謝梓民，曾繁聰，傅禹銘，姜含雨，楊惠湖，柯駿鴻，羅 瑞，梁昭平，張雪蓮，黃淑堅

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225；2.廣州華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣州 510000)

Ⅰ亞群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)感染后可引起患病動物包涵體肝炎[1-2]，主要對雛雞、鴨、鵝等家禽易感，可通過消化道、呼吸道與直接接觸進行傳播，但以泄殖腔排毒傳播為主[3]。自2015年以來，Ⅰ亞群FAdV的感染率逐漸上升，給中國養(yǎng)禽業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失，其中在雞群中主要流行的血清型為4、8a/b和11型[4-6]。雞群在感染后主要表現(xiàn)為心包積液-包涵體肝炎綜合征[7-8]。同時，禽腺病毒病也是一種免疫抑制性疾病，除了自發(fā)癥狀以外，常常引起其他病原微生物的繼發(fā)感染導(dǎo)致家禽死亡[9-10]，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的影響。

FAdV是一種無囊膜的雙股DNA病毒，根據(jù)病毒基因結(jié)構(gòu)與序列長短，可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亞群[11]。其中Ⅰ亞群FAdV又可劃分為5個種，共有12個血清型，分別為A(1型)、B(5型)、C(4、10型)、D(2、3、9、11型)、E(6、7、8a、8b型)[11-12]。而Ⅱ與Ⅲ亞群FAdV分別僅有1個血清型[13-14]。目前，Ⅰ亞群FAdV的血清型眾多，但其致病機理尚不明確，關(guān)于其致病力的研究也存在許多爭議[15]。據(jù)報道，存在Fiber2基因的FAdV感染力和繁殖力更強[16-17]，而在Ⅰ亞群中僅A和C種FAdV存在Fiber2基因。本試驗通過探究4株分離株對SPF雛雞的致病性，揭示FAdV的病理特點及不同血清型之間致病力的差異性，以期為探索FAdV的致病機理和完善其相關(guān)的防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Ⅰ亞群FAdV分離株GDDL-4(FAdV-4)、GDB3-8a(FAdV-8a)、GDT08-8b(FAdV-8b)、GDWYT-11(FAdV-11)均由廣州華南農(nóng)大生物藥品有限公司實驗室保存；核酸自動抽提試劑盒購自西安天隆科技有限公司；FAdV-Ⅰ抗體檢測試劑盒購自Biochek公司。

1.2 試驗動物分組與處理

100只10日齡SPF雛雞由Boehringer-Ingelheim公司提供。將雛雞隨機分成5組，每組20只。4個攻毒組每組每只雞經(jīng)腿部肌肉分別接種0.2 mL 105TCID50的GDDL-4(FAdV-4)、GDB3-8a(FAdV-8a)、GDT08-8b(FAdV-8b)及GDWYT-11(FAdV-11)；對照組按相同方法接種0.2 mL PBS。 接種后，連續(xù)觀察30 d，記錄臨床癥狀及死亡數(shù)量。

接種后，每周各組采集5只雛雞血樣進行抗體效價分析，抗體檢測按照說明書進行。4周后采集完整的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、十二指腸帶胰腺進行稱重(mg)，計算各器官指數(shù)，并進行分析。公式如下：

器官指數(shù)=器官重量(mg)/體重(g)

1.3 抗體及排毒量分析

攻毒后每周采血并進行抗體檢測，每隔5 d對攻毒組和對照組各采集一次肛拭子進行排毒量分析。將采集的肛拭子加入1 mL PBS，反復(fù)凍融3次后抽提核酸。分別設(shè)計擴增4株分離株Fiber基因的引物，構(gòu)建標準品質(zhì)粒，建立標準曲線。按照Power Up SYBR Green說明書和LightCycler96熒光定量PCR儀的要求進行操作，反應(yīng)條件為：95 ℃ 15 s；56 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。

1.4 組織病理學(xué)觀察

取適量肝臟、腎臟、法氏囊組織塊，使用4%多聚甲醛固定組織塊，24 h后按常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后進行組織病理學(xué)觀察。

1.5 各組織病毒載量分析

各取0.1 g心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸進行組織研磨，使用自動抽提試劑盒提取核酸，并對各個組織器官進行定量檢測，利用實驗室建立的標準曲線計算各組織病毒拷貝數(shù)。利用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以確認病毒在組織中的分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀與剖檢結(jié)果

攻毒3 d后，攻毒組雞采食量減少、羽毛粗亂、精神萎靡，其中GDDL-4攻毒組雛雞癥狀較為明顯，可見拉黃綠稀糞癥狀，第15天開始，攻毒組雛雞均出現(xiàn)扎堆怕冷的臨床癥狀；對照組雞30 d內(nèi)均未見明顯的臨床癥狀。GDDL-4組攻毒4 d后死亡17只，存活3只，存活率為15%；GDB3-8a組攻毒6 d后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，存活7只，存活率為35%； GDT08-8b組未出現(xiàn)死亡； GDWYT-11組攻毒5 d后零星死亡， 存活13只， 存活率為65%(圖1)。

剖檢結(jié)果顯示，攻毒組雛雞均出現(xiàn)嚴重的心包積液；GDDL-4、GDB3-8a、GDWYT-11攻毒組雛雞肝臟出現(xiàn)嚴重的刷狀出血,部分雛雞出現(xiàn)肺臟、脾臟、腎臟、十二指腸、腺胃出血，以及法氏囊腫大的病理變化；GDT08-8b攻毒組病理變化不明顯，癥狀較輕，具體剖檢病變結(jié)果見圖2。 統(tǒng)計結(jié)果顯示，病理變化最嚴重為心包積液/膠凍樣滲出，比例為88.75%(71/80)，其次為肝臟刷狀出血，比例為61.25%(49/80)；其中GDDL-4攻毒組病變數(shù)最多(表1)。

圖1 感染雛雞存活率曲線Fig.1 Survival rate curve of infected chicks

A,GDDL-4組心包積液；B,GDDL-4組肝臟刷狀出血；C,GDB3-8a組心包積液；D,GDB3-8a組肝臟出血；E,GDB3-8a組腺胃出血；F,GDT08-8b組心包積液；G,GDT08-8b組肺臟出血；H,GDWYT-11組少量心包積液；I,GDWYT-11組肝臟出血A,Hydropericardium in GDDL-4 group;B,Liver hemorrhage in GDDL-4 group;C,Hydropericardium in GDB3-8a group;D,Liver hemorrhage in GDB3-8a group;E,Glandular stomach hemorrhage in GDB3-8a group;F,Hydropericardium in GDT08-8b group;G,Lung congestion in GDT08-8b group;H,Hydropericardium in GDWYT-11 group;I,Liver hemorrhage in GDWYT-11 group圖2 FAdV攻毒后雛雞病理變化Fig.2 Pathological changes of chicks after challenged with FAdV

表1 病理變化統(tǒng)計

2.2 抗體分析

攻毒后每周采血并進行抗體檢測，結(jié)果顯示，所有攻毒組血清抗體均在14 d時轉(zhuǎn)為陽性(S/P值≥0.500，效價范圍≥1 071，抗體判定為陽性)，在21 d時抗體滴度達到最高。

2.3 排毒分析

由圖3可知，各攻毒組在接種5 d后的病毒拷貝數(shù)僅為1.0×102～1.0×103拷貝/μL，含毒量較少；在10 d時，GDDL-4與GDB3-8a組的排毒量提高，于20 d時達到最高峰，最高排毒量分別為1.3×106、6.1×105拷貝/μL；GDT08-8b與GDWYT-11組雛雞排毒量較少，范圍均在2.0×102～5.0×103拷貝/μL。GDDL-4與GDB3-8a組排毒量遠遠高于GDT08-8b與GDWYT-11組。

2.4 器官指數(shù)

由表2可知，GDDL-4、GDB3-8a及GDWYT-11組的心臟、肝臟、肺臟及腎臟指數(shù)均極顯著大于對照組(P<0.01)，GDT08-8b組各器官指數(shù)與對照組無明顯差異(P>0.05)；GDDL-4和GDB3-8a組的脾臟指數(shù)極顯著大于對照組(P<0.01)， GDWYT-11組

脾臟指數(shù)顯著大于對照組(P<0.05)；除GDDL-4組法氏囊指數(shù)極顯著小于對照組外(P<0.01)，其余組與對照組間均無明顯差異(P>0.05)。

圖3 FAdV攻毒組排毒分析Fig.3 Analysis of detoxification in FAdV challenge groups

表2 器官指數(shù)統(tǒng)計學(xué)分析(n=5)

2.5 組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)切片觀察結(jié)果顯示，GDDL-4組：肝臟出現(xiàn)嚴重的包涵體肝炎，肝細胞間隙變大，有大量淋巴細胞浸潤，肝索間隙有紅細胞浸潤，部分肝細胞變性壞死；腎間質(zhì)出血充血、腎小球萎縮退化，腎小管邊緣不整齊，腎小管上皮細胞脫落壞死；法氏囊淋巴細胞壞死。GDB3-8a組：肝細胞間隙出血、有大量淋巴細胞浸潤，出現(xiàn)包涵體肝炎；腎間質(zhì)出血、腎間質(zhì)有少量淋巴細胞；法氏囊淋巴細胞變性壞死。GDT08-8b組：肝細胞出現(xiàn)少量包涵體肝炎；腎間質(zhì)出血；其余無明顯變化。GDWYT-11組：肝細胞間質(zhì)出血、有包涵體肝炎出現(xiàn)；腎間質(zhì)增大、出血、腎小球萎縮變?。环ㄊ夏伊馨图毎麎乃?。詳細病理切片圖見圖4～6。

2.6 病毒載量分析

由圖7可知，F(xiàn)AdV在雛雞各個組織器官中廣泛存在，GDDL-4與GDWYT-11組在肝臟中病毒滴度最高，可達1010～1011拷貝/mg；GDB3-8a與GDT08-8b組在十二指腸中病毒滴度最高，可達109～1010拷貝/mg。

A～D,GDDL-4、GDB3-8a、GDT08-8b、GDWYT-11組包涵體肝炎；E,對照組A-D,Inclusion body hepatitis in GDDL-4，GDB3-8a，GDT08-8b and GDWYT-11 groups，respectively;E,Control group圖4 肝臟組織病理學(xué)觀察(400×)Fig.4 Histopathological observation of liver (400×)

A,GDDL-4組腎臟出血；B,GDB3-8a組腎間質(zhì)出血/充血；C,GDT08-8b組腎臟充血；D,GDWYT-11組腎間質(zhì)出血；E,對照組A,Renal hemorrhage in GDDL-4 group;B,Renal interstitial hemorrhage and congestion in GDB3-8a group;C,Renal congestion in GDT08-8b group;D,Renal interstitial hemorrhage in GDWYT-11 group;E,Control group圖5 腎臟組織病理學(xué)觀察(400×)Fig.5 Histopathological observation of kidney (400×)

A、B、D,GDDL-4、GDB3-8a、GDWYT-11組淋巴細胞變性壞死；,組淋巴細胞變性壞死；C,GDT08-8b組少量淋巴細胞壞死；E,對照組A,B and D，Lymphocyte necrosis in GDDL-4，GDB3-8a and GDWYT-11 groups，respectively;C,A little of lymphocyte necrosis in GDT08-8b group;E,Control group圖6 法氏囊組織病理學(xué)觀察(400×)Fig.6 Histopathological observation of bursa of Fabricius tissue section (400×)

圖7 病毒載量分析Fig.7 Viral load analysis

3 討 論

近年來，國內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)FAdV的感染呈上升趨勢，其主要流行的血清型為FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11。其中，由FAdV-4引起的心包積液綜合征(hydropericardium syndrome，HPS)具有較高的致病率和死亡率，給養(yǎng)殖戶造成了不少的損失。本研究通過4株FAdV流行株對SPF雛雞致病力的影響，反映出4個血清型的病理特點及致病力的差異性。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了GDDL-4株能引起雛雞發(fā)生HPS以外，其他3株毒株也能引起雛雞發(fā)生不同程度的HPS，進一步證實了宋文平[18]和Sahindokuyucu等[19]的報道。說明FAdV在進化過程中可能發(fā)生了變異，也可能與不同地區(qū)毒株之間存在差異有關(guān)[20-21]。本研究采用肌內(nèi)注射途徑接種病毒[22]，從死亡率上看，除了GDT08-8b組無死亡外，GDDL-4、GDB3-8a和GDWYT-11組的死亡率分別為85%、65%和35%，與Chen等[23]、宋文平[18]和王娟[24]研究結(jié)果相比，F(xiàn)AdV致病性有了明顯的提升。

從剖檢結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，4株毒株主要侵害心臟與肝臟，表現(xiàn)為明顯的心包積液和肝臟刷狀出血。除此之外，GDB3-8a組還出現(xiàn)了明顯的腺胃出血，結(jié)合組織病毒載量分析可得出，GDB3-8a和GDT08-8b對宿主的消化道有明顯的偏嗜性，因此，腺胃是分離這2種血清型病毒的最佳組織器官[18]，F(xiàn)AdV-4和FAdV-11則應(yīng)考慮從肝臟組織中進行分離。同時，組織病毒載量結(jié)果也間接提示了4株分離株具有廣泛的組織嗜性，且各組織的病毒載量相對較高，造成這種現(xiàn)象的原因除了毒力差異外，可能與試驗動物的日齡及免疫系統(tǒng)的完善程度有關(guān)。組織學(xué)病理觀察結(jié)果表明，不同血清型的病變特征相似，各攻毒組均出現(xiàn)包涵體肝炎，部分腎臟間質(zhì)出血，部分法氏囊淋巴細胞壞死，單從臨床癥狀和組織學(xué)病變上很難對這4種毒株進行診斷。另外，臨床上也存在混合感染和基因重組導(dǎo)致的變異毒株[25]，這也說明面對當(dāng)前復(fù)雜的臨床環(huán)境，除了做好日常的飼養(yǎng)管理以外，還需要通過實驗室檢測手段定期監(jiān)測養(yǎng)殖場中FAdV的流行情況，從而選擇合適的疫苗進行預(yù)防。從器官指數(shù)分析結(jié)果可以看出，各攻毒組與對照組大部分器官指數(shù)存在顯著差異(顯著升高或下降)，表明FAdV會阻礙機體器官正常發(fā)育，或?qū)е聶C體器官異常腫大，即便出現(xiàn)帶毒不發(fā)病的情況，家禽的品質(zhì)也會受到一定的影響。從排毒量分析可發(fā)現(xiàn)，GDDL-4和GDB3-8a組排毒量較大，GDT08-8b和GDWYT-11組排毒量較少，4組攻毒組接種后全程在排毒，存在泄殖腔排毒傳播的風(fēng)險。因此，除了及時淘汰發(fā)病雞外，還應(yīng)使用適當(dāng)比例(1∶1 000)稀釋的甲醛溶液對飼養(yǎng)環(huán)境進行消毒[26]，從傳染源途徑切斷病原的傳播。

簡而言之，對于毒力增強的流行株，養(yǎng)禽業(yè)應(yīng)加以重視，除了做好日常的飼養(yǎng)管理之外，疫苗工作也不可懈怠。面對血清型眾多的FAdV，應(yīng)加快推進多價疫苗的研發(fā)工作，利用疫苗手段保護易感群體。本試驗對FAdV分離株進行致病性研究，可為后續(xù)從事相關(guān)疫苗研發(fā)和制定有效的防控措施提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗通過探究4株FAdV流行株對SPF雛雞的致病性，進一步了解了家禽在感染FAdV后的臨床癥狀、剖檢病變、組織病理學(xué)變化、排毒量及病毒載量等病理特征，4株分離株均可導(dǎo)致雛雞肝臟出現(xiàn)包涵體肝炎的病理變化，均可反復(fù)排毒，在肝臟和十二指腸中病毒載量最高。