孫慶帥，嚴(yán)偉東，李 暢，吳 昊，李長春，何啟蓋

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4.武漢科前生物股份有限公司，武漢 430072)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的一種DNA病毒，病毒顆粒直徑約為17 nm[1]，目前主要存在4種基因型，包括非致病性的PCV1、致病性的PCV2和PCV3[2]及2020年Zhang等[3]在湖南省發(fā)現(xiàn)的PCV4。當(dāng)前影響生豬養(yǎng)殖的主要為PCV2，且PCV2通常會伴隨豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、豬細小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)混合感染[4]。PCV2感染可導(dǎo)致保育期仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)，還可引起豬的呼吸道疾病綜合征及生長緩慢[5]。 PCV3是一種與PDNS樣臨床疾病、繁殖障礙和多系統(tǒng)炎癥相關(guān)的病原體[6-7]。 PCV3是具有2 000個核苷酸的環(huán)狀基因組，主要包含3個開放閱讀框(ORF)[8]，編碼復(fù)制酶和衣殼蛋白的2個ORFs與蝙蝠圓環(huán)病毒蛋白的相似性分別為55%和35%，與PCV1和PCV2的相似性為31%～48%，表明PCV3與之前報道的圓環(huán)病毒不同[9]。

國內(nèi)外均有仔豬感染PCV3導(dǎo)致體重減輕、消瘦[10-14]的報道，對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，但目前對仔豬感染PCV3后出現(xiàn)消瘦、體重減輕是否與生長相關(guān)激素以及生長相關(guān)功能基因變化有關(guān)的研究報道甚少。肝臟是機體重要的新陳代謝器官，對機體生長發(fā)育有著重要的調(diào)節(jié)作用；脾臟是機體重要的免疫器官，具有過濾血、造血以及儲血的功能，其正常發(fā)育、成熟才能使動物發(fā)揮相應(yīng)的生理功能，對維持仔豬健康具有重要作用。本試驗對仔豬人工感染PCV3后不同時間點血清中三碘甲狀腺源氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)水平，以及肝臟、脾臟、背最長肌、腿肌中生長激素受體(GHR)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)等生長相關(guān)功能基因進行檢測，探究仔豬感染PCV3后生長相關(guān)激素及生長相關(guān)功能基因的變化，以期為進一步研究仔豬感染PCV3后導(dǎo)致體重減輕、消瘦的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和試驗仔豬 PCV3由武漢科前生物公司分離并保存，第15代PCV3-HK株(109拷貝/mL，GenBank登錄號：MW767462)；8頭試驗仔豬均購自于湖北金林原種畜牧有限公司，體重均在6.93 kg左右，無PCV2、PCV3、豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)病原感染。

1.1.2 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；豬T3、T4試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；NucleoZOL購自MACHEREY-NAGEL公司；RNA反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司；SYBR Green Master Mix購自武漢Yeasen公司；DMEM購自Gibco公司。熒光定量PCR儀(CFX96TM)購自Bio-Rad公司；超微量分光光度計(NanoDrop 2000c)購自ThermoFisher Scientific公司；多功能酶標(biāo)儀購自Tecan公司；離心機購自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將8頭仔豬隨機均分為2組:PCV3感染組(感染組)、DMEM組，各組之間相互隔離，仔豬自由采食。病毒液、DMEM均從頸部肌肉兩側(cè)注射1 mL。

1.2.2 仔豬體重及平均日增重測定 于攻毒前0 d(攻毒之前)及攻毒后3、7、14、21 d分別稱重，試驗結(jié)束后計算各組仔豬平均日增重。

1.2.3 探針/引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank上PCV3基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCV3-Probe探針和PCV3基因引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。根據(jù)GenBank中GHR、IGF-1、IGF-1R基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有引物的具體信息見表1。

表1 引物和探針信息

1.2.4 仔豬病毒載量測定 采集仔豬的口腔拭子、鼻腔拭子、肛門拭子及血液，分離出血清后分為2份,于-80 ℃保存，1份用于檢測病毒載量，1份用于T3、T4檢測。按照核酸提取試劑盒說明書提取口腔拭子、鼻腔拭子、肛門拭子等樣品的DNA，按照李暢等[15]所建立的PCV3熒光定量方法檢測病毒載量。

1.2.5 血清T3、T4濃度的檢測 按照試劑盒說明書處理0、3、7、14、21 d所采集的血清，用酶標(biāo)儀檢測D450 nm值，并計算T3、T4的濃度。

1.2.6 組織中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表達量 感染病毒后第21天剖檢仔豬，采集背最長肌、腿肌、脾臟、肝臟等組織，按照NucleoZOL說明書提取組織樣品總RNA，取2 μL總RNA用超微量分光光度計測定濃度，檢驗RNA質(zhì)量，并將RNA濃度控制加樣量在1 000 ng。以GAPDH為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR。 PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

生長相關(guān)功能基因的mRNA相對表達量用2-△△Ct法進行計算，用IBM SPSS Statistics 21.0軟件獨立樣本t檢驗進行差異分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 仔豬體重及平均日增重

試驗期間，PCV3感染組仔豬眼觀可見消瘦、被毛粗亂。2組仔豬初始體重差異不顯著(P>0.05)，感染組仔豬終末體重、平均日增重均極顯著低于DMEM組仔豬(P<0.01，表2)。

表2 各組仔豬體重及平均日增重

2.2 仔豬的病毒載量

各樣品的病毒載量檢測結(jié)果顯示，DMEM組未檢測到PCV3，PCV3感染組仔豬口腔拭子、鼻腔拭子、肛門拭子和血清的病毒載量在攻毒后第3天均可以檢測到，并在第14天達到最高，第14～21天快速下降(圖1)。

圖1 口腔(A)、鼻腔(B)、肛門(C)拭子以及血清(D)中病毒載量Fig.1 Viral load in oral (A),nasal (B),anal (C) swabs and serum (D)

2.3 血清中T3、T4濃度

PCV3感染前后不同時間段血清中T3、T4表達水平測定結(jié)果顯示，感染后第14和21天感染組仔豬血清中T3表達量極顯著高于DMEM組(P<0.01)，在感染的第3和7天差異不顯著(P>0.05)；2組之間T4表達量在感染后所有時間差異均不顯著(P>0.05)(圖2)。

2.4 各組織中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表達量

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，PCV3感染組背最長肌中IGF-1的mRNA相對表達量極顯著低于DMEM組(P<0.01)，2組間GHR和IGF-1R基因的相對表達量差異不顯著(P>0.05)；2組的腿肌和脾臟中GHR、IGF-1、IGF-1R基因的相對表達量均無顯著差異(P>0.05)；PCV3感染組肝臟中GHR基因mRNA相對表達量極顯著高于DMEM組(P<0.01)，IGF-1R基因mRNA相對表達量顯著高于DMEM組(P<0.05)，2組之間IGF-1基因mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference(P<0.05)；**，Extremely significant difference(P<0.01)；No *,No significant difference(P>0.05).The same as below圖2 各組血清中T3(A)、T4(B)濃度Fig.2 Concentration of T3(A) and T4(B) of serum in each group

A～D，分別代表背最長肌、腿肌、脾臟和肝臟A-D，Back muscle,leg muscle,spleen and liver,respevtively圖3 各組不同組織中生長相關(guān)功能基因mRNA相對表達量Fig.3 mRNA relative expression of growth-related functional genes of different tissues in each group

3 討 論

目前針對PCV3的研究主要集中在病毒分子特征、跨物種傳播、流行病學(xué)調(diào)查、發(fā)病機理、檢測技術(shù)等方面[16]，對仔豬感染PCV3后導(dǎo)致的體重減輕、消瘦研究較少。本研究中，PCV3感染組注射病毒液后第3、7、14、21天的口腔拭子、鼻腔拭子、肛拭子以及血清中均可檢測到PCV3，且病毒載量均在第14天達到最高；PCV3感染組仔豬在飼養(yǎng)階段可發(fā)現(xiàn)消瘦、被毛粗亂，且PCV3感染組仔豬末重與平均日增重均極顯著低于DMEM組。而在汪孟航[17]用PCV3-DB-1毒株進行的3周齡仔豬攻毒試驗中，仔豬在感染后的第14天才在血清中檢測到PCV3，并在第28天時病毒載量達到最高，各組仔豬表現(xiàn)無異常情況，體重差異不顯著；Hou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PCV3感染改變了腸道微生物群的多樣性和組成，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的體重減輕和炎癥反應(yīng)；Jiang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬感染PCV3后也導(dǎo)致明顯的體重減輕。本研究與汪孟航[17]的研究結(jié)果有一定差異，但與Hou等[18]、Jiang等[19]研究結(jié)果PCV3感染可造成仔豬體重減輕、消瘦的情況相同，原因可能是毒株的致病力以及試驗的溫度、濕度等不同而造成的。

甲狀腺功能亢進是一種甲狀腺合成和分泌過量甲狀腺激素造成的疾病，會引起T4或T3升高或兩者都升高[20]，通常的癥狀是心悸、疲勞、體重減輕、四肢震顫和體重減輕[21-23]。甲狀腺激素幾乎作用于所有有核細胞，對生長、神經(jīng)元發(fā)育、生殖和能量代謝的調(diào)節(jié)至關(guān)重要[24-25]，能夠促進機體能量吸收和糖原分解，是維持機體正常代謝的重要激素。本研究發(fā)現(xiàn)，仔豬感染PCV3后在排毒量達到最高的第14天后，T3含量極顯著上升，T4含量無顯著變化，表明PCV3感染會引起仔豬甲狀腺機能亢進，導(dǎo)致體內(nèi)代謝加快。

GHR屬于第1類生長因子受體家族蛋白，作為細胞膜中構(gòu)成型二聚體存在，介導(dǎo)生長激素發(fā)揮作用，是生長激素(GH)的受體，GHR結(jié)合GH后，對機體發(fā)揮廣泛的作用，包括促進生長、細胞分裂和細胞再生方面，并影響碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝[26]。IGF-1是一種具有類似于胰島素原氨基酸序列的類胰島素肽，被認為是GH作用的主要中介物。 IGF-1R具有抗凋亡和促進有絲分裂的功能[27]，其基因表達的調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[28]。也有研究提出，GHR、IGF-1、IGF-1R的過量可能導(dǎo)致過度增長、肥大以及代謝異常，導(dǎo)致如肢端肥大癥、癌癥等[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，仔豬感染PCV3后，肝臟中的GHR mRNA相對表達量極顯著高于對照組，IGF-1R的mRNA相對表達量顯著高于對照組，表明PCV3可造成肝臟代謝異常，而背最長肌中IGF-1表達量顯著降低，表明仔豬感染PCV3后可使背最長肌中IGF-1表達量降低，影響背最長肌發(fā)育。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，PCV3感染仔豬后可導(dǎo)致平均日增重降低、機體消瘦，血清T3的表達量升高，肝臟中GHR、IGF-1R mRNA相對表達量升高，背最長肌中IGF-1 mRNA相對表達量降低。說明仔豬感染PCV3后，甲狀腺機能亢進，導(dǎo)致體內(nèi)代謝加快，造成機體對碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等的分解代謝加快，降低GH對背最長肌的促生長、促細胞分裂作用，從而導(dǎo)致仔豬消瘦。