孫勝利，吳衛(wèi)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100730)

凝固曲線波形分析(clot waveform analysis，CWA)是由用光學(xué)法原理檢測凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)等凝血指標(biāo)的凝血分析儀在凝固反應(yīng)過程中依據(jù)透射光/散射光變化所繪制的凝固曲線波形圖，進(jìn)行求階導(dǎo)數(shù)得出凝血反應(yīng)過程中最大反應(yīng)速度、最大凝血加速度、最大凝血減速度，為凝血反應(yīng)過程提供了更多信息。典型的APTT凝固曲線及求階導(dǎo)數(shù)為例，如圖1，APTT凝固曲線為圖形A，x軸表示時間(s)，y軸表示透射光強(qiáng)度(%),最大透射光強(qiáng)度為100%，最小透射光強(qiáng)度為0%。在0～100%之間，選擇預(yù)先設(shè)定的終點(diǎn)(一般設(shè)定50%)，并確定此終點(diǎn)下的凝血時間(CT，s)；圖B為透射光強(qiáng)度的一階導(dǎo)數(shù)，反映了每個時間點(diǎn)的凝血速度，|Min1|(dT/dt)為最大反應(yīng)速度；圖C為透射光強(qiáng)度的二階導(dǎo)數(shù)，反映了每個指定時間點(diǎn)的反應(yīng)加速度，|Min2|(d2T/dt2)為最大凝血加速度，|Max2|(d2T/dt2)為最大凝血減速度；CWA參數(shù)可以獲得整個凝血過程的更多信息[1-2]。1997年，Braun等[3]分析了血友病患者CWA參數(shù)的變化，首次提出利用光學(xué)透射率數(shù)據(jù)可以對APTT和PT檢測結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)展性解釋。2013年國際血栓與止血協(xié)會(International Society of Thrombosis and Haemostasis,ISTH)推薦CWA應(yīng)用于臨床[4]，越來越多的研究者開始關(guān)注CWA的臨床應(yīng)用。本文就CWA在血栓、血友病、纖維蛋白原缺乏等疾病中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

注：A，APTT凝固曲線；B，透射光強(qiáng)度一階求導(dǎo)；C，透射光強(qiáng)度二階求導(dǎo)。

1 血栓

靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)包括深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)與肺栓塞(pulmonaryembolism，PE)，是住院患者潛在的一種并發(fā)癥，是導(dǎo)致住院患者死亡的重要原因之一[5]。VTE發(fā)病率和死亡率高，但又有可預(yù)防，因此早期評估和診療顯得至關(guān)重要[6]。

Padua評分是一種個人風(fēng)險(xiǎn)評估模型，按總得分情況分為低危(<4分)、高危(≥4分)[7]?！睹绹乜漆t(yī)師學(xué)院內(nèi)科患者VTE預(yù)防指南》(第9版)建議：Padua評分≥4分患者，VTE患病風(fēng)險(xiǎn)高，應(yīng)采取VTE預(yù)防措施[8]。Ruberto等[9]將801名治療患者分為3組，得出高PPS(Padua評分)患者APTT|Min1|、|Min2|、|Max2|值以及纖維蛋白原、D-二聚體高于低PPS患者和健康者。高PPS、低PPS患者和健康者的APTT的|Min2|、|Max2|值和纖維蛋白原、D-二聚體與高PPS評分≥4分顯著相關(guān)。研究表明，無論是否有抗血栓預(yù)防措施，可通過APTT檢測的一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)和D-二聚體而預(yù)測高凝狀態(tài)，APTT的CWA參數(shù)、纖維蛋白原和D-二聚體可用于區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)PPS和低風(fēng)險(xiǎn)PPS患者，達(dá)到VTE的早期預(yù)防和治療。

新型直接口服抗凝藥物(direct oral anticoagulant agents，DOACS)因其不需要進(jìn)行常規(guī)抗凝監(jiān)測、服用劑量相對固定、劑量反應(yīng)可預(yù)測、不受飲食影響，以及藥物相互作用較少[10]，被用于房顫的血栓預(yù)防[11]。2016年美國胸科協(xié)會建議使用直接口服抗凝藥治療因非癌癥引起的深靜脈血栓[12]。Wakui等[13-14]研究表明直接凝血酶抑制劑和活化因子Ⅹ抑制劑的劑量與APTT檢測時間呈劑量依賴性延長，APTT的CWA參數(shù)Min1(|Min1|)、Maxp2(|Min2|)、Maxn2(|Max2|)呈劑量依賴性下降。

2 血友病

血友病是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病，可分為血友病A和血友病B。前者表現(xiàn)為凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺乏，后者表現(xiàn)為凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺乏，均由相應(yīng)的凝血因子基因突變引起。根據(jù)FⅧ或FⅨ的活性水平將血友病分為重型(因子活性<1 %)、中間型(因子活性為1%～5%)、輕型(因子活性為>5 %,≤40 %)[15]。

1997年，Braun等[3]分析了血友病中CWA參數(shù)的變化，首次提出利用光學(xué)透射率數(shù)據(jù)可以對APTT和PT檢測結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)展性解釋。Shima等[16]研究表明，APTT的完整CWA參數(shù)比凝血時間和/或單階段因子分析在確定血友病的臨床嚴(yán)重程度方面提供了更有效的鑒別力，與Matsumoto等[17]研究一致。且Matsumoto等[17]研究還表明APTT |Min2|在檢測FⅧ低值(<1.0 IU/dL)方面比FⅧ:C凝血試驗(yàn)更準(zhǔn)確。同時Matsumoto等[18]研究表明FⅧ濃度在0～100 IU/dL之間APTT檢測的CWA參數(shù)CT、|Min1|和|Min2|與FⅧ濃度呈良好的劑量關(guān)系，F(xiàn)Ⅷ:C最低水平為0.25 IU/dL。56例嚴(yán)重血友病A患者研究發(fā)現(xiàn)所有患者的CT檢測值均延長，但是組間差異不明顯。血友病A伴抑制物陽性組APTT的 CWA參數(shù)|Min1|和|Min2|明顯低于正常對照組和其他血友病實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，新的研究參數(shù)Slope[min1]為凝血前期纖維蛋白原形成過程中最大反應(yīng)速度，在鑒別血友病A伴抑制物陽性、極嚴(yán)重Ⅷ缺乏(<0.25 IU/dL)及嚴(yán)重Ⅷ缺乏(0.25～0.50 IU/dL)均有鑒別意義。

血友病領(lǐng)域首個雙特異性抗體Emicizumab，是一種模擬激活FⅧ輔因子功能的抗Ⅸ/FⅩ雙特異性抗體。2017年11月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)emicizumab (商品名：Hemlibra?)用于血友病A FⅧ抑制物陽性的成人和兒童患者常規(guī)預(yù)防，以預(yù)防或減少出血的頻率。2018年10月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)emicizumab用于不具有抑制物的血友病A患者常規(guī)預(yù)防，通過每周 (或更低頻率)皮下注射給藥，emicizumab預(yù)防血友病A患者的出血率顯著降低[19-21]。Emicizumab治療血友病A時不需要凝血酶激活，因此治療過程中APTT監(jiān)測作用微乎其微。

血友病A、B患者在輸入凝血因子進(jìn)行治療過程中，有研究推薦治療的凝血因子Ⅷ與Ⅸ活性水平相等[22-23]，也有研究表明Ⅸ因子水平應(yīng)低于Ⅷ因子[24-25]。Yoo等[26]研究表明在注射CFCs后檢測發(fā)現(xiàn)|Min2|在血友病A患者、血友病B患者明顯低于正常人，但是血友病A患者與血友病B患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0)。

3 纖維蛋白原缺乏

纖維蛋白原缺乏是一種罕見的孤立的遺傳性缺乏或一種獲得性彌漫性血管綜合征的一部分，是血漿中缺乏纖維蛋白原引起出血表現(xiàn)的一種疾病[27]。纖維蛋白原缺乏主要分為遺傳性纖維蛋白原缺陷和繼發(fā)性纖維蛋白原減低。遺傳性纖維蛋白原缺陷癥的分類依據(jù)如下：(1)遺傳性纖維蛋白原缺乏癥(Ⅰ型):按照血漿纖維蛋白原減少的程度不同，可分為無纖維蛋白原血癥和低纖蛋白原血癥(纖維蛋白原減少癥)，纖維蛋白原≤0.9 g/L可診斷為低纖維蛋白原血癥；≤0.5 g/L可診斷為無纖維蛋白原血癥[28]。(2)異常纖維蛋白原血癥(Ⅱ型):它是由于纖維蛋白原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生基因缺陷所致的一組高度異質(zhì)性的遺傳性疾病, 主要是纖維蛋白原結(jié)構(gòu)基因的突變導(dǎo)致纖維蛋白原分子結(jié)構(gòu)及功能缺陷所致，大多為常染色體顯性或共顯性遺傳。約55%的患者無臨床癥狀，25%的患者僅有出血傾向，20%的患者有血栓表現(xiàn)伴出血傾向，可有傷口愈合不良和流產(chǎn)等表現(xiàn)[29]。

實(shí)驗(yàn)室常規(guī)光學(xué)法全自動血凝分析儀檢測纖維蛋白原的原理為Clauss活性法，報(bào)告為纖維蛋白原的活性(Clauss法)結(jié)果，無法提供纖維蛋白原抗原含量的測定結(jié)果，而鑒別纖維蛋白原異常為質(zhì)的異常還是量的異常，對臨床診斷及治療監(jiān)測更具指導(dǎo)意義。Suzuki等[30]的研究表明，使用Clauss法檢測纖維蛋白原值與纖維蛋白原|Min1|的比值A(chǔ)c/|Min1|可以較好判斷是單純異常纖維蛋白原血癥或低纖維蛋白原血癥，還是二者合并的低異纖維蛋白原血癥。單純的異常纖維蛋白原血癥Ac/|Min1|明顯低下，而低纖維蛋白原血癥和低異纖維蛋白原血癥顯著升高，單純低纖維蛋白原血癥升高更明顯。Suzuki[30]建立了血漿纖維蛋白原抗原含量和|Min1|值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從每個纖維蛋白原|Min1|值計(jì)算估計(jì)的纖維蛋白原Ag(eAg)，作為測定纖維蛋白原抗原含量的合適替代物，可以區(qū)分異常纖維蛋白原的Ⅰ型(定量缺陷)和Ⅱ型(定性缺陷)，Ac/eAg在異常纖維蛋白原血癥和低異纖維蛋白原血癥中明顯低于正常人。

4 其他

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome,APS)是一種非炎癥性自身免疫病，血清中存在抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，APL)[31]。APL包括狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant， LA)、抗心磷脂抗體(anticardiolipid antibody，aCL)、抗β2糖蛋白Ⅰ抗體(抗β2-GPⅠ抗體)及抗凝血酶原抗體等。Matsumoto[32]研究表明在LA-APS(+)、LA-APS(-)、獲得性血友病A患者中APTT檢測時間顯著延長，但是組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，|Min1|在所有組均減低，LA組略高于輕型/中間型血友病A(FⅧ活性>1 IU/dL)患者和獲得性血友病A患者，在獲得性血友病A、輕型/中間型血友病A、LA-APS(-)和LA-APS(+)患者中|Min1|均減低，輕型/中間型血友病A與獲得性血友病A患者中|Min1|明顯減低，各組間|Min1|值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)不是一種獨(dú)立的疾病，而是許多疾病在進(jìn)展過程中產(chǎn)生凝血功能障礙的最終共同途徑，是一種臨床病理綜合征。1997年Downey等[33]觀察到與APTT正常凝固反應(yīng)S曲線相比，診斷為DIC的患者在APTT檢測時可出現(xiàn)異常且特征鮮明的透射率波形外觀，凝血反應(yīng)開始前的初始平臺被一個斜坡所取代，形成非典型的雙相。1998年Downey等[34]通過1 470個標(biāo)本連續(xù)兩周的檢測APTT，觀察APTT凝固反應(yīng)曲線，得出非典型雙相對DIC的陽性預(yù)測值為74%。Toh等[35]證明了雙相波形背后的機(jī)制是體內(nèi)C反應(yīng)蛋白與極低密度脂蛋白之間的復(fù)合物，先天因子缺陷、獲得性凝血抗體和抗凝治療的患者不表現(xiàn)出非典型雙相(BPW)，這為DIC的分子發(fā)病機(jī)制提供了潛在的重要見解。

5 小結(jié)與展望

PT、APTT、Fbg、TT是出血性及血栓性疾病篩查的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。目前采用全自動血凝分析儀以光學(xué)法檢測PT、APTT、Fbg、TT，僅表示固定某一點(diǎn)的結(jié)果，而不能反映凝血過程更多的信息。CWA可提供光學(xué)檢測系統(tǒng)識別血栓形成過程的分析曲線，通過透光率或吸光率變化，提供凝固過程的信息。PT、APTT、Fbg、TT結(jié)果結(jié)合自身相應(yīng)CWA參數(shù)數(shù)據(jù)，可提供多個定量參數(shù)，從而提升了PT、APTT、Fbg、TT的臨床報(bào)告的指標(biāo)價(jià)值。