地區(qū)的遺傳距離最小，為0.033 1，兩者的遺傳相似度最大，為0.967 4，說明兩地禾谷鐮孢復(fù)合種菌株基因組成最接近；而隴東和隴南地區(qū)的遺傳相似度最小，為0.888 0，其遺傳距離最大，為0.118 8，說明兩地菌株間差異性最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。4個地區(qū)間遺傳相似度為0.888 0～0.967 4，Nei’s遺傳距離為0.033 1～0.118 8(表5)，4個生態(tài)地區(qū)的菌株均具有豐富的遺傳多樣性。

表4 4個不同生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種種群的遺傳變異參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of F.graminearum species complex among four different geographical populations

表5 甘肅不同生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種種群的遺傳相似度和遺傳距離Table 5 Genetic similarity coefficient and genetic distance among different geographical groups of F.graminearum species complex among four different geographical populations in Gansu

2.5 聚類分析

依據(jù)遺傳相似度，用NTSYSpc version 2.11軟件對4個地區(qū)種群進(jìn)行聚類分析(圖2)，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.938 0時，4個生態(tài)群體被聚為3個分支。隴南地區(qū)與河西走廊的菌株各自聚為一大類群，分別為第Ⅰ類群和第Ⅱ類群；而隴東地區(qū)和隴中地區(qū)的菌株共同聚為一大類，為第Ⅲ類群。結(jié)果表明，隴東地區(qū)和隴中地區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種菌群親緣關(guān)系最為接近，4個生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種群體按其親緣關(guān)系可分為3大類，其遺傳親緣關(guān)系與地理來源有一定的相關(guān)性。

圖2 禾谷鐮孢復(fù)合種4個地理種群的UPGMA聚類圖Fig.2 The UPGMA cluster map of 4 geographical populations of F.graminearum species complex

2.6 禾谷鐮孢復(fù)合種種群變異分析

禾谷鐮孢復(fù)合種不同地理種群的基因變異方差分析表明，在3大類群間的遺傳變異為5.5%，4個種群間的變異占總變異的3.79%，種群內(nèi)的變異占總變異的90.71%，同時P<0.001 0(表6)，表明禾谷鐮孢復(fù)合種種群的遺傳變異主要發(fā)生于種群內(nèi)部。

表6 禾谷鐮孢復(fù)合種地理種群的種群變異分析Table 6 Analysis of molecular variance of F.graminearum species complex for geographical populations

3 結(jié)論與討論

為明確甘肅4大生態(tài)區(qū)玉米鐮孢莖腐病優(yōu)勢病原菌禾谷鐮孢復(fù)合種遺傳多樣性，應(yīng)用8個VNTR標(biāo)記和10個SSR標(biāo)記對自甘肅省4大生態(tài)區(qū)選取的 114 株禾谷鐮孢復(fù)合種菌株進(jìn)行分析，按遺傳相似度劃分為3大類群，表明禾谷鐮孢復(fù)合種的親緣關(guān)系與菌株的地理來源有一定相關(guān)性。Qu等[26]研究表明，來自中國不同地區(qū)的禾谷鐮孢菌群體存在高度的遺傳多樣性，整個群體可分為兩個類群，兩個類群有不同的地理分布特征，每個類群又可進(jìn)一步劃分為幾個亞類。與賀小倫等[27]對來自河南和河北冬小麥區(qū)收集的假禾谷鐮孢菌株(F.pseudograminearum)進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)相似系數(shù)為0.966時，來自6個地理群體的166株菌被劃分成 2 個大的類群；馬紅霞等[28]以相似系數(shù) 0.56為標(biāo)準(zhǔn)，將來自 11 個省(自治區(qū))禾谷鐮孢復(fù)合種的92 個菌株劃分成 9 個類群；任旭等[17]將46 株禾谷鐮孢復(fù)合種菌株以遺傳相似系數(shù)0.45為標(biāo)準(zhǔn)劃分為3個類群；何婧[29]在相似系數(shù)為0.682時，將115株禾谷鐮孢劃分為2個類群等研究結(jié)果相吻合，進(jìn)一步說明禾谷鐮孢復(fù)合種群體具有豐富遺傳多樣性且存在較明顯的生態(tài)地理類型。

本研究發(fā)現(xiàn)，甘肅4個不同生態(tài)區(qū)禾谷鐮孢復(fù)合種種群遺傳變異主要來自種群內(nèi)部。許多學(xué)者采用多種分子技術(shù)對禾谷鐮孢的遺傳多樣性進(jìn)行分析，得出的結(jié)果與本研究一致，如陳捷等[30]應(yīng)用RAPD技術(shù)明確禾谷鐮孢菌群間的遺傳變異性，易受地域、環(huán)境和寄生部位選擇作用的影響，出現(xiàn)明顯的遺傳分化特征； 紀(jì)莉景[31]利用TEF-1α基因測序結(jié)合RAPD技術(shù)發(fā)現(xiàn)中國部分地區(qū)玉米穗腐病和小麥赤霉病致病菌包括禾谷鐮孢、亞洲鐮孢(F.asiaticum)和布氏鐮孢3個類群，且不同地理來源的類群內(nèi)的菌株均存在豐富的遺傳多樣性；何婧[29]使用ISSR標(biāo)記對玉米莖腐病致病菌禾谷鐮孢分析發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢即使在同一聚類分支或是同一地區(qū)的菌株在遺傳多樣性上也存在差異，表明禾谷鐮孢菌株間有明顯的生理分化； Talas等[32]利用高通量測序技術(shù)對德國13塊試驗(yàn)田的213個禾谷鐮孢菌株進(jìn)行群體基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)田塊內(nèi)群體具有較高的遺傳多樣性。

本研究首次闡釋甘肅省玉米莖腐病優(yōu)勢致病菌禾谷鐮孢復(fù)合種具有較為豐富的遺傳多樣性，根據(jù)遺傳相似度將4個生態(tài)區(qū)的菌群劃分為3大類群，且其種群遺傳變異主要來自種群內(nèi)部，但其致病力、產(chǎn)毒類型和種群地理分布特征三者之間是否存在相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。