李文超，吳燕川，沈 芊，蘇 甦，李曉玲，白向榮（.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部/國家老年病醫(yī)學(xué)研究中心，北京0005；2.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 0005；.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室，北京 0005）

替加環(huán)素（tigecycline，TGC）是甘氨酰四環(huán)素類抗生素，具有強大的體外抗菌活性，在臨床中多用于治療多重耐藥菌引起的感染[1]。作為一種脂溶性抗生素，替加環(huán)素給藥后快速分布于體內(nèi)，血藥濃度個體差異性較大[2]。此外，替加環(huán)素體內(nèi)抗菌活性與感染部位、病原體種類以及患者的病理生理狀態(tài)等密切相關(guān)。而多重耐藥菌感染的患者病理生理情況通常十分復(fù)雜，病情較為嚴(yán)重，因此進(jìn)行替加環(huán)素的治療藥物監(jiān)測十分必要。故本研究建立了一種高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定替加環(huán)素的血藥濃度，并將其應(yīng)用于經(jīng)該藥治療的多重耐藥革蘭陰性菌感染的重癥患者血清樣本分析，以期為后續(xù)進(jìn)行替加環(huán)素藥動學(xué)/藥效學(xué)研究及開展治療藥物監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相-可變波長檢測系統(tǒng)（HPLC-VWD，安捷倫科技有限公司），包括：G1322A脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長檢測器；反相Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Thermo HERAEUS FRESCO21臺式微量高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；WH-86I旋渦混合器（江蘇太倉鹿河生化儀器廠）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）；AUY220分析天平（日本島津公司）。

1.2 試藥

替加環(huán)素對照品（北京百奧萊博科技有限公司，批號：TG021447，純度：98.0%）；鹽酸米諾環(huán)素對照品（上海Sigma Aldrich公司，批號：0000095799）；1-辛烷磺酸鈉對照品（Sigma Aldrich公司，批號：MKCF5895，純度：98.0%）；高氯酸（上海金鹿化工有限公司，批號：130455，純度：72%）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，水為滅菌注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.023 mmol?L-1磷酸鹽緩沖液（24∶76，v/v，pH=3.0）；流速1.0 mL?min-1；柱溫25 ℃；檢測波長246 nm；進(jìn)樣量50 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控溶液 取替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.00 mg?mL-1的替加環(huán)素儲備液，置于–40 ℃冰箱保存。臨用前將該儲備液用pH=3.0，0.1 mmol?L-1的磷酸鹽緩沖液逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為25.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.500 μg?mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液以及15.000、5.000、0.125 μg?mL-1的混合質(zhì)控溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取鹽酸米諾環(huán)素對照品5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.00 mg?mL-1內(nèi)標(biāo)儲備液，置于–40 ℃冰箱保存。臨用前將該儲備液用pH=3.0，0.1 mmol?L-1的磷酸鹽緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg?mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血清樣品的處理

取空白血清160 μL，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液40 μL，內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混勻30 s，加入0.4 mol?L-1高氯酸200 μL，渦旋混勻1 min，以12 000 r·min-1離心15 min，取上清液50 μL，進(jìn)樣分析；取一例使用替加環(huán)素治療患者的待測血清200 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混勻30 s，加入0.4 mol?L-1高氯酸200 μL，渦旋混勻1 min，以12 000 r·min-1離心15 min，取上清液50 μL進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性考察

取替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。取6份不同來源空白血清160 μL，加入到1.5 mL離心管中，不加入內(nèi)標(biāo)溶液，按照“2.3”項下方法處理樣品，進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示空白血清中干擾組分的響應(yīng)低于替加環(huán)素定量下限的20%，且低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾替加環(huán)素及內(nèi)標(biāo)的測定；另取6份不同來源空白血清160 μL，加入1.5 mL離心管中，加入“2.3”項下40 μL最低定量下限溶液（0.5 μg?mL-1），處理樣品，進(jìn)樣分析。樣品分析時間為15 min，人血清中替加環(huán)素和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為6.85 min和9.20 min。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A–替加環(huán)素+鹽酸米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，B–人空白血清，C–人空白血清+替加環(huán)素+鹽酸米諾環(huán)素；1–替加環(huán)素，2–鹽酸米諾環(huán)素Fig 1 HPLC chromatogramA–tigecycline and minocycline hydrochloride standardized solution,B–human blank serum,C–human blank serum + tigecycline+minocycline hydrochloride; 1–tigecycline,2–minocycline hydrochloride

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

取空白血清、相應(yīng)質(zhì)量濃度的替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別配制成質(zhì)量濃度為5.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.100 μg?mL-1的含藥血清樣品，按照“2.3”項下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值（X）為橫坐標(biāo)，以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法擬合曲線，得到替加環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.463 6 X–0.061 2，r=0.998 6，替加環(huán)素在0.100～5.000 μg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.100 μg?mL-1（S/N≥10）。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度

分別配制替加環(huán)素定量下限質(zhì)量濃度（0.100 μg?mL-1）的血漿樣品和低、中、高質(zhì)量濃度（0.250、1.000、3.000 μg?mL-1）的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，連續(xù)測定3 d，每個濃度各取5份樣本分析 ,根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)控樣品的實測質(zhì)量濃度，考察方法的準(zhǔn)確度RE和精密度RSD，結(jié)果顯示日內(nèi)精密度RSD分別為2.48%、2.13%、2.33%；日內(nèi)準(zhǔn)確度RE分別為8.08%、6.41%、3.46%。日間精密度RSD分別為9.18%、3.59%、4.30%；日間準(zhǔn)確度RE分別為2.17%、3.94%、0.80%。見表1。

表1 人血清中替加環(huán)素日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Tab 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy test results of tigecycline in human serum

2.7 稀釋效應(yīng)

替加環(huán)素血藥濃度的個體差異較大，有時需對高質(zhì)量濃度樣品進(jìn)行稀釋以考察方法的稀釋效應(yīng)。本試驗考察了高質(zhì)量濃度樣品稀釋5倍的稀釋效應(yīng)。將質(zhì)量濃度為20.000 μg?mL-1的含藥血清用空白基質(zhì)稀釋至4.000 μg?mL-1后，平行測定5個樣本。結(jié)果顯示，其RE和RSD分別為–2.09%和5.41%，準(zhǔn)確度和精密度均在±15%范圍內(nèi)。

2.8 提取回收率

取質(zhì)量濃度為15.000、5.000、0.125 μg?mL-1的質(zhì)控溶液各40 μL，分別置于離心管中，加入空白血清160 μL，制成質(zhì)量濃度分別為3.000、1.000、0.250 μg?mL-1的質(zhì)控樣品，每個濃度平行做3份，按照“2.3”項下方法處理后，再按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積A1。取空白血清200 μL，加入0.4 mol?L-1高氯酸200 μL，渦旋混勻1 min，以12 000 r·min-1離心20 min，采用沉淀后的基質(zhì)配制高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，再按照色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積A2。以A1/A2計算相對回收率。結(jié)果顯示替加環(huán)素的提取回收率在99.43%～116.68%，內(nèi)標(biāo)回收率為116.66%，提取回收率RSD<15%，方法一致性較好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

將“2.2”項下的低、高濃度質(zhì)控溶液加入到160 μL混合空白血清中，分別制備成低、高濃度質(zhì)控樣品（0.250、3.000 μg?mL-1）若干份，分別考察不同條件下替加環(huán)素的穩(wěn)定性，每種試驗條件下低、高濃度質(zhì)控樣本各3個，按照“2.3”項下方法處理血清樣品，血清樣品3次凍融考察反復(fù)凍融穩(wěn)定性。血清樣品于–40 ℃放置30 d考察低溫保存穩(wěn)定性。血清樣品在室溫下放置4、6 h后進(jìn)行分析，考察室溫放置穩(wěn)定性。處理后樣本在4 ℃放置24 h，考察在自動進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，替加環(huán)素血清樣本經(jīng)過反復(fù)凍融3次、–40 ℃保存40 d、室溫放置4 h，處理后樣品在自動進(jìn)樣器4 ℃放置24 h，測定值的RSD和RE均在15%范圍內(nèi)，表明替加環(huán)素樣品在上述條件下穩(wěn)定。詳見表2。

表2 替加環(huán)素樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 2 Stability test results of tigecycline samples

2.10 干擾性試驗

查閱本院患者聯(lián)合用藥，篩選13種最常與替加環(huán)素聯(lián)用的藥物，將頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、萬古霉素、伏立康唑、氟康唑、美羅培南、阿米卡星、亞胺培南西司他丁鈉、利奈唑胺、甲潑尼龍琥珀酸鈉、地塞米松磷酸鈉、維生素C、維生素K1、間羥胺的標(biāo)準(zhǔn)品分別在該色譜條件下進(jìn)樣，在替加環(huán)素及內(nèi)標(biāo)保留時間處未出現(xiàn)重疊吸收峰。

2.11 方法學(xué)應(yīng)用

采用本方法測定11例多重耐藥革蘭陰性菌感染的重癥患者血清中替加環(huán)素的質(zhì)量濃度。本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過（批準(zhǔn)號：PX20200805），患者簽署知情同意書。11例患者給藥途徑均為靜脈滴注，維持劑量為100 mg或50 mg，給藥間隔為q 12 h，于藥物濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)后（療程≥5 d）9、12 h靜脈采血，按“2.3”項下方法處理血清樣品，進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示患者用藥后血藥濃度范圍為0.117～0.831 μg?mL-1，所建立方法能夠滿足臨床患者血清中替加環(huán)素濃度檢測要求。詳見表3。

表3 11例患者使用替加環(huán)素達(dá)穩(wěn)態(tài)后血藥濃度監(jiān)測值Tab 3 Plasma concentration at steady state in 11 patients using tigecycline

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本研究考察了甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-磷酸鹽緩沖液兩種體系，在乙腈-磷酸鹽體系中待測物出峰響應(yīng)值較高，故采用后者。研究過程中還對比了磷酸鹽緩沖液在pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0條件下待測物的保留行為，結(jié)果顯示在pH=3.0條件下，替加環(huán)素與米諾環(huán)素出峰時間受生物基質(zhì)影響小、響應(yīng)值較高。在色譜柱選擇上，本研究探究了待測物在ZORBAX Extend C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和反相Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱上的保留行為，結(jié)果顯示在ZORBAX Extend C18柱上待測物出峰響應(yīng)值較低且后拖尾嚴(yán)重，試用Kromasil C18柱， 替加環(huán)素與米諾環(huán)素分離效果較好。

3.2 內(nèi)標(biāo)品種與蛋白沉淀試劑

現(xiàn)有研究采用米諾環(huán)素[3]、雷尼替丁[4]、四環(huán)素[5]等作為內(nèi)標(biāo)，本研究首先采用雷尼替丁作為內(nèi)標(biāo)化合物，在乙腈-磷酸鹽緩沖液流動相條件下未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，遂選擇米諾環(huán)素，其出峰與替加環(huán)素色譜峰分離度較好且響應(yīng)值較高。本研究樣品處理方法較為簡單，采用蛋白沉淀法，對比研究高氯酸、乙腈和甲醇作為蛋白沉淀劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者均可較好沉淀蛋白，由于替加環(huán)素在體內(nèi)分布廣泛、血藥濃度較低，最終選擇1∶1比例的0.4 mol?L-1高氯酸進(jìn)行蛋白沉淀處理。

3.3 與現(xiàn)有分析方法的比較

目前多采用LC-MS/MS法檢測替加環(huán)素血藥濃度[6-9]，在滿足測定濃度范圍的情況下，相較于LCMS/MS法，HPLC法[4]儀器成本與檢測費用更低，更利于該藥血藥濃度監(jiān)測的推廣與一些基礎(chǔ)藥動學(xué)研究。本測定方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣、磷酸鹽與乙腈流動相等度洗脫，單次測定時間為15 min，總體而言，測定方法較為簡單、便捷，利于大規(guī)模開展替加環(huán)素的血藥濃度監(jiān)測。

3.4 替加環(huán)素治療藥物監(jiān)測與PK/PD研究開展的必要性

替加環(huán)素是有較長抗生素后效應(yīng)的時間依賴性抗菌藥物，對于醫(yī)院獲得性肺炎，其藥動學(xué)/藥效學(xué)參數(shù)閾值為AUC0-24h/MIC>4.5[10]。目前幾項臨床研究[10-12]表明，標(biāo)準(zhǔn)劑量（50 mg，q 12 h，ivgtt）的替加環(huán)素給藥方案相較于維持劑量加倍（100 mg）的給藥方案，更易引起醫(yī)院獲得性肺炎的治療效果不佳，因此開展治療藥物監(jiān)測與PK/PD研究實屬必要。通過PK/PD研究找出該藥PK/PD參數(shù)閾值與臨床療效、細(xì)菌清除的關(guān)系并實際應(yīng)用于臨床，對提高替加環(huán)素治療的有效性與安全性具有積極作用。