羅 穎，張先東，李 慧，李樵鋒，劉偉琪，付靜靜，黃璐琦，鄧 樺，楊 鴻

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528231；2.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種急性、烈性、出血性、高度接觸性動物傳染病，能影響所有品種和年齡的家豬或野豬，強毒株感染的致死率可達100%[1]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，在中國被列為一類疫病。非洲豬瘟的典型臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱、嘔吐、腹瀉、便血、皮膚發(fā)紅、厭食和共濟失調(diào)等[2-3]。針對此病，目前還沒有商業(yè)化的治療方法或有效的疫苗，自2018年中國報道首例非洲豬瘟之后，非洲豬瘟疫情迅速蔓延，給中國養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[4]。

Karalyan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，豬被ASFV基因Ⅱ型感染后會出現(xiàn)抽搐、運動障礙、共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀，剖檢可見腦膜炎、硬膜下血腫及腦組織水腫。核因子κB(NF-κB)是一種具有廣泛生物學(xué)功能且在信號傳導(dǎo)通路中起樞紐作用的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛分布于淋巴細胞、神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細胞中，被激活后能與多種細胞因子基因的結(jié)合位點特異性結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄和表達[6]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)和干擾素-γ(interferon-gama，IFN-γ)具有NF-κB的結(jié)合位點，其中，TNF-α與IL-1β的高水平表達可誘導(dǎo)NF-κB的活化，活化的NF-κB對三者的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控，使其產(chǎn)生和釋放增多，擴大炎癥反應(yīng)[7-8]。此外，NF-κB通路可激活基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)，降解細胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致血管通透性增加及腦水腫[9]。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP-4)是腦內(nèi)最主要的一種調(diào)節(jié)水平衡的通道蛋白，可介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運，與腦內(nèi)水液平衡的維持、滲透壓調(diào)節(jié)、腦水腫形成等生理、病理過程密切相關(guān)，NF-κB信號通路在AQP-4基因表達調(diào)控過程中起著重要作用[10-11]。

本研究擬在試驗條件下研究ASFV Ⅱ型 Pig/HLJ/18 毒株引起的急性腦損傷，并通過檢測炎性因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)、NF-κB、MMP-9和AQP-4的表達探討NF-κB介導(dǎo)腦水腫的形成機制，以期為非洲豬瘟的防控和進一步的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及毒株

18頭60日齡體重約20 kg的健康長白豬購自北京六馬科技股份有限公司，檢疫證號為1100365616。ASFV Ⅱ型毒株P(guān)ig/HLJ/18由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2 主要試劑

兔抗人TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB p65、MMP-9和AQP-4單克隆抗體均購自Affinity Biosciences公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物工程有限公司；檸檬酸鈉緩沖液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 動物試驗

18頭長白豬隨機分為2組，攻毒組(13頭)和對照組(5頭)。攻毒組經(jīng)肌內(nèi)注射接種劑量為102HAD50/mL(HAD50:半數(shù)紅細胞吸附量)的ASFV毒株P(guān)ig/HLJ/18，對照組接種等體積生理鹽水，自由采食和飲水。攻毒后第6天采集血清，滅活，實時熒光定量PCR方法檢測血清ASFV核酸。試驗期為15 d，試驗期間，對死亡豬進行腦部剖檢和腦組織取材，第15天將試驗豬全部處死，剖檢取材，放入中性福爾馬林中固定保存。

參照鄧樺等[12]方法在中國動物疫病預(yù)防控制中心動物生物安全三級實驗室進行動物試驗。

1.4 原位PCR檢測

采用原位PCR技術(shù)對腦組織中ASFV VP73蛋白進行定位，根據(jù)ASFV VP73蛋白序列(GenBank 登錄號：S89966)設(shè)計1對引物，引物序列為F：5′-ATGGCATCAGGAGGAGC-3′；R：5′-CTGGGGAATACCAAAGGT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

常規(guī)石蠟切片，脫蠟復(fù)水，蛋白酶K 37 ℃消化20 min，95 ℃孵育2 min后滅活蛋白酶，用洗液洗滌2次，每次5 min。按原位PCR試劑盒(Digoxin)說明書要求，對組織中DNA進行變性、雜交與擴增液的滴加，PCR儀中進行擴增。擴增結(jié)束后，浸入洗液中洗滌并用預(yù)冷的100%乙醇進行固定。最后將Anti-Digoxin-Cy3與1% BSA按1∶100比例稀釋，滴加于標(biāo)本上，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次后滴加DAPI Antifade Solution，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 腦組織病理學(xué)觀察

對固定的腦組織進行修整，大小為1.5 cm×1.5 cm×2 cm，自來水沖洗、梯度酒精脫水、浸蠟、包埋，連續(xù)切片(5 μm)，HE染色、甲苯胺藍染色后分析腦組織的病理變化。

1.6 腦組織中炎性因子、NF-κB、MMP-9及AQP-4的檢測

通過免疫組織化學(xué)染色法對腦組織中TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9及AQP-4進行檢測。常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，用檸檬酸鈉緩沖液煮沸修復(fù)，恢復(fù)室溫后用0.3% H2O2封閉，將TNF-α抗體(1∶500)滴在切片上，于37 ℃孵育2 h。PBS沖洗后滴加二抗，孵育2 h后用PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，酒精梯度脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片。IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9和AQP-4分別按照以上步驟操作，抗體濃度分別為1∶100、1∶250、1∶500、1∶250和1∶500。每張切片選取6個視野，運用Image J 1.0圖像分析軟件測定各因子陽性細胞表達率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀與腦部剖檢病變

攻毒后第6天攻毒組所有試驗豬ASFV血清核酸檢測均為陽性，說明非洲豬瘟病例復(fù)制成功。發(fā)病豬臨床癥狀最初表現(xiàn)為體溫升高、食欲減退、皮膚潮紅，之后食欲廢絕、目光呆滯、皮膚可見出血點、衄血或便血，至攻毒后第15天全部死亡，病死豬主要表現(xiàn)為血凝不良、溶血及尸僵不全。死亡豬各組織器官均出現(xiàn)不同程度的病變，包括水腫、出血、梗死和彌散性血管內(nèi)凝血等，病理變化以血液循環(huán)障礙尤為突出。 試驗期間攻毒組9頭豬(9/13，69.23%)表現(xiàn)出抽搐、癱瘓、震顫等神經(jīng)癥狀。攻毒后第6天攻毒組開始出現(xiàn)死亡，早期死亡豬腦部剖檢可見腦膜可視血管數(shù)量增多、腦體積增大、腦膜略緊張(圖1A)；中期死亡豬腦部剖檢可見腦膜血管樹枝狀充血、腦溝變淺、腦回扁平(圖1B)；晚期死亡豬剖檢可見腦部蒼白濕潤、有散在點狀出血灶(圖1C)。腦部剖檢病變在早中晚期較為一致，主要表現(xiàn)為腦膜充血和腦實質(zhì)水腫。

2.2 原位PCR檢測病毒定位

采用原位PCR技術(shù)對腦組織中ASFV VP73結(jié)構(gòu)蛋白進行定位檢測，細胞核用DAPI進行染色，呈藍色；病毒用Cy3進行標(biāo)記，呈紅色(圖2)。可見ASFV主要位于腦部微血管的細胞中。

①A～C,分別為試驗早期、中期和晚期。②a，水腫；b，樹枝狀充血；c，點狀出血①A-C,Early,middle and late stage of the trial respectively.②a，Edema；b，Dendritic hyperemia；c，Spot hemorrhage圖1 腦部剖檢病變Fig.1 Brain autopsy lesions

圖2 ASFV原位PCR檢測結(jié)果Fig.2 Results of in situ PCR detection of ASFV

2.3 腦部病理組織學(xué)觀察

2.3.1 HE染色觀察 病變早期主要為腦水腫，可見腦皮質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)疏松、血管周圍間隙增寬、神經(jīng)元腫脹變圓、染色變淡；中后期死亡豬腦組織除了表現(xiàn)腦水腫的特征外，還觀察到腦血管充血及大量微血栓形成；此外，攻毒組腦組織還可見血管周圍淋巴細胞浸潤，形成圍管性血管套；膠質(zhì)細胞增生聚集成團，位于血管旁形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)；多個小膠質(zhì)細胞圍繞病變的神經(jīng)元周圍形成衛(wèi)星現(xiàn)象，以及壞死的神經(jīng)元被增生的小膠質(zhì)細胞或巨噬細胞吞噬形成的噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象(圖3A～3C)。對照組神經(jīng)元大小正常，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，未見異常形態(tài)細胞，神經(jīng)元細胞軸突走向基本一致(圖3D)。

2.3.2 甲苯胺藍染色觀察 甲苯胺藍染色結(jié)果顯示，攻毒組腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元尼氏小體溶解或消失、數(shù)量減少，與對照組相比，染色變淡(圖4)。

①A～C，攻毒組；D，對照組。②a，血管間隙增寬；b，神經(jīng)元腫脹；c，血栓；d，血管套；e，膠質(zhì)結(jié)節(jié)①A-C，Challenge group；D，Control group.②a，Vascular gap widening；b，Swelling of neurons；c，Thrombus；d，Vascular sheath；e，Glial nodule圖3 腦組織HE染色觀察結(jié)果(400×)Fig.3 HE staining results of brain tissues (400×)

A,攻毒組；B，對照組A，Challenge group；B，Control group圖4 腦組織甲苯胺藍染色觀察結(jié)果(400×)Fig.4 Results of toluidine blue staining in brain tissues (400×)

2.4 腦組織中炎性因子、NF-κB、MMP-9和AQP-4的表達

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，攻毒組炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ主要在神經(jīng)元和浸潤的炎癥細胞的胞漿及胞膜上呈黃色或者棕褐色表達(圖5A～5C)，NF-κB的棕褐色顆粒主要分布在神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞的細胞漿和細胞核(圖5D)，MMP-9的陽性細胞呈棕黃色，主要為神經(jīng)細胞及血管內(nèi)皮細胞，著色部位主要為細胞漿(圖5E)，AQP-4主要在微血管周圍的星形膠質(zhì)細胞上表達，呈明顯極性現(xiàn)象(圖5F)。與攻毒組相比，對照組TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB和MMP-9僅見少量神經(jīng)細胞淺黃色著色(圖5A′～5E′)，而AQP-4主要表達于鄰近毛細血管壁的星形膠質(zhì)細胞足突上和腦室周圍的室管膜細胞，沿細胞膜呈棕色條帶狀染色(圖5F′)。

通過 ImageJ 軟件對免疫組化切片進行統(tǒng)計分析，攻毒組腦組織上述6種蛋白的陽性表達率均極顯著高于對照組(P<0.01)(圖6)。

A～F，分別為攻毒組TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9和AQP-4免疫組化結(jié)果；A′～F′，分別為對照組TNF-α、IL-1β、IFN-γ、NF-κB、MMP-9和AQP-4免疫組化結(jié)果A-F，Immunohistochemical results of TNF-α,IL-1β,IFN-γ,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in challenge group,respectively；A′-F′，Immunohistochemical results of TNF-α,IL-1β,IFN-γ,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in control group,respectively圖5 腦組織中炎性因子、NF-κB、MMP-9和AQP-4的表達(400×)Fig.5 Expression of inflammatory factors,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in brain tissues (400×)

與對照組相比，**，差異極顯著(P<0.01)Compared with control group,**，Extremely significant difference (P<0.01)圖6 腦組織中炎性因子、NF-κB、MMP-9和AQP-4的陽性細胞表達率Fig.6 Positive cell expression rate of inflammatory factor,NF-κB,MMP-9 and AQP-4 in brain tissues

3 討 論

本試驗中豬被ASFV感染后表現(xiàn)非洲豬瘟典型臨床癥狀，病死豬表現(xiàn)敗血癥典型特征，病理變化以出血性病變?yōu)橹鳎貉h(huán)障礙與炎癥反應(yīng)貫穿病程始終，也是引起感染豬死亡的主要原因。攻毒組臨床表現(xiàn)有神經(jīng)癥狀，腦部病變主要為腦實質(zhì)水腫和腦膜血管充血出血，這與Karalyan等[5]對非洲豬瘟急性期腦的病理形態(tài)觀察結(jié)果基本一致。病變可見神經(jīng)細胞腫脹淡染，尼氏小體溶解消失，衛(wèi)星現(xiàn)象與噬神經(jīng)元現(xiàn)象，血管周圍間隙增寬，多量微血栓形成，血管周圍淋巴細胞浸潤等，表明ASFV能造成腦血管與神經(jīng)元的損傷。ASFVVP73基因編碼的VP73蛋白是ASFV的主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，可作為標(biāo)識物檢測ASFV的存在[13]。原位PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，病毒主要在血管內(nèi)皮細胞及巨噬細胞中表達，在膠質(zhì)細胞上也有少量分布，表明病毒可進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，感染血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及膠質(zhì)細胞。有報道顯示，血管內(nèi)皮細胞在該病的出血性發(fā)病機制中起著中心作用，病毒對血管內(nèi)皮細胞的感染能導(dǎo)致內(nèi)皮細胞緊密連接的喪失，引起腦水腫[14]。 本研究也發(fā)現(xiàn)病毒存在于腦血管內(nèi)皮細胞中，提示ASFV感染內(nèi)皮細胞與腦損傷的形成密切相關(guān)。

有研究表明，ASFV所致的多數(shù)損傷可歸因于細胞因子介導(dǎo)的相互作用[15]。 腦組織中，炎性因子主要來源于被激活的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞，TNF-α、IL-1β和IFN-γ屬于重要的炎性因子，病理狀態(tài)下的大量釋放可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，引起腦水腫[16-17]。NF-κB是一種能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB信號通路被TNF-α和IL-1β激活后，胞質(zhì)內(nèi)的NF-κB復(fù)合物易位進入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達[6,18]。MMP-9是明膠酶的一種，正常狀態(tài)下在腦組織中呈低水平表達，過度表達時，可降解腦血管內(nèi)皮細胞基底膜的主要成分，使血腦屏障通透性增加，引發(fā)并加重腦水腫；AQP-4是腦內(nèi)最重要的水通道蛋白，也是血腦屏障的重要組成，血腦屏障的破壞程度與AQP-4的表達上調(diào)密切相關(guān)，NF-κB可參與MMP-9和AQP-4表達水平的上調(diào)[19-20]。本試驗免疫組化結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IFN-γ呈高表達，且與對照組相比呈顯著性差異，而NF-κB、MMP-9與AQP-4的陽性細胞表達率較對照組極顯著增高，該結(jié)果說明ASFV所致腦水腫的發(fā)生發(fā)展與TNF-α、IL-1β、IFN-γ的異常高表達及NF-κB、MMP-9與AQP-4的增加有關(guān)。ASFV感染腦部后，促使炎性因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的產(chǎn)生與釋放增加，并激活NF-κB信號通路，活化的NF-κB調(diào)節(jié)MMP-9與AQP-4基因的轉(zhuǎn)錄與表達，促使MMP-9與AQP-4表達量的增加，從而破壞血腦屏障的完整性，促進腦水腫的發(fā)生發(fā)展。此外，活化的NF-κB還可通過誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β的過度或持續(xù)表達啟動炎性級聯(lián)反應(yīng)，造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)，加重腦水腫。

4 結(jié) 論

ASFV所致腦損傷為腦膜血管充血出血、腦實質(zhì)水腫，組織學(xué)病變顯示病毒性腦炎。ASFV感染腦部，促使炎性因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ大量釋放，并通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)AQP-4和MMP-9的表達，誘導(dǎo)炎性因子的過度表達，引發(fā)并加重腦水腫。